專利名稱：一種酵母甘露糖蛋白產品的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種酵母甘露糖蛋白產品的制備方法。
背景技術：
甘露糖蛋白是由甘露糖聚合物共價連接在蛋白質骨架上構成的，位于酵母細胞 壁最外層，是組成酵母細胞壁的主要成分之一。酵母甘露糖蛋白分子量為20-200KD，是由 5%-20%的肽與80%-95%的甘露糖組成。甘露聚糖的主鏈是0-1，2-甘露聚糖，以0-糖 苷鍵或N-糖苷鍵連接到蛋白質或肽的絲氨酸、蘇氨酸或天門冬氨酸上。科學研究表明，甘露糖蛋白有利于葡萄酒的蛋白和酒石穩定，能夠減弱葡萄 酒中單寧的收斂性和尖刻感，提高酒的飽滿肥碩感。在法國勃艮第地區生產的霞多麗 (Chardonnay)干白葡萄酒，通常是在橡木桶中發酵，然后在酒泥上陳釀數月，并且在陳釀過 程中每周攪拌1-2次。研究表明，如果在第二年3月就將酒與酒泥分離，則發包方葡萄酒酒 石不穩定，但如果到第二年7月再將酒與酒泥分離，則酒的酒石穩定性非常好。直到近年才 從理論上將這一現象加以研究證實，用上述方法釀造的葡萄酒，通常含有豐富的細胞壁多 糖，其中主要是甘露糖蛋白。甘露糖蛋白應用到葡萄酒中主要有以下作用1)防止酒石酸鉀沉淀。2)與香氣的協作作用。3)促進蘋果酸-乳酸發酵。4)與多酚物質的協作作用，提高葡萄酒圓潤、柔順感，削弱單寧的收斂感。5)防止蛋白質渾濁。目前，酵母甘露糖蛋白的制備方法主要有兩種熱提取和酶提取。熱解用高溫處理pH為7的酵母緩沖溶液得到產品的方法，目前比較常見。Herlin 在1977年用活性干酵母按下述方法制備蒸餾水洗，用pH為7的緩沖液配成懸浮液，125°C 條件下，鍋內蒸煮90min (此過程操作兩次)，離心，用3倍體積的酒精將離心液沉淀，干燥， 得到甘露糖蛋白。酶解酶解多采用β-1，3葡聚糖酶去降解酵母細胞壁，得到酵母甘露糖蛋白產 品。Johanna Van Rinsum 等(Van RINSUM J, KLIS Fs Μ, Van Den ENDEH. Cell wallg lucomannoproteins of Saccharomy cescerevisiae [J]. Yeast, 1991 (7) :717-726)使用昆 布多糖酶分離酵母細胞壁中的甘露聚糖，用親和色譜和陰離子交換色譜進行純化，得到甘 露聚糖中N-乙酰基葡糖胺、甘露糖、葡萄糖的摩爾比為1 53 4。張玉香(張玉香，尹 卓容.甘露糖蛋白的提純及分子量測定[J].釀酒科技，2005(4) :72-74)用酶法從啤酒廢 酵母中提取的甘露糖蛋白，工藝流程為啤酒廢酵母一預處理一均質破壁一自溶一離心分 離一沉淀(細胞壁)一酶解一離心一上清濃縮一噴霧干燥一粉狀產品。產物中多糖含量為 60. 57%，蛋白含量 28. 1%。國外，US6139891披露了一種制備酵母甘露糖蛋白的方法，包括使用葡聚糖酶處 理細胞壁后膜分離得到酵母甘露糖蛋白。并驗證了其產品在葡萄酒中對酒石穩定的作用。W02006/121803A1披露了一種制備酵母甘露糖蛋白的方法，包括酵母自溶、蛋白酶處理細胞 壁和膜分離得到酵母甘露糖蛋白，并同時制備得到酵母葡聚糖。EP 1094117A1公開了制備一種甘露糖蛋白制品的方法，其包括將酵母細胞壁在 PH 6-7、98-100°C下熱解細胞壁15-30小時、離心分離收集上清液，上清液4°C下沉淀至少 M小時以除去膠體副產物，離心分離收集上清液，真空濃縮，噴霧干燥獲得上述制品。國內，CN 1940084A披露了一種制備酵母甘露糖蛋白的方法，包括酒泥酵母收集、 酶解、熱處理、酒精沉淀得到酵母甘露糖蛋白產品。熱處理提取酵母甘露糖蛋白會同時提取出大量的蛋白質，使后續處理困難，提取 得率下降(胡朝暉等，釀酒酵母甘露糖蛋白的研究進展[J].釀酒，34(4) :64-66)。酶處理 得到的酵母甘露糖蛋白中同樣會含有一定量的蛋白質，而且單純的酶處理由于細胞壁的結 構不夠疏松也同樣導致得率較低。此外，酵母甘露糖蛋白的分子量對于其在葡萄酒中發揮 作用具有重要意義，因此不經過膜分離的酵母甘露糖蛋白不僅會影響其效果，而且其中的 大量蛋白還會給葡萄酒帶來不好的影響。
發明內容
本發明的原料為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其它種屬酵母細胞壁， 此原料可以從市場購買或通過對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或其它種屬酵母 自溶分離得到。1)高溫、高pH處理酵母細胞壁將酵母細胞壁用稀鹽酸、硫酸、磷酸等無機酸調節 到pH = 7. 0-10. 0，加熱溫度至80-i;35°C進行處理；2)蛋白酶處理將步驟1)處理后的酵母細胞壁調節溫度為30_70°C，加入堿性蛋 白酶，進行處理，離心分離收集上清液；3)低溫沉淀將步驟2)所得上清液在儲存罐中采用冰水降溫到低溫0-20°C，并保 溫1-20小時，離心去除沉淀；4)膜分離將步驟3)所得上清液采用剪切分子量為200-400KD膜進行膜分離，優 選400KD，膜分離可采用包括有機膜、無機膜在內的各種管式、卷式膜分離裝置，然后收集透 過液，噴霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。優選地，所述步驟1)中可將酵母細胞壁加去離子水調節到質量百分濃度為 5% -15%。優選地，所述步驟1)中對酵母細胞壁處理時間可為0. 5-5小時。優選地，所述步驟2)中的堿性蛋白酶質量百分濃度可為0. 01-0. 5%。優選地，所述步驟2、中還可以包括將所述用堿性蛋白酶處理過的酵母細胞壁升 溫至90°C滅酶的步驟。優選地，所述步驟2)中的蛋白酶處理時間可以為2-15小時。優選地，所述步驟2)中離心分離可在離心力大于5000g的條件下進行。優選地，所述步驟幻中在低溫沉淀前，還可包括將所述上清液用多效濃縮設備真 空濃縮至質量百分濃度10-40%的步驟。
本發明的提取甘露糖蛋白的技術方案恰恰與現有技術的教導相反，即在酸性條件 下進行上清液低溫沉淀，而且本發明的膜分離目的是讓甘露糖蛋白通過，這與現有技術中 通過膜分離截留甘露糖蛋白技術相反。膜分離的透過液澄清度明顯的高于截留液。在截留 液中還含有大量的高分子量的蛋白質和其他的多糖，這對于產品應用于葡萄酒穩定的效果 帶來不利的影響。通過截留去除這些大分子的蛋白和多糖更有利于酵母甘露糖蛋白發揮穩 定葡萄酒中酒石和蛋白的作用。同時，本方法的熱解所需時間較現有技術短，也簡化了實驗 步驟，降低了實驗成本。另外，參數的選取及優選方案也經歷了多次試驗獲得。
具體實施例方式實施例1將市場購買的釀酒酵母細胞壁(富邦牌酵母細胞壁，安琪酵母股份有限公司)用 稀鹽酸調節到PH = 7. 0，加熱溫度至100°C放置5小時；調節酵母細胞壁溫度至50°C，加入質量百分濃度為0. 01%的堿性蛋白酶處理15 小時，離心分離收集上清液；將上清液在儲存罐中用冰水降溫至0°C保溫10小時，離心去除沉淀；將離心后的上清液采用剪切分子量為200KD的中空纖維膜進行膜分離，收集透過 液，噴霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。該產品為樣品1。實施例2將釀酒酵母自溶分離得到的酵母細胞壁，加去離子水調節至濃度為5%，用稀硫酸 調節PH = 10. 0，加熱溫度至80°C放置5小時；調節酵母細胞壁溫度至30°C，加入質量百分濃度為0. 5%的堿性蛋白酶處理8小 時，升溫到90°C滅酶后，離心分離收集上清液；將上清液用稀硫酸調節pH = 3. 0，用多效濃縮設備真空濃縮至30%，在儲存罐中 采用冰水降溫至20°C保溫1小時，離心去除沉淀；將離心后的上清液采用剪切分子量為200KD的陶瓷膜進行膜分離，收集透過液， 噴霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。該產品為樣品2。實施例3將釀酒酵母自溶分離得到的酵母細胞壁，加去離子水調節至濃度為15%，用稀磷 酸調節pH = 8. 0，加熱溫度至i:35°C放置0. 5小時；調節酵母細胞壁溫度至50°C，加入質量百分濃度為0. 2%的堿性蛋白酶處理2小 時，升溫到90°C滅酶后，在離心力等于5000克的條件下進行離心分離，收集上清液；用稀磷酸將上清液調節pH = 6. 0，利用多效濃縮設備真空濃縮至10%，在儲存罐 中采用冰水降溫至10°c保溫20小時，離心去除沉淀；將離心后的上清液采用剪切分子量為300KD的陶瓷膜進行膜分離利，收集透過 液，噴霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。該產品為樣品3。實施例4
將釀酒酵母自溶分離得到的酵母細胞壁，加去離子水調節至濃度為10%，用稀鹽 酸調節pH = 8. 0，加熱至溫度110°C放置3小時；調節酵母細胞壁溫度至50°C，加入質量百分濃度為0. 2%的堿性蛋白酶處理10小 時，升溫到90°C滅酶后，在離心力7000g的條件下進行離心分離，收集上清液；用稀鹽酸將上清液調節pH = 5. 0，利用多效濃縮設備真空濃縮至40%，在儲存罐 中采用冰水降溫至10°c保溫10小時，離心去除沉淀；將離心后的上清液采用剪切分子量為400KD的中空纖維膜進行膜分離，收集透過 液，噴霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。該產品為樣品4。所得樣品各成分質量百分含量以及分子量等數值列表如下
權利要求
1.一種酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其步驟包括1)將酵母細胞壁調節到PH= 7. 0-10. 0，溫度80-135°C進行處理；2)將步驟1)處理后的酵母細胞壁調節溫度為30-70°C，加入堿性蛋白酶，進行處理，離 心分離收集上清液；3)將步驟2)所得上清液低溫0-20°C保溫1-20小時，離心去除沉淀；4)將步驟幻所得上清液采用剪切分子量為200-400KD膜進行膜分離，收集透過液，噴 霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。
2.一種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟1) 中將酵母細胞壁調節到質量百分濃度為5% -15%。
3.—種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟1) 中對酵母細胞壁處理0. 5-5小時。
4.一種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟2) 中堿性蛋白酶的質量百分含量為0. 01-0. 5%。
5.一種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟2) 中所述蛋白酶處理時間為2-15小時。
6.一種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟2) 中還包括將所述用堿性蛋白酶處理過的酵母細胞壁升溫至90°C滅酶的步驟。
7.—種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟2) 中所述離心分離在離心力大于5000g的條件下進行。
8.—種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟3) 中在低溫沉淀前還包括將所述上清液真空濃縮至10-40%的步驟。
9.一種如權利要求8所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟3) 中在真空濃縮前還包括將所述上清液調節至PH = 3. 0-6. 0的步驟。
10.一種如權利要求1所述的酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其特征在于所述步驟 4)所得上清液采用剪切分子量為400KD的膜進行膜分離。
全文摘要
本發明涉及一種酵母甘露糖蛋白產品的制備方法，其步驟包括將酵母細胞壁調節到pH＝7.0-10.0，溫度80-135℃進行處理；將酵母細胞壁調節溫度為30-70℃，加入堿性蛋白酶，進行處理，離心分離收集上清液；將上清液低溫0-20℃保溫1-20小時，離心去除沉淀；將所得上清液采用剪切分子量為200-400KD膜進行分離，收集透過液，噴霧干燥得到酵母甘露糖蛋白產品。本發明的提取甘露糖蛋白的技術方案與現有技術的教導相反，即在酸性條件下進行上清液低溫沉淀，而且本發明的膜分離目的是讓甘露糖蛋白通過，通過截留去除大分子的蛋白和多糖更有利于酵母甘露糖蛋白發揮穩定葡萄酒中酒石和蛋白的作用。
文檔編號C12P21/06GK102051400SQ20091021234
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月6日 優先權日2009年11月6日
發明者余明華, 俞學鋒, 姚鵑, 張彥, 張海波, 李知洪 申請人:安琪酵母股份有限公司