專利名稱：食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高被病毒感染的細胞的病毒轉(zhuǎn)染效率的方法，更具體地說，涉 及一種提高被猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus, SFV)感染的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細 胞的慢病毒轉(zhuǎn)染效率。
背景技術：
間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是中胚層來源的具有多向分化能力 的干細胞，主要存在于全身結締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，是具有自 我復制、多向分化潛能的成體干細胞。在一定誘導條件下具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成 肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞以及基質(zhì)細胞等中胚層細胞分化的能力；同時，MSC還可以向 外胚層的神經(jīng)元細胞和內(nèi)胚層的肝卵圓性細胞分化。這突破了 MSC僅為中胚層干細胞的概 念，揭示了 MSC具有更為重要的理論研究意義和更為廣闊的應用前景。骨髓MSC體外分離 培養(yǎng)容易獲取，細胞免疫原性低，易于被外源病毒轉(zhuǎn)染且表達穩(wěn)定，已成為組織工程、基因 治療和再生醫(yī)學研究中理想的種子細胞。間充質(zhì)干細胞的應用大多是通過細胞直接自體移 植或細胞體外擴增并自體移植的方式。 無論是利用骨髓MSC作為移植細胞或者基因工程的載體細胞，其治療或使用的方 法以及效果和療效都需要經(jīng)過大量的實驗進行驗證。但以病患者為直接研究對象進行科學 研究受到諸多因素的制約，尤其是倫理學方面的限制。因此，需要首先在實驗動物的身上確 定各種治療方法的療效。 在所有的實驗動物中，普遍認為靈長類哺乳動物是與人類最接近的動物。食蟹猴 作為一種近年來大規(guī)模飼養(yǎng)的猴科靈長類哺乳動物，在各種治療方法和藥物的臨床前實驗 中，發(fā)揮越來越重要的作用。 在以食蟹猴為對象研究骨髓間充質(zhì)干細胞的應用中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)成年食蟹猴的 骨髓MSC在體外傳代代數(shù)非常有限，細胞很快融合，在體外食蟹猴的骨髓MSC很難擴增到需 要的數(shù)量。成年食蟹猴的骨髓MSC體外培養(yǎng)不超過3代就出現(xiàn)大片的細胞融合。無法進行 細胞數(shù)量的擴增以及體外的基因工程改造的實驗。而在某些成年多發(fā)疾病的研究中，作為 細胞移植治療以及基因工程改造的材料，必須提供足夠數(shù)量的成年骨髓MSC。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，所述成年食蟹猴的骨髓MSC體外培養(yǎng)不超過3代就出現(xiàn)大片的細胞 融合現(xiàn)象的原因是因為它們感染了猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus, SFV)，在本發(fā)明人的 研究中發(fā)現(xiàn)，向成年食蟹猴的骨髓MSC的細胞培養(yǎng)基中添加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物可以使細 胞在體外培養(yǎng)10代以上，使細胞數(shù)量大大地擴增。 但在以成年食蟹猴的骨髓MSC為研究對象的基因工程試驗中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在成
年食蟹猴的骨髓MSC的培養(yǎng)基中添加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物又會使細胞在以逆轉(zhuǎn)錄病毒為
載體進行病毒轉(zhuǎn)染的過程中的轉(zhuǎn)染效率大幅度地降低，從而無法進行相關的研究。 在對某些病毒感染疾病的轉(zhuǎn)基因療法的研究中，我們也需要對病毒轉(zhuǎn)染的細胞進
行病毒轉(zhuǎn)染，來驗證病毒轉(zhuǎn)染的治療對病毒感染的細胞的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過對被病毒感染的細胞的病毒轉(zhuǎn)染方法的改進，使其轉(zhuǎn)染 效率大幅度地提高。 為此，本發(fā)明提供了一種提高被病毒感染的細胞的病毒轉(zhuǎn)染效率的方法，包括I) 培養(yǎng)所述被病毒感染的細胞；11)對培養(yǎng)得到的所述被病毒感染的細胞進行轉(zhuǎn)染；其特征 在于在培養(yǎng)所述被病毒感染的細胞時添加抗病毒藥物，在所述細胞被轉(zhuǎn)染之前的一段時 間內(nèi)更換培養(yǎng)基，更換的培養(yǎng)基中不使用抗病毒藥物。 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述被病毒感染的細胞優(yōu)選是被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的。
在一種優(yōu)選的實施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒優(yōu)選是猴泡沫病毒。 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述被病毒感染的細胞優(yōu)選是食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細 胞。 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞優(yōu)選是成年食蟹猴骨髓 間充質(zhì)干細胞。 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述以病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法優(yōu)選是以逆轉(zhuǎn)錄病毒為 載體的轉(zhuǎn)染方法。 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法優(yōu)選是以慢病毒 為載體的轉(zhuǎn)染方法。 在一種優(yōu)選的實施方式中，所述抗病毒藥物優(yōu)選為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。
在一種優(yōu)選的實施方式中，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物優(yōu)選為泰諾福韋。
在一種優(yōu)選的實施方式中，所述一段時間優(yōu)選是2至8天。 應用本發(fā)明的方法，使感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞不僅能 夠增殖達到足夠的數(shù)量，還可以使病毒轉(zhuǎn)染的效率大幅度地提高。另外，本發(fā)明的方法也可 以用于對某些病毒感染疾病的轉(zhuǎn)基因治療的研究中。
圖1A示出了本發(fā)明實施例和對比例中使用的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DUET101-GFP 的基因分布的概圖(其中EF l-a和PGK是兩個啟動子結構，分別驅(qū)動GFP基因和潮霉素 抗性基因，還包括復制起點、長末端重復序列(LTR)和氨芐青霉素抗性基因)，圖IB中示出 了本發(fā)明實施例和對比例中使用的包裝質(zhì)粒CMVA8.91的基因構建圖，圖1C中示出了本發(fā) 明實施例和對比例中使用的包裝質(zhì)粒PMD. G的基因構建圖，圖1D示出了本發(fā)明實施例和對 比例中使用的載體質(zhì)粒DUET101的基因構建圖。 圖2A示出了本發(fā)明中使用的293T細胞在顯微鏡下所觀察到的細胞的照片(放大 倍數(shù)為100倍)，圖2B示出了在熒光顯微鏡下觀察到的制備的慢病毒，圖2C示出了在熒光 顯微鏡下觀察到的慢病毒滴度鑒定的結果，圖2D示出了通過流式細胞儀檢測到的帶有綠 色熒光蛋白的細胞百分比，橫坐標GFP代表綠色熒光，圖中十字右側顯示表達綠色熒光陽 性細胞，左側表示陰性細胞；縱坐標PI表示紅色熒光，十字上方為紅色熒光陽性細胞，下方 為紅色熒光陰性細胞，PI染色死亡細胞核。 圖3示出了在對比例2中，在轉(zhuǎn)染本發(fā)明中的慢病毒后，在不同時間點所觀察到的細胞中GFP的陽性率。 圖4示出了在對比例l和2以及實施例1中在病毒轉(zhuǎn)染前的不同時間點停用泰諾 福韋進行病毒轉(zhuǎn)染，所達到的有綠色熒光蛋白的細胞的百分比。 圖5示出了在對比例1和2以及實施例1中分別在病毒轉(zhuǎn)染前的第2天和第6天 停用泰諾福韋進行病毒轉(zhuǎn)染后，在熒光顯微鏡下觀察到的帶有綠色熒光蛋白的細胞，其中 圖5B和5G的放大倍數(shù)為200倍，圖5C、圖5D、圖5E、圖5H、圖51和圖5J放大的倍數(shù)為100倍。
具體實施例方式
本發(fā)明中使用的感染有病毒的細胞可以取自活的動物體或是剛剛處死的動物或 者可以是實驗室自行凍存的細胞。在本申請的實施例中所使用的細胞就是發(fā)明人自己凍存 的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明的細胞也可以是猩猩等其他靈長類哺乳動物的細 胞。本發(fā)明的方法也可以用于對某些病毒感染疾病的轉(zhuǎn)基因治療的研究中。如艾滋病等其 他病毒感染疾病的轉(zhuǎn)基因治療中。 感染有病毒的細胞在培養(yǎng)的過程中，如果不添加抗病毒的藥物，生長狀況較差，而 且會很快融合，無法大量地增殖下去。當向這些細胞的培養(yǎng)基中添加抗病毒的藥物會使細 胞的生長狀況得到改善，但是添加抗病毒藥物后，以病毒為載體進行病毒轉(zhuǎn)染的效率會很 低。在本發(fā)明中，在進行病毒轉(zhuǎn)染前的一段時間內(nèi)，停止使用抗病毒藥物，使病毒轉(zhuǎn)染的效 率提高。 實施例1和對比例1和2 發(fā)明人以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染食蟹猴間充質(zhì)干細胞，在實施例1中，使用的細胞是
感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴細胞，分別在慢病毒轉(zhuǎn)染前的2、4、6和8天停用抗逆轉(zhuǎn)
錄病毒藥物泰諾福韋，即在慢病毒轉(zhuǎn)染前的2、4、6和8天更換培養(yǎng)基，更換的培養(yǎng)基中不
含抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物泰諾福韋；在對比例1中，使用的細胞是感染有猴泡沫病毒的成年食
蟹猴細胞，在以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染的過程中不停用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物泰諾福韋；在對比例
2中，使用的細胞是沒有感染猴泡沫病毒的食蟹猴細胞(這些食蟹猴細胞取自幼年1-3歲
的食蟹猴，實驗動物食蟹猴來自于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司，該公司的動物
實驗設施已獲得國際實驗動物管理評估及認證協(xié)會(Association for Assessment and
Accreditation of LaboratoryAnimal Care， AAALAC)的資質(zhì)認證)，在沒有感染病毒的食
蟹猴細胞的培養(yǎng)和病毒轉(zhuǎn)染的過程中均沒有添加泰諾福韋，以此為陽性對照。 第一步慢病毒的制備(即在293T細胞中進行病毒的擴增) 1)傳代培養(yǎng)293T細胞，保持細胞在較高的密度，按1 : 4 1 : 5分傳； 2)在轉(zhuǎn)染病毒前一天，用100 g/ml的多聚-右旋-賴氨酸溶液包被100mm培養(yǎng)
皿(使細胞貼壁更牢)，室溫作用60min，使用前用無菌PBS洗兩次； 3)使293T細胞在轉(zhuǎn)染前可以達到70 80%匯片； 4)取400ii1 OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)置于5ml聚苯乙烯管中，將載體質(zhì) 粒DNA按照DUET101 : CMV8. 91 : PMD. G(這三種質(zhì)粒來自霍普金斯大學程臨釗實驗室， 結構在網(wǎng)址為http://www.addgene.org/pgvecl f = c&identifier = 17629&cmd = f indpl&attag = c上可杳到)=3:4: 1比例溶于其中，三個質(zhì)粒DNA總量為16 y g，混勻，室溫放置5min ; 5)同樣取Lipof ectamine2000脂質(zhì)體(GIBCO) 32 ii 1力B入另 一 盛有400 ii 1
OPTI-MEM(Invitrogen)的聚苯乙烯管中，輕柔混勻，室溫放置5min ; 6)再將步驟4)和5)得到的兩種液體混合，室溫放置20min ; 7)將質(zhì)粒DNA與Lipof ectamine2000脂質(zhì)體的混合液加入含有8ml新鮮培養(yǎng)基的
293T細胞培養(yǎng)皿中，混勻，37"C，5X C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 8)轉(zhuǎn)染后12h，棄去轉(zhuǎn)染液，加入8ml ITS培養(yǎng)液收集病毒上清；9)繼續(xù)培養(yǎng)24hr、48hr后收集病毒上清后收集病毒上清，500rpm離心去除細胞碎
片，用0. 45 m濾器過濾到無菌離心管中，在濃縮前在fC下進行保存。 第二步慢病毒的濃縮 1)取4ml無菌DPBS加到Ultra-Plus 20濾膜(Millipore)上，2500rpm離心5分 鐘，濕潤濾膜。棄去管底DPBS溶液。 2)將經(jīng)過0.45iim濾器過濾的病毒上清加入濾膜插件(濾膜套管內(nèi))中，4。C， 4000g離心20min。 3)吸取濾膜插件上的上清，分裝于1. 5ml EP管中，滴度鑒定后儲存于-S(TC冰箱 中，備用。 第三步慢病毒滴度的鑒定 1)用100 g/ml的多聚-右旋-賴氨酸溶液包被六孔板，以每孔2 X 105個細胞的 密度將293T細胞接種于六孔板。 2)將病毒上清加入293T細胞培養(yǎng)液中，以8 y g/ml的濃度加入聚凝胺。
3)熒光顯微鏡下計算綠色熒光蛋白陽性細胞數(shù)，以下面公式計算病毒上清滴度。 病毒滴度=綠色熒光蛋白陽性細胞百分比X293細胞總數(shù)/加入病毒上清的體積。
第四步細胞的培養(yǎng) 實施例1和對比例1中使用的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞是本發(fā)明人凍存的細 胞，取自成年食蟹猴(這些食蟹猴來自于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司，該公司 的動物實驗設施已獲得國際實驗動物管理評估及認證協(xié)會(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care， AAALAC)的資質(zhì)認證)，這些細胞在凍存 之前的培養(yǎng)過程中一直使用含有泰諾福韋的培養(yǎng)基，如果使用復蘇的成年食蟹猴骨髓間充 質(zhì)干細胞，在復蘇后停止使用泰諾福韋，即使用不含泰諾福韋的培養(yǎng)基，分別在復蘇后的第 2、4、6和8天進行病毒轉(zhuǎn)染(指進行四個在不同時間點進行病毒轉(zhuǎn)染的平行實驗，相當于 分別在轉(zhuǎn)染前的第2、4、6和8天停用泰諾福韋)或者是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞也可 以不經(jīng)凍存，在食蟹猴體外培養(yǎng)合適階段就進行轉(zhuǎn)染，如果不凍存，則分別在轉(zhuǎn)染前的2、4、 6和8天停用泰諾福韋，即分別在轉(zhuǎn)染前的2、4、6和8天使用更換后的不含泰諾福韋的培養(yǎng) 基。在對比例2中所使用的細胞是未感染猴泡沫病毒的食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞，這些細 胞取自幼年1-3歲的食蟹猴，這些食蟹猴的來源來自于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限 公司，該公司的動物實驗設施已獲得國際實驗動物管理評估及認證協(xié)會(Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care，AAALAC)的資質(zhì)認證?？梢?是凍存的，也可以是未經(jīng)過凍存的，在整個培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的過程中均不使用泰諾福韋。
第五步慢病毒轉(zhuǎn)染細胞
1)等到細胞長滿70%，更換新鮮培養(yǎng)基，根據(jù)綠色熒光蛋白(GFP)病毒滴度和細 胞數(shù)量，按照MOI值等于10加入病毒上清(MOI =病毒數(shù)/細胞數(shù)，即相當于IO個病毒一 個細胞)加入病毒上清，以10y g/ml的濃度加入聚凝胺。孵育20小時后棄去轉(zhuǎn)染液，加入 新鮮培養(yǎng)基； 2)培養(yǎng)1周后，熒光顯微鏡下觀察，同時在不同時間點計算轉(zhuǎn)染效率。
結果在對比例2的陽性對照中，病毒轉(zhuǎn)染的效率較高，在轉(zhuǎn)染進行20小時時達到 平臺期，最高可以達到85% ，具體結果可以參見圖3 ;在對比例1中，在整個細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 的過程中一直都使用泰諾福韋，病毒轉(zhuǎn)染的效率很低，只有10% ;在實施例1中，在停用泰 諾福韋兩天后進行病毒轉(zhuǎn)染的效率最高可達到15%，在停用泰諾福韋6天后進行病毒轉(zhuǎn)染 的效率最高可達到50%，在實施例1中停用泰諾福韋后的不同時間點進行病毒轉(zhuǎn)染可以達 到的效率以及對比例1和2中病毒轉(zhuǎn)染可以達到的效率可以參見圖4，在圖5中示出了在 熒光顯微鏡下觀察到的進行了病毒轉(zhuǎn)染實驗的照片。隨著停用泰諾福韋時間的延長，細胞 中SFV的拷貝數(shù)也相應提高，平均超過8天，成年食蟹猴MSC細胞會出現(xiàn)融合的現(xiàn)象，影響 細胞的進一步傳代培養(yǎng)。 由上述實驗結果可以看出，通過本發(fā)明的方法可以相對目前采用的方法更為高效
地進行成年食蟹猴MSC細胞的病毒轉(zhuǎn)染，以便于進行各種病毒轉(zhuǎn)染的研究。 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技
術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修
改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
一種提高被病毒感染的細胞的病毒轉(zhuǎn)染效率的方法，包括I)培養(yǎng)所述被病毒感染的細胞；II)對培養(yǎng)得到的所述被病毒感染的細胞進行轉(zhuǎn)染；其特征在于在培養(yǎng)所述被病毒感染的細胞時添加抗病毒藥物，接著在所述細胞被轉(zhuǎn)染之前的一段時間內(nèi)更換培養(yǎng)基，該更換的培養(yǎng)基中不使用抗病毒藥物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述被病毒感染的細胞是被逆轉(zhuǎn)錄病毒 感染。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是猴泡沫病毒。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述被病毒感染的細胞是食蟹猴骨髓間 充質(zhì)干細胞。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞是成年食 蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞。
6. 根據(jù)權利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述以病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法是以逆 轉(zhuǎn)錄病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法是以慢病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法。
8. 根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述抗病毒藥物為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物為泰諾福韋。
10. 根據(jù)權利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述一段時間是2至8天。
全文摘要
本發(fā)明涉及食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染，具體涉及一種提高被病毒感染的細胞的病毒轉(zhuǎn)染效率的方法。本發(fā)明提供的方法，包括I)培養(yǎng)所述被病毒感染的細胞；II)對培養(yǎng)得到的所述被病毒感染的細胞進行轉(zhuǎn)染；其特征在于在培養(yǎng)所述被病毒感染的細胞時添加抗病毒藥物，在所述細胞被轉(zhuǎn)染之前的一段時間內(nèi)，培養(yǎng)基中不使用抗病毒藥物。通過本發(fā)明的方法使在被病毒感染的細胞的擴增數(shù)量增加的基礎上，使得細胞的病毒轉(zhuǎn)染效率大大地提高。
文檔編號C12N15/867GK101792777SQ20091020968
公開日2010年8月4日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權日2009年11月5日
發(fā)明者任振華, 岳峰, 張愚, 王淑艷, 鄒春林 申請人:廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司