專(zhuān)利名稱：：一種鑒定康氏木霉纖維素酶系中差異蛋白組分的培養(yǎng)基及其用途的制作方法一種鑒定康氏木霉纖維素酶系中差異蛋白組分的培養(yǎng)基及其用途本發(fā)明涉及一種用于康氏木霉(Trichodermakoningii)生產(chǎn)纖維素酶系的培養(yǎng)基，和利用該培養(yǎng)基鑒定康氏木霉纖維素酶中差異蛋白組分的用途，通過(guò)比較分析胞外蛋白在電泳膠塊中的差異，從而鑒定該康氏木霉的纖維素酶酶系的組成。本發(fā)明屬發(fā)酵工程與蛋白質(zhì)酶工程的生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：纖維素(Cellulose)是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)，植物界中碳素的一半以上存在于纖維素中。植物通過(guò)光合作用，生產(chǎn)世界上最豐富、最廉價(jià)的纖維素資源，全世界每年植物體生成量高達(dá)1，500億噸干物質(zhì)，其中纖維素及半纖維素的總量為850億噸[1]。由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶構(gòu)造，其外圍又被木質(zhì)素層包圍，要把它水解成可利用的葡萄糖相當(dāng)困難。所以，到目前為止纖維素仍沒(méi)有得到很好地利用。纖維素是由D-葡萄糖以P-l，4糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成，直鏈狀大分子纖維素折迭起來(lái)，形成具有高結(jié)晶的基本構(gòu)成單位，由這種基本構(gòu)成單位集中起來(lái)構(gòu)成微小的結(jié)構(gòu)單位，再由眾多的微小單位構(gòu)成纖維素[2—5]。1纖維素酶的組成纖維素酶(cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，不是單一酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系。迄今，已有很多關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌的報(bào)道，纖維素酶的來(lái)源非常廣泛，昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、細(xì)菌、放線菌和真菌等都能產(chǎn)生纖維素酶；但對(duì)纖維素作用較強(qiáng)的菌株多是木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、Pellienlalia屬和枝頂孢霉屬(Acremonium)的菌株，特別是綠色木霉(Trichodermavirde)及其近緣的菌株[6—9]。1950年，Reesei等曾闡明，沒(méi)有一種纖維素酶生產(chǎn)菌能生產(chǎn)出分解棉花中的天然纖維素的酶，但發(fā)現(xiàn)有的菌株生產(chǎn)的酶能分解膨潤(rùn)的纖維素或纖維素誘導(dǎo)體等非晶體性纖維素，因而提出了由于天然纖維素的特異性而必須以不同的酶協(xié)同作用才能分解的C「Cx假說(shuō)[1°]。這個(gè)假說(shuō)認(rèn)為當(dāng)纖維素酶作用時(shí)，首先對(duì)纖維素的Q組分起作用，繼而使Cx組分變成纖維低聚糖，再由P-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。關(guān)于C「Cx酶的假說(shuō)尚有爭(zhēng)議[1°]。目前比較公認(rèn)的，纖維素酶系分為以下三大類(lèi)12]:(l)葡聚糖內(nèi)切酶(1，4-P-D-glucangiucanohydrolase，E.C3.2.1.4，Cx酶或CMC酶，簡(jiǎn)稱EG)，這類(lèi)酶一般作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解P-l，4-糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。通常，P-葡萄糖苷酶是將纖維二糖的水解為葡萄糖一類(lèi)水解酶，其底物還可以是對(duì)硝基葡萄糖苷；(2)葡聚糖外切酶(l，4-e-D-glucancellobiohydrolaseE.C3.2.1.91，也稱Q酶或外切纖維二糖水解酶，簡(jiǎn)稱CBH)，這類(lèi)酶作用于纖維素線狀分子末端，水解13_1，4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)。通常，外切酶是將纖維素水解產(chǎn)生纖維二糖的一類(lèi)水解酶，其底物可以是纖維素，還可以是對(duì)硝基纖維二糖苷；(3)13-葡聚糖苷酶(P-glucosidase，E.C3.2.1.21，纖維二糖酶，簡(jiǎn)稱BG)，這類(lèi)酶一般將纖維二糖水解成葡萄糖分子。通常，P-葡萄糖苷酶是將纖維二糖的水解為葡萄糖一類(lèi)水解酶，其底物還可以是對(duì)硝基葡萄糖苷。2.纖維素酶的作用方式因纖維素酶組分多，酶系復(fù)雜，纖維素酶降解纖維素為葡萄糖的細(xì)節(jié)至今仍然不清楚，許多研究者提出了不同的看法，主要有(1)C「Cx假說(shuō)Reesei提出的C「Cx假說(shuō)，通過(guò)對(duì)大量的微生物比較研究，認(rèn)為Q酶首先作用于結(jié)晶纖維素，使其改變成可被Cx酶作用的形式；Cx酶隨機(jī)水解非結(jié)晶纖維素、可溶性纖維素衍生物和葡萄糖的P_1，4-寡聚物；13-葡萄糖苷酶將纖維二糖、纖維三糖水解成葡萄糖。但是在隨后幾十年的研究中，Reesei提出的C「Cx酶分階段水解纖維素的設(shè)想在實(shí)驗(yàn)中并未得到證實(shí)。(2)順序作用模式Pettersson等人[24]報(bào)道，在水解天然纖維素中，起關(guān)鍵作用的Q酶實(shí)際上是外切型P-l，4-葡聚糖纖維二糖水解酶，并提出天然纖維素的水解是從內(nèi)切型P-l，4-葡聚糖酶(Cx)開(kāi)始的。Cx酶首先在微纖維上一些特定的薄弱位置把纖維素分子鏈打開(kāi)，&酶接著深入到纖維素分子鏈內(nèi)把氫鍵斷開(kāi)，這樣就使一段段纖維斷片從微纖維上脫落下來(lái)，脫落的纖維素?cái)嗥俳?jīng)Cx酶和13-葡萄糖苷酶作用，形成葡萄糖。(3)協(xié)同作用模式Mandels等[13—14]作了如下推測(cè)，認(rèn)為首先由Q和Cx酶形成復(fù)合體，共同對(duì)纖維素進(jìn)行水解，生成物放出時(shí)復(fù)合物解離，然后一個(gè)酶單獨(dú)吸附到纖維素上，這種酶就不再有活性了。Wood等[15]還報(bào)道了好氣真菌纖維二糖水解酶與厭氧真菌和厭氧細(xì)菌纖維素酶間的協(xié)同作用。中國(guó)科學(xué)院微生物所纖維素酶組報(bào)道[16]，對(duì)于排列越是緊密的天然纖維素，C「Cx酶的協(xié)同作用就越顯著。對(duì)棉花的協(xié)同效果為8倍，微晶纖維素3.4倍，而對(duì)磷酸膨脹纖維素則為1.7倍。關(guān)于纖維素酶協(xié)同作用，近些年有較多的研究和報(bào)道，認(rèn)為纖維素酶酶系各組分共同作用時(shí)能將纖維素降解水溶性產(chǎn)物，若將各組分分開(kāi)便失去這種能力，若將分離的各組分再按比例又可恢復(fù)這種能力。因此，目前最易接受的纖維素酶水解機(jī)理見(jiàn)圖6。3.纖維素酶的研究進(jìn)展纖維素酶的發(fā)現(xiàn)比較早，1906年Silliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)有纖維素酶，能分解天然纖維素。1933年Grassman等研究了一種真菌的纖維素酶系，分辨出兩個(gè)組分。19401950年對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了大量的篩選分離工作。建立了比較完整的分離篩選方法。至1950年Reesei等提出了纖維素酶作用方式的C「Cx假說(shuō)以后，開(kāi)始轉(zhuǎn)入纖維素酶的基礎(chǔ)研究，包括纖維素酶的性質(zhì)，作用方式，培養(yǎng)條件和測(cè)定方法等。1960年后，由于分離技術(shù)的發(fā)展，推動(dòng)了纖維素酶的分離純化方法，對(duì)纖維素酶的組分、作用方式以及誘導(dǎo)作用等方面的研究進(jìn)展比較快，并實(shí)現(xiàn)了纖維素酶制劑的工業(yè)生產(chǎn)，在應(yīng)用上也取得了一定的成績(jī)。目前有許多國(guó)家在進(jìn)行纖維素酶的研究，其中美國(guó)、日本、德國(guó)和英國(guó)等國(guó)家發(fā)展比較快，以纖維素轉(zhuǎn)化成糖為主要目標(biāo)，纖維素酶制劑的產(chǎn)量逐年增加。70年代以來(lái)，基因重組技術(shù)的迅速發(fā)展，纖維素酶的研究日新月異。由于絲狀真菌木霉屬能產(chǎn)生大量的胞外酸性纖維素酶，酶系較完全，并且對(duì)結(jié)晶纖維素有較好的酶解活性，其中對(duì)里氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶基因研究比較透徹，cbhI、cbhII、cbhIII、cbhIV、egI、egIII、bg7個(gè)基因得到了克隆M，但是纖維素酶在E.coli中的分泌表達(dá)水平很低。Godbole等將T.reeseicbhI在酵母Pichi即astoris中成功轉(zhuǎn)化并表達(dá)。細(xì)菌主要產(chǎn)中性纖維素酶和堿性纖維素酶。由于酶的耐熱性在生產(chǎn)中具有實(shí)用意義，所以耐熱細(xì)菌是研究的熱點(diǎn)。Kim等[18]克隆了AquifexaeolicusVF5編碼EG的cel8Y基因，在E.coliXL1-Blue中表達(dá)成功。酶CEL8Y有很好的耐熱性，最適作用溫度和pH分別為8(TC和7.0。而堿性纖維素酶由于在洗滌劑工業(yè)中有很好的應(yīng)用價(jià)值，所以對(duì)其的研究也是熱點(diǎn)之一，其產(chǎn)生菌主要集中在芽孢桿菌屬。Hakamada等[19]對(duì)Bacillus,circulansKSM-N257進(jìn)行了研究，運(yùn)用盒式連接介導(dǎo)PCR和反向PCR克隆了編碼Egl-257的基因egl-257，對(duì)egl-257全長(zhǎng)基因序列分析表明，egl-257包含一個(gè)長(zhǎng)度為1221bp的開(kāi)放讀碼框架，核苷酸鏈248位為ATG起始密碼子，1469位TAA終止密碼子。ShouTakashima等^用麥芽糖作為主要碳源和誘導(dǎo)物，利用米曲霉Taka-amylase的啟動(dòng)子，建立一個(gè)米曲霉Aspergillusoryzae宿主表達(dá)系統(tǒng)，使里氏木霉Trichodermareesei的纖維素酶基因(cbhl，cbh2，egll，egl3，egl5，bgll)在該啟動(dòng)子控制之下并得以過(guò)量表達(dá)。我國(guó)研究纖維素酶有幾十年的歷史，1960-1990年主要進(jìn)行菌種篩選和纖維素酶的分離純化工作，做了酶制劑的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。纖維素酶在食品加工、釀酒、飼料、纖維素糖化等方面的應(yīng)用取得了一定的成績(jī)。肖壯志等[21]采用剛果紅染色法從1\reeseicDNA文庫(kù)中篩選到EGIII基因，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中成功表達(dá)，比較了釀酒酵母的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)組分SS02和SEB1對(duì)EGIII分泌的影響，研究結(jié)果顯示T.reeseiegIII在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其mRNA5'端先導(dǎo)序列中可能存在影響該基因表達(dá)水平的調(diào)控序列。中科院微生物所和山東大學(xué)等單位還進(jìn)行了大量的纖維素酶的基礎(chǔ)理論研究。4.纖維素酶的應(yīng)用工業(yè)酶制劑的應(yīng)用中相當(dāng)普遍，尤其是穩(wěn)定性好、活性高、特異性強(qiáng)的酶制劑更受歡迎，其發(fā)展相當(dāng)迅速。1995年世界工業(yè)酶制劑市場(chǎng)有10億美元的市場(chǎng)份額，2000年達(dá)16億美元，2010年預(yù)計(jì)超過(guò)100億美元。60%的酶制劑由歐洲生產(chǎn)，40%產(chǎn)自美國(guó)和日本。大約75%工業(yè)酶制劑是水解酶類(lèi)。纖維素酶及半纖維素酶的應(yīng)用始于上世紀(jì)80年代初，首先用于動(dòng)物飼料，其次是食品行業(yè)，后來(lái)用于紡織、洗滌、造紙行業(yè)。近20年來(lái)，纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶的產(chǎn)量增加迅速，廣泛用于紡織、食品、飲料、釀酒和造紙工業(yè)，約占整個(gè)工業(yè)酶制劑市場(chǎng)的20%。這類(lèi)工業(yè)酶制劑主要由木霉屬和曲霉屬生產(chǎn)[22—24]。(1)飼料工業(yè)世界年產(chǎn)動(dòng)物飼料6，000億噸，價(jià)值500億美元以上，90%主要用于飼養(yǎng)禽類(lèi)、豬、和反芻動(dòng)物，10%用于寵物和魚(yú)類(lèi)。纖維素酶和纖維素酶產(chǎn)生菌能轉(zhuǎn)化粗飼料如麥秸、稻草、玉米等，把其中一部分纖維素轉(zhuǎn)化為糖、菌體蛋白、脂肪等，降低飼料中粗纖維含量，從而促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收，提高了飼料利用價(jià)值。目前纖維素酶大多與其它酶制成復(fù)合酶，其中含纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等，在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中已取得很大成效。如，朱元招等[25]添加以纖維素酶為主酶制劑對(duì)斷奶犢牛生產(chǎn)效果顯著，增重提高75%。席興軍等[26]添加纖維素酶使玉米秸稈青貯飼料中氨態(tài)氮與總氮質(zhì)量比和丁酸與總酸摩爾比分別下降28%和100%，酸性洗滌纖維(ADF)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降20%，顯著提高了玉米秸稈青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。纖維素酶在發(fā)酵工業(yè)中的另一重要應(yīng)用為生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。6(2)食品發(fā)酵工業(yè)方面[27—28]在食品發(fā)酵工業(yè)中，纖維素酶可應(yīng)用于釀酒，先用纖維素酶糖化，再經(jīng)酵母發(fā)酵，可提高酒精和白酒的出酒率，降低醪液的黏度。用纖維素酶和其他細(xì)胞裂解酶來(lái)抽提茶汁，生產(chǎn)速溶茶，不僅收率高，而且茶葉色、香、味品質(zhì)較熱浸法佳。纖維素酶還在提煉橄欖油，改善煙草品質(zhì)，改善果蔬汁的口感風(fēng)味，提高面包質(zhì)量方面得到應(yīng)用。此外，纖維素酶還廣泛用于生產(chǎn)醬油，加工果醬飲料及其他食品。(3)紡織業(yè)中的應(yīng)用[29—3°]纖維素酶應(yīng)用于紡織業(yè)是近十幾年來(lái)的事情，現(xiàn)已成為纖維素第三大纖維素酶應(yīng)用行業(yè)。纖維素酶可用于紡織業(yè)退漿處理、生物磨光、石磨等方面。利用纖維素酶對(duì)棉、麻、人造絲等織物進(jìn)行處理，改善其內(nèi)在品質(zhì)和外觀。在適當(dāng)?shù)臈l件下，纖維素酶僅對(duì)織物的表面或伸出織物表面的絨毛狀短小纖維起作用，尤其在替代牛仔裝的石洗和酸洗時(shí)，可克服斷紗、磨損和日久發(fā)黃的缺點(diǎn)，使產(chǎn)品柔軟、滑爽、膨松、豐滿。(4)造紙業(yè)上的應(yīng)用纖維素酶在造紙工業(yè)上可用于酶法廢紙脫墨，改善紙槳性能，抑制紙槳泛黃，抑制導(dǎo)管的脫落，漂白、去除碎漿[31]。目前，纖維素酶以及纖維素酶與半纖維素酶混合物的脫墨機(jī)理尚不完全清楚[32]。一些學(xué)者根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別提出了一些推測(cè)性的假說(shuō)，如Franks,Kim等提出水解說(shuō)，Zeyer的機(jī)械摩擦說(shuō)，Eom的纖維剝離說(shuō)，Jeffries的間接作用說(shuō)，Woodward的等效說(shuō)等。酶法脫墨作為一種新的造紙生物技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)首先，酶法脫墨紙漿和化學(xué)脫墨紙漿相比具有很高的物理性能，如高白度和低殘存墨粉；其次，從經(jīng)濟(jì)上看，酶法脫墨比化學(xué)脫墨的費(fèi)用低，酶法脫墨既可節(jié)省能耗，降低生產(chǎn)成本，又可大量減少化學(xué)藥品的使用，包括減少漂白需求，降低了漂白費(fèi)用。酶法脫墨后的廢水需氧量和毒性也較低。微生物纖維素酶酶系復(fù)雜，很難用一種方法將各組分一一分離開(kāi)來(lái)，致使至今還沒(méi)有詳盡透徹地闡述纖維素酶酶系各組分的功能。盡管纖維素酶系一般分為三大類(lèi)，而且它們的功能也得到確認(rèn)，但作為某一特定的菌株的纖維素酶系到底由哪些組分組成？其內(nèi)切酶、外切酶以及P-葡聚糖苷酶各有幾個(gè)組分？纖維素酶系中除以上三類(lèi)之外，還有沒(méi)有其它組分？至今沒(méi)有一種直觀的方法進(jìn)行分類(lèi)和鑒定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一整套制備、純化及鑒定纖維素酶系(特別是康氏木霉(Trichodermakoningii)的纖維素酶系)組分及其阻遏蛋白的直觀方法、通過(guò)進(jìn)行分類(lèi)和鑒定，從而準(zhǔn)確判斷產(chǎn)纖維素酶菌株的纖維素酶系中的組分，對(duì)傳統(tǒng)的纖維素酶系分類(lèi)提出挑戰(zhàn)，為深入研究該菌株的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)提供理論依據(jù)。同時(shí)，本發(fā)明為該菌株構(gòu)建基因工程菌提供可靠信息，為該菌株的纖維素酶代謝調(diào)控提供理論指導(dǎo)。此外，本發(fā)明還可為其他菌株的纖維素酶系的研究提供參考。本發(fā)明第一個(gè)發(fā)明目的是提供一種用于康氏木霉(Trichodermakoningii)生產(chǎn)纖維素酶系的培養(yǎng)基，包括(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基碳源為稻草粉，氮源為麩皮，水20ml，其中稻草粉作為誘導(dǎo)物；(2)阻遏培養(yǎng)基葡萄糖0.5-10g，碳源為稻草粉，氮源為麩皮，水20ml，其中葡萄糖作為阻遏物；由于在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)康氏木霉分泌了大量的纖維素酶，而阻遏培養(yǎng)基中含葡萄糖，作為纖維素酶酶解纖維素的最終產(chǎn)物，葡萄糖通過(guò)末端產(chǎn)物阻遏纖維素酶酶系的分泌，使得康氏木霉直接利用環(huán)境中的葡萄糖，供給自身生長(zhǎng)繁殖的需要。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡萄糖0.5-1.5g為低阻遏濃度，1.5-4.5g為中阻遏濃度，4.0-10.Og為高阻遏濃度。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述培養(yǎng)基的碳源可選自甘蔗渣或秸稈，氮源可選自酵母膏、蛋白胨、硫酸銨或氯化銨，其中，碳源(如稻草粉、秸稈或甘蔗渣)為8.Og，氮源(如麩皮)為4.Og，或者選自0.5-2g的酵母膏、蛋白胨、硫酸銨或氯化銨(以確保物質(zhì)所含的碳元素氮元素量之比為1030:1)。其中以上培養(yǎng)基的pH均為自然pH，無(wú)需調(diào)整。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述康氏木霉(Trichodermakoningii)菌株可以選用已公開(kāi)的各種康氏木霉菌株，例如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200610155028.8于2007年6月27日公開(kāi)的康氏木霉(Trichodermakoningii)ZJU-TCGMCCNo.18;也可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化菌株，例如購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心、保藏號(hào)AS3.2774的菌株；或使用實(shí)驗(yàn)室自行保藏的菌株。本發(fā)明第二個(gè)發(fā)明目的是提供一種利用上述康氏木霉菌株培養(yǎng)基生產(chǎn)纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分或纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分的方法，包括(1)無(wú)菌條件下，在250ml三角瓶中分別制備上述無(wú)菌的纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基或纖維素酶阻遏培養(yǎng)基，再分別接種康氏木霉菌株，在283(TC發(fā)酵4.05.0天，每天翻動(dòng)一次培養(yǎng)基發(fā)酵曲以便通風(fēng)換氣；(2)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基、阻遏培養(yǎng)基的發(fā)酵曲，分別用100mlpH4.8緩沖液浸提、過(guò)濾；(3)將濾液以12000g離心，獲得粗酶液；(4)分別用飽和度為20%80%硫酸銨沉淀粗酶液，并在低于45。C條件下進(jìn)行S印hadexG25凝膠脫鹽；(5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或者低溫凍干濃縮，以獲得纖維素酶濃縮液，其中濃縮液中富含纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分或纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分；其中，康氏木霉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分泌較多、而在阻遏培養(yǎng)基中分泌較少甚至沒(méi)有的胞外差異蛋白，所述的胞外蛋白為纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分；康氏木霉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分泌較少甚至沒(méi)有、而在阻遏培養(yǎng)基分泌較多的胞外差異蛋白，所述的胞外蛋白為纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中用100mlpH4.8緩沖液浸提發(fā)酵曲lh，紗布擠壓過(guò)濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(3)中通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或者低溫凍干以濃縮10倍體積。在上述方案中，所述的纖維素酶濃縮液，其特征為代謝調(diào)控固體發(fā)酵纖維素酶，即纖維素酶酶解纖維素的末端產(chǎn)物葡萄糖的阻遏及其解除，在不同培養(yǎng)基中控制康氏木霉對(duì)纖維素酶的分泌，從而獲得纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分或纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分，即纖維素酶的差異蛋白，必要時(shí)還結(jié)合纖維素酶功能測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)所述的誘導(dǎo)或阻遏相關(guān)蛋本發(fā)明第三個(gè)發(fā)明目的是提供一種在不同的代謝控制條件下鑒定康氏木霉纖維酶系的差異蛋白的方法，包括1)根據(jù)前述方法，配制誘導(dǎo)或阻遏培養(yǎng)基，并培養(yǎng)康氏木霉菌株，以生產(chǎn)纖維酶系的差異蛋白；2)采用變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離法來(lái)分離純化纖維素酶系各組分差異蛋白，即用4%8%活性梯度膠對(duì)纖維素酶粗酶液樣品進(jìn)行電泳、切膠、凝膠染色定位、切分目的蛋白條帶、電泳洗脫、透析、凍干，分別獲得纖維素酶純酶液的多種蛋白樣品；3)根據(jù)低遷移率的蛋白或高遷移率的待純化蛋白，以4%7%的凝膠梯度或5%10%的凝膠梯度，對(duì)步驟2)的樣品中的一種蛋白再次進(jìn)行變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離，最終獲得純化的單一活性蛋白樣品；4)對(duì)所得的活性差異蛋白進(jìn)行功能鑒定活性蛋白將纖維二糖的水解為葡萄糖一類(lèi)水解酶的差異蛋白是P-葡萄糖苷酶，其底物還可以是對(duì)硝基葡萄糖苷；活性蛋白將纖維素水解產(chǎn)生纖維二糖的一類(lèi)水解酶的差異蛋白是外切酶，其底物可以是纖維素；活性蛋白將纖維素水解產(chǎn)生寡聚纖維素或可溶性低聚糖的一類(lèi)水解酶的差異蛋白是內(nèi)切酶，其底物可以是纖維素或羧甲基纖維素。在一個(gè)實(shí)施方案的步驟4)中，將微克級(jí)的已純化為電泳純的活性蛋白在5(TC催化水解纖維二糖溶液(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液溶解)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中有葡萄糖，則判定該活性蛋白為P-葡萄糖苷酶(BG)。在另一個(gè)實(shí)施方案的步驟4)中，將微克級(jí)的已純化將已純化為電泳純的活性蛋白在5(TC催化水解對(duì)硝基纖維二糖苷或纖維素(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液溶解)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中只有纖維二糖而沒(méi)有葡萄糖，則判定該活性蛋白為外切酶。還在另一個(gè)實(shí)施方案的步驟4)中，將微克級(jí)的已純化將已純化為電泳純的活性蛋白在5(TC催化水解纖維素(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性測(cè)定，再經(jīng)3，5二硝基水楊酸定量檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中有還原糖產(chǎn)生卻沒(méi)有纖維二糖和葡萄糖，則判定該活性蛋白為內(nèi)切酶。在其他實(shí)施方案中，對(duì)于低遷移率的蛋白選用4%7%的凝膠梯度，對(duì)于高遷移率的蛋白選用5%10%的凝膠梯度進(jìn)行分離(例如選用5%8%的凝膠梯度分離康氏木霉的纖維素酶)，其中，用于第1次電泳的濃縮膠的電泳電壓為80100V，電流為2030mA;用于第2次電泳的分離膠的電壓為180200V，電流<30mA;電泳緩沖液為pH8.8，12.5mmol/lTris-glycin96mmo1/1，電泳溫度優(yōu)選4°C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，分離膠長(zhǎng)度150mm，電泳時(shí)長(zhǎng)1012h。電泳梯度膠的染色，采用常規(guī)的CoomassiebrilliantblueR-250染色和固定，以及10%醋酸和20%甲醇脫色劑脫色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凝膠的尺寸大小為長(zhǎng)X寬X厚，大于或等于150X150X1.0mm，上樣孔數(shù)量共計(jì)20孔/每塊膠，如北京六一儀器化工廠的電泳槽，型號(hào)DYCZ-24A;選用pH8.8，12.5mmo1/1Tris-glycin96mmo1/1的電泳緩沖液，有利于分離康氏木霉纖維素酶系，這個(gè)濃度比正常的活性蛋白質(zhì)電泳低50%[33—34];染色及脫色溫度為5060°C。在上述實(shí)施方案中，將凝膠的泳道分為染色組泳道組和蛋白回收組泳道，通過(guò)染色組泳道以回收對(duì)應(yīng)于蛋白回收組泳道位置的目的蛋白凝膠，以進(jìn)行第二次凝膠電泳分離，其中用于染色，染色及脫色溫度為5060°C，時(shí)間控制在40分鐘以內(nèi)(盡量防止活性蛋白彌散)，將目的蛋白凝膠分別裝進(jìn)透析袋中、加入適量電極緩沖液，密封，再置入電泳槽的陰極電泳洗脫23h，完畢，轉(zhuǎn)入10mM的pH4.8檸檬酸緩沖液中透析，收集透析內(nèi)液，于-4(TC條件下凍干，供第二次循環(huán)使用。在第二次循環(huán)純化時(shí)，相應(yīng)調(diào)整凝膠梯度，例如對(duì)于低遷移率的蛋白選用4%7%的凝膠梯度，對(duì)于高遷移率的蛋白選用5%10%的凝膠梯度進(jìn)行分離，其他步驟與第一次循環(huán)相同，最后獲得電泳純度的活性蛋白。活性蛋白包括康氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白和纖維素酶阻遏相關(guān)蛋白，供功能測(cè)定使用。本發(fā)明第四個(gè)發(fā)明目的是提供一種康氏木霉纖維素酶阻遏相關(guān)的蛋白&，該康氏木霉的蛋白R(shí)7分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，即蛋白R(shí)7的存在下將影響或抑制纖維素酶的分泌或活性。其中，康氏木霉胞外活性蛋白^不具有纖維素酶系中的內(nèi)切酶、外切酶以及P_葡萄糖苷酶水解特性，但確實(shí)為纖維素酶阻遏相關(guān)的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，該R7蛋白的制備方法如下如前所述，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基與強(qiáng)阻遏培養(yǎng)基(葡萄糖5.0g)進(jìn)行培養(yǎng)康氏木霉菌，收集纖維素酶濃縮液后，以4%8%凝膠梯度進(jìn)行變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離，最終得到不具有內(nèi)切酶、外切酶以及P-葡萄糖苷酶水解特性的纖維素酶阻遏相關(guān)的7蛋白，其中該R7蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定為分子量43KD的單肽鏈，其分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，若培養(yǎng)基中葡萄糖為0g，R7含量小于5iig/100ml(粗酶液)，纖維素酶總活力(濾紙酶活力，filterp即eractivity)大于3.OOIU/ml(粗酶液)；若葡萄糖大于4.Og，則R7含量為大于30yg/100ml，纖維素酶總活力小于0.48IU/ml。附圖l，來(lái)源于誘導(dǎo)培養(yǎng)基和阻遏培養(yǎng)基(葡萄糖2.0g)的纖維素酶酶系的活性電泳分析?；钚阅z梯度4%8%，上樣量為10iU/孔，Lanel3為阻遏培養(yǎng)基中纖維素酶濃縮液，Lane46為誘導(dǎo)培養(yǎng)基中纖維素酶濃縮液。Pl，p2，p3，p4，p5，p6，p7，p8以及Pl。為纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白。附圖2，來(lái)源于誘導(dǎo)培養(yǎng)基與阻遏培養(yǎng)基(葡萄糖5.0g，強(qiáng)阻遏)中纖維素酶酶系的活性電泳分析。活性凝膠梯度為4%8%，上樣量為lOiU/孔，Lanel4為誘導(dǎo)培養(yǎng)基中纖維素酶濃縮液，Lane58為阻遏培養(yǎng)基中纖維素酶濃縮液，R7為纖維素酶阻遏相關(guān)蛋白。附圖3，"變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離法"——切膠定位。第一、三、五部分分別為L(zhǎng)anel2，Lane1011，Lane1920，用于染色；第二、四部分分別為L(zhǎng)ane39，Lane1218，用于活性蛋白回收。附圖4，"變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離法"——切膠回收活性蛋白，第一、三、五部分分別為L(zhǎng)anel2，Lanel011，Lanel920，用于染色；第二、四部分分別為L(zhǎng)ane39，Lanel218，用于活性蛋白回收。附圖5，活性蛋白的水解性能薄層色譜分析——13-葡萄糖苷酶測(cè)定。LaneM標(biāo)樣分別為G1葡萄糖，G2纖維二糖，G3纖維三糖，G4纖維四糖。Lanel10依次為PlPl。水解纖維二糖的水解產(chǎn)物。薄層色譜展層液為正丁醇醋酸水=2:i:i(體積比)，噴霧苯胺和二苯胺IO(TC顯色。附圖6，纖維素酶水解機(jī)理。技術(shù)效果1.本發(fā)明提供一種新的纖維素酶系分類(lèi)法，對(duì)傳統(tǒng)的纖維素酶系分類(lèi)提出挑戰(zhàn)，為深入研究該菌株的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)提供理論依據(jù)；2.本發(fā)明為該菌株構(gòu)建基因工程菌提供可靠信息，為該菌株的纖維素酶代謝調(diào)控提供理論指導(dǎo)；3.本發(fā)明還可為其他菌株的纖維素酶系的研究提供參考；4.本發(fā)明為微生物多酶體系的分離純化提供具體可行方案。具體實(shí)施方案下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類(lèi)似實(shí)例。實(shí)施例1:康氏木霉(Trichodermakoningii)的獲得，康氏木霉(Trichodermakoningii)可以選用已公開(kāi)的各種康氏木霉菌株，例如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200610155028.8于2007年6月27日公開(kāi)的康氏木霉(Trichodermakoningii)ZJU-TCGMCCNo.18;也可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化菌株，例如購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該菌株保藏號(hào)AS3.2774;或使用實(shí)驗(yàn)室自行保藏的菌株。實(shí)施例2:康氏木霉(Trichodermakoningii)纖維素酶的代謝調(diào)控固體發(fā)酵纖維素酶。無(wú)菌條件下，將康氏木霉分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方為碳源(稻草粉8.0g，誘導(dǎo)物)，氮源(麩皮4.0g)，水20ml，自然pH)、阻遏培養(yǎng)基18(配方為:碳源(稻草粉8.0g)，氮源(麩皮4.0g)，葡萄糖2.0g(阻遏物)，水20ml，自然pH)、阻遏培養(yǎng)基2a(配方為:碳源(秸稈粉8.0g)，氮源(麩皮4.0g)，葡萄糖5.0g(阻遏物)，水20ml，自然pH)中，在2830°C固體發(fā)酵4.05.0天，每天翻動(dòng)一次發(fā)酵曲(無(wú)菌操作)，以便通風(fēng)換氣，獲得3組不同代謝調(diào)控下的纖維素酶。實(shí)施例3:纖維素酶的提取。將誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及阻遏培養(yǎng)基的發(fā)酵曲，分別用100mlpH4.8檸檬酸緩沖液浸提1小時(shí)，紗布擠壓過(guò)濾，濾液用12000g離心力離心20分鐘，獲得粗酶液。然后分別用飽和度為20%80%硫酸銨沉淀，G25凝膠脫鹽，溫度低于45t:條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10倍或者低溫凍干濃縮，獲得3組不同代謝調(diào)控下的纖維素酶濃縮液。實(shí)施例4:康氏木霉纖維素酶系組分的確定。將纖維素酶濃縮液(包括誘導(dǎo)與阻遏)。分別上樣4%8%的凝膠梯度，每孔10iU樣品，使用北京六一儀器化工廠的DYCZ-24A電泳系統(tǒng)，凝膠的尺寸大小為長(zhǎng)X寬X厚，大于或等于150X150XI.Omm，上樣孔數(shù)量共計(jì)每塊20孔，在fC條件下，濃縮膠電泳的電壓為80IOOV，電流為2030mA;分離膠的電壓為180200V，電流<30mA;電泳緩沖液為pH8.8，12.5mmo1/1Tris-glycin96mmo1/1;電泳時(shí)長(zhǎng)1012h，電泳膠用11CoomassiebrilliantblueR-250染色和固定，以及10%醋酸和20%甲醇脫色劑脫色。經(jīng)上述電泳分離，獲得一組纖維素酶酶系差異條帶，如附圖1所示，Lane13為阻遏培養(yǎng)基(葡萄糖2.0g)的胞外電泳條帶，Lane46為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的胞外蛋白電泳條帶。在阻遏培養(yǎng)基中，由于阻遏培養(yǎng)基中含2%的葡萄糖，作為纖維素酶酶解纖維素的最終產(chǎn)物，葡萄糖通過(guò)末端產(chǎn)物阻遏纖維素酶酶系的分泌，康氏木霉直接利用環(huán)境中的葡萄糖，供給自身生長(zhǎng)繁殖的需要。附圖l所示Lane46為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的胞外蛋白電泳條帶，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，稻草粉誘導(dǎo)康氏木霉分泌了大量的纖維素酶。比較分析二者的差異，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的胞外蛋白Pl，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8以及Pl。共9個(gè)組分比阻遏培養(yǎng)基的胞外電泳條帶明顯，而P9卻沒(méi)有差異，由此可以確認(rèn)P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8以及P1Q為康氏木霉的纖維素酶系誘導(dǎo)相關(guān)組分，各組分的功能在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)。實(shí)施例5:纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分的確定。如附圖2所示，Lane14為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的胞外電泳條帶，Lane58為阻遏培養(yǎng)基(葡萄糖5.0g，強(qiáng)阻遏)的胞外蛋白電泳條帶，其他實(shí)驗(yàn)方法如上。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，由于稻草粉中含有纖維素，誘導(dǎo)康氏木霉分泌大量的纖維素酶。而在阻遏培養(yǎng)基中，由于阻遏培養(yǎng)基中含5%的葡萄糖，葡萄糖作為纖維素酶酶解纖維素的最終產(chǎn)物，通過(guò)末端產(chǎn)物阻遏纖維素酶酶系的分泌，康氏木霉直接利用環(huán)境中的葡萄糖，供給自身生長(zhǎng)繁殖的需要。比較分析二者的差異，阻遏培養(yǎng)基的胞外蛋白R(shí)7，比誘導(dǎo)培養(yǎng)基的胞外電泳條帶明顯，由此可以初步確認(rèn)R7為康氏木霉纖維素酶系阻遏相關(guān)的蛋白組分，其功能尚須進(jìn)一步確認(rèn)。實(shí)施例6:康氏木霉的纖維素酶相關(guān)蛋白逐個(gè)純化按圖3所示對(duì)纖維素酶濃縮液(誘導(dǎo))進(jìn)行電泳分離，每孔上樣10iU，第一循環(huán)中采用4%8%活性梯度膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠縱向切為五個(gè)部分，各相鄰膠片間斜向切下若干切痕標(biāo)記定位(考慮到染色后凝膠會(huì)明顯變長(zhǎng)，以消除誤差)。第一、三、五部分分別為L(zhǎng)anel2，Lane1011，Lane1920，用于染色，染色及脫色溫度為5060°C，時(shí)間控制在40分鐘以內(nèi)(盡量縮短時(shí)間，防止蛋白條帶彌散)。第二、四部分分別為L(zhǎng)ane39，Lanel218，用于活性蛋白回收。蛋白質(zhì)回收的具體操作是將已染色的第一、三、五部分的膠條拼回第二、四部分膠條中，對(duì)齊斜向切口，依次橫向切下相應(yīng)蛋白條帶(如附圖4)，膠條分別裝進(jìn)透析袋中、加入適量電極緩沖液，密封，置入電泳槽的陰極進(jìn)行電泳洗脫2-3h，完畢，用10mM，pH4.8檸檬酸緩沖液透析，收集透析內(nèi)液，于-4(TC條件下凍干，供第二次循環(huán)使用。在第二次循環(huán)純化時(shí)，應(yīng)調(diào)整凝膠梯度，如PpP2，P3以及P4使用4%7%梯度膠，而P7，P8以及Pl。使用5%10%梯度膠，其他操作同第一次循環(huán)的步驟。此法適用于阻遏蛋白R(shí)7的分離純化。最后獲得電泳純度的康氏木霉胞外活性蛋白，包括纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白和纖維素酶阻遏相關(guān)蛋白。實(shí)施例7:康氏木霉纖維素酶酶系的確定和功能鑒定。(1)P-葡萄糖苷酶(BG)功能的確定，將已純化為電泳純的康氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白Pl，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8以及Pl。(微克級(jí))分別在5(TC催化水解纖維二糖溶液(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液溶解)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中有葡萄糖，則判定該活性蛋白為P-葡萄糖苷酶(BG)，結(jié)果如附圖5所示P3，P4，Pp分別為BG工，BG2，BG3。(2)外切酶(CBH)功能確定，將已純化為電泳純的康氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白Pl，p2，p3，p4，p5，p6，p7，p8以及Pl。(微克級(jí))分別在5(TC催化水解對(duì)硝基纖維二糖苷或纖維素(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液溶解)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中只有纖維二糖而沒(méi)有葡萄糖，則判定該活性蛋白為外切酶，結(jié)果表明，P8、Pl。為外切酶，分別為CBHpCBH2。(3)內(nèi)切酶(EG)的功能確定，將已純化為電泳純的康氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白Pl，p2，p3，p4，p5，p6，p7，p8以及Pl。(微克級(jí))分別在50。C催化水解纖維素(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性測(cè)定，再經(jīng)3，5二硝基水楊酸定量檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中有還原糖產(chǎn)生卻沒(méi)有纖維二糖和葡萄糖產(chǎn)生，則判定該活性蛋白為內(nèi)切酶，結(jié)果表明，P5，P6為內(nèi)切酶，分別為EG15EG2。(4)其他纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的測(cè)定，按本實(shí)例中纖維素酶水解性能鑒定方法測(cè)定，Pi，P2的纖維素酶系中的內(nèi)切酶、外切酶以及e-葡萄糖苷酶水解特性不明顯，但確實(shí)為纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白。(5)纖維素酶阻遏蛋白的鑒定，經(jīng)纖維素酶水解性能測(cè)定，R7不具有纖維素酶系中的內(nèi)切酶、外切酶以及e-葡萄糖苷酶水解特性，但確實(shí)為纖維素酶阻遏相關(guān)的蛋白，命名為纖維素酶阻遏蛋白R(shí)7。該蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，該蛋白為單肽鏈，分子量為43KD，康氏木霉的R7分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。實(shí)施例8:蛋白R(shí)7分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)的功能鑒定無(wú)菌條件下，將康氏木霉分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方為碳源(稻草粉8.0g，誘導(dǎo)物)，氮源(麩皮4.0g)，水20ml，自然pH)，阻遏培養(yǎng)基(配方為:碳源(稻草粉8.Og)，氮源(麩皮4.Og)，葡萄糖^2.0g(阻遏物)，水20ml，自然pH)，在2830°C固體發(fā)酵4.05.0天，每天翻動(dòng)一次發(fā)酵曲(無(wú)菌操作)，以便通風(fēng)換氣，獲得不同代謝調(diào)控下的纖維素酶。根據(jù)前述方法，通過(guò)在不同葡萄糖濃度的阻遏培養(yǎng)基和相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的纖維素酶液，進(jìn)行酶活性測(cè)試，以鑒定蛋白R(shí)7分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)的功能。表1:粗酶液中R7含量和纖維素酶總活力阻遏培養(yǎng)基的葡萄糖量(g)粗酶液中R7含量(ug/100ml)纖維素酶總活力(IU/ml)033.582131.815340.48結(jié)果如表1所示，使用常規(guī)方法(Filterpaperactivity)檢測(cè)不同代謝調(diào)控下獲得的不同&含量和纖維素酶總活力的關(guān)系，其中隨著酶液中^含量的增加，纖維素酶總活力出現(xiàn)線性下降，表明，該康氏木霉的蛋白&分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，即蛋白R(shí)7的存在下將影響或抑制纖維素酶的分泌或活性，進(jìn)一步證明了康氏木霉胞外活性蛋白R(shí)7不具有纖維素酶系中的內(nèi)切酶、外切酶以及P-葡萄糖苷酶水解特性，但確實(shí)為纖維素酶阻遏相關(guān)的蛋白。參考文獻(xiàn)13[l]MeiselC.etal.FoodBiotechnology.1989(3)，145155.[2]高潔等，纖維素科學(xué)，北京，科學(xué)出版社，1996.[3]PercivalE.etal.StructuralCarbohydratelChem，London,GarnetMillerLtd,1962，163.[4]DuretteP.etal.Advan.Carboh.Chem.1971(26)，490502.[5]MarchessaultR.H.etal.Advan.Carboh.Chem.1967(22)，421.[6]SelbyK.Advan.Chem.Ser.1969(95)，3450.[7]WoodT.M.etal.Biotech.Bioeng.S卿.1975(5)，111137.[8]WoodT.M.etal.Biochem.J.1972(128)，11831192.[9]ErikaaonK.E.etal.Biotech.Bioeng.1978(20)，317332.[10]ReeseiE.T.Biotech.Bioeng.Symp.1976(6)，920.[11]鐘發(fā)剛，王新華，飼用纖維素酶研究進(jìn)展.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志.2002(5)，308309.[12].Petterssonetal.Proceedingsofthe4thInternationalFermentationSymposium:Fermentationtechnology,Japan.1972:727729.[13]Mandels，M.J.etal.Appl.Microbiol.1971，21:152.[14]MandelsM.etal.GrowthandCellulaseProductionbyTrichoderma.Technical.Res.Cent.1975:81110[15].Wood,T.M.Biotechnol.Bioemg.symp.No.5:1975，111137.[16]中國(guó)科學(xué)院微生物所纖維素酶組.微生物學(xué)報(bào).1976(3)，240248.[17]汪天虹，吳靜，鄒玉霞，氏木霉分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng).2000，19(1)，147152.[18]KimJ.0.etal.Cloningandcharacterizationofthermostableendoglucanase(Cel8Y)fromthehypertthermophilicAquifexaeolicusVF5[J].Biochem.Biophy.Res.Commu.2000，279(2)，420426.[19]HakamadaY.，EndoK.，TakizawaS.，etal.Enzymaticproperties,crystallization,anddeducedaminoacidsequenceofanalkalineendoglucanasefromBacilluscircul雄[J].Biochim.Biophy.Acta.2002，1570:174180.[20]ShouT.OverproductionofrecombinantTrichodermareeseicellulasesbyAspergillusoryzaeandtheirenzymaticproperties.J.Biotech.1998(65)，16371.[21]肖志壯，王婷，汪天虹，等.瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá)[J].微生物學(xué).2001,41(4)，391396.[22]BhatM.K.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology.Biotech.Advan.2000(18)，355383[23]周正紅，賈宗劍，高孔榮，纖維素酶在食品發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用及前景.暨南大學(xué)學(xué)報(bào).1998(5)，125130.[24]云秀芳，纖維素酶在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用研究.中國(guó)調(diào)味品.2001(3)，15-19[25]朱元招，劉亞力，陳宏等.補(bǔ)飼不同配方酶制劑對(duì)斷奶犢牛生產(chǎn)性能的影14響中國(guó)草食動(dòng)物2001(3)121125.[26]席興軍，韓魯佳，原慎一郎等.添加乳酸菌和纖維素酶對(duì)玉米秸稈青貯飼料品質(zhì)的影響中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2003，8(2)，2124.[27]林開(kāi)江，阮麗娟，王龍英等.纖維素酶及其在生物拋光上的應(yīng)用.生物技術(shù)1996(3)，4548.[28]費(fèi)云山，梅卓然，王榮生.酶洗滌中纖維素酶的作用方式與途徑的探討.印染1994(9)，510.[29]趙玉林，陳中豪，王福君.纖維素酶在造紙工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展纖維素酶在造紙工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展.生物技術(shù).2003(3)，6466[30]陳冠軍，秦夢(mèng)華，曲音波等.纖維素酶脫墨機(jī)理的研究進(jìn)展.生物工程進(jìn)展.2001(3)，1722.[31]杜宗軍.色葡萄狀穗霉纖維素酶的純化和性質(zhì)[J]，青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào).2002,32(1)，7984.[32]李軍輝.糖蜜酒精廢液誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶及其誘導(dǎo)活性因子的分離鑒定.廣西大學(xué)論文集.2001，5.[33]Herma皿Schagger.ElectrophoreticIsolationofMembraneProteinsfromAcrylamideGels.Appl.Biochem.Biotech.1994(48)，185203。[34]DavidA.etal.PreparativePurificationofTrichodermareesei.Nativeand'Core'CellobiohydrolasebyElectrophoresisandChromatofocusing.Appl.Biochem.Biotech.1991(28/29)386376。權(quán)利要求一種用于康氏木霉(Trichodermakoningii)生產(chǎn)纖維素酶系的培養(yǎng)基，包括(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基碳源為稻草粉、甘蔗渣或秸稈，氮源為麩皮、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨或氯化銨，水20ml，其中稻草粉作為誘導(dǎo)物；(2)阻遏培養(yǎng)基葡萄糖0.5-10g，碳源為稻草粉、甘蔗渣或秸稈，氮源為麩皮、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨或氯化銨，水20ml，其中葡萄糖作為阻遏物；其中碳源和氮源質(zhì)量以確保物質(zhì)所含的碳元素氮元素量之比為10～30∶1；由于在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)康氏木霉分泌了大量的纖維素酶，而阻遏培養(yǎng)基中含葡萄糖，作為纖維素酶酶解纖維素的最終產(chǎn)物，葡萄糖通過(guò)末端產(chǎn)物阻遏纖維素酶酶系的分泌，使得康氏木霉直接利用環(huán)境中的葡萄糖，供給自身生長(zhǎng)繁殖的需要。2.權(quán)利要求1中的培養(yǎng)基，其中碳源為8.Og，氮源選自4.0g的麩皮，或選自0.5-2g的酵母膏、蛋白胨、硫酸銨或氯化銨。3.權(quán)利要求1或2的培養(yǎng)基，其中葡萄糖O.5-1.5g為低阻遏濃度，1.5-4.5g為中阻遏濃度，4.0-10.0g為高阻遏濃度，所述康氏木霉(Trichodermakoningii)菌株優(yōu)選購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心、保藏號(hào)AS3.2774的菌株。4.利用權(quán)利要求1-3的培養(yǎng)基生產(chǎn)纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分或纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分的方法，包括(1)無(wú)菌條件下，在250ml三角瓶中分別制備上述無(wú)菌的纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基或纖維素酶阻遏培養(yǎng)基，再分別接種康氏木霉菌株，在283(TC發(fā)酵4.05.0天，每天翻動(dòng)一次培養(yǎng)基發(fā)酵曲以便通風(fēng)換氣；(2)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基、阻遏培養(yǎng)基的發(fā)酵曲，分別用100mlpH4.8緩沖液浸提、過(guò)濾；(3)將濾液以12000g離心，獲得粗酶液；(4)分別用飽和度為20%80%硫酸銨沉淀粗酶液，并在低于45°C條件下進(jìn)行S印hadexG25凝膠脫鹽；(5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或者低溫凍干濃縮，以獲得纖維素酶濃縮液，其中濃縮液中富含纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分或纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分；其中，康氏木霉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分泌較多、而在阻遏培養(yǎng)基中分泌較少甚至沒(méi)有的胞外差異蛋白，所述的胞外蛋白為纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)蛋白組分；康氏木霉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分泌較少甚至沒(méi)有、而在阻遏培養(yǎng)基分泌較多的胞外差異蛋白，所述的胞外蛋白為纖維素酶系阻遏相關(guān)蛋白組分。5.權(quán)利要求4的方法，其中步驟(2)中用100mlpH4.8緩沖液浸提發(fā)酵曲lh，紗布擠壓過(guò)濾；步驟(3)通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或者低溫凍干以濃縮10倍體積。6.—種在不同的代謝控制條件下鑒定康氏木霉生產(chǎn)的纖維酶系差異蛋白的方法，包括1)根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，配制誘導(dǎo)或阻遏培養(yǎng)基，并培養(yǎng)康氏木霉菌株，以生產(chǎn)纖維酶系的差異蛋白；2)采用變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離法來(lái)分離純化纖維素酶系各組分差異蛋白，即用4%8%活性梯度膠對(duì)纖維素酶粗酶液樣品進(jìn)行電泳、切膠、凝膠染色定位、切分目的蛋白條帶、電泳洗脫、透析、凍干，分別獲得纖維素酶純酶液的多種蛋白樣品；3)根據(jù)低遷移率的蛋白或高遷移率的待純化蛋白，以4%7%的凝膠梯度或5%10%的凝膠梯度，對(duì)步驟2)的樣品中的一種蛋白再次進(jìn)行變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離，最終獲得純化的單一活性蛋白樣品；4)對(duì)所得的活性差異蛋白進(jìn)行功能鑒定活性蛋白將纖維二糖的水解為葡萄糖一類(lèi)水解酶的差異蛋白是e-葡萄糖苷酶，其底物還可以是對(duì)硝基葡萄糖苷；活性蛋白將纖維素水解產(chǎn)生纖維二糖的一類(lèi)水解酶的差異蛋白是外切酶，其底物可以是纖維素；活性蛋白將纖維素水解產(chǎn)生寡聚纖維素或可溶性低聚糖的一類(lèi)水解酶的差異蛋白是內(nèi)切酶，其底物可以是纖維素或羧甲基纖維素。7.權(quán)利要求6的方法，其中用于第1次電泳的濃縮膠的電泳電壓為80100V，電流為2030mA;用于第2次電泳的分離膠的電壓為180200V，電流<30mA;電泳緩沖液為pH8.8，12.5mmo1/1Tris-glycin96mmo1/1，電泳溫度為4°C。8.權(quán)利要求6或7的方法，其中在步驟4)的活性差異蛋白的功能鑒定中將微克級(jí)的已純化為電泳純的活性蛋白在5(TC催化水解纖維二糖溶液(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液溶解)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中有葡萄糖，則判定該活性蛋白為P-葡萄糖苷酶(BG);或?qū)⑽⒖思?jí)的已純化將已純化為電泳純的活性蛋白在5(TC催化水解對(duì)硝基纖維二糖苷或纖維素(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液溶解)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中只有纖維二糖而沒(méi)有葡萄糖，則判定該活性蛋白為外切酶；或?qū)⑽⒖思?jí)的已純化將已純化為電泳純的活性蛋白在5(TC催化水解纖維素(0.lmM，pH4.8檸檬酸的緩沖液)24小時(shí)以上，經(jīng)薄層色譜定性測(cè)定，再經(jīng)3，5二硝基水楊酸定量檢測(cè)產(chǎn)物，若產(chǎn)物中有還原糖產(chǎn)生卻沒(méi)有纖維二糖和葡萄糖，則判定該活性蛋白為內(nèi)切酶。9.一種康氏木霉纖維素酶阻遏相關(guān)的蛋白&，其制備方法如下根據(jù)權(quán)利要求8的方法，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基與阻遏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)康氏木霉菌，收集纖維素酶濃縮液后，以4%8%凝膠梯度進(jìn)行變凝膠梯度雙循環(huán)電泳分離，最終得到不具有內(nèi)切酶、外切酶以及P_葡萄糖苷酶水解特性的纖維素酶阻遏相關(guān)的7蛋白，其中該R7蛋白經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定為分子量43KD的單肽鏈，其分泌在量上與纖維素酶的分泌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。10.權(quán)利要求9所述的蛋白&，其中當(dāng)粗酶液中R7含量小于5iig/100ml時(shí)，纖維素酶總活力大于3.00IU/ml;當(dāng)R7含量為大于30iig/100ml時(shí)，纖維素酶總活力小于0.48IU/ml。全文摘要本發(fā)明提供一種用于康氏木霉(Trichodermakoningii)生產(chǎn)纖維素酶系的培養(yǎng)基。還提供一種利用所述的培養(yǎng)基在不同的代謝控制條件下分離并鑒定康氏木霉纖維酶系的差異蛋白的方法，包括培養(yǎng)康氏木霉菌株以生產(chǎn)纖維酶系的差異蛋白、采用變凝膠梯度雙循環(huán)電泳來(lái)分離純化纖維素酶系各組分差異蛋白的單一樣品、對(duì)所得的活性差異蛋白進(jìn)行功能鑒定，以鑒定所得的差異蛋白組分是否屬于β-葡萄糖苷酶、外切酶或內(nèi)切酶。本發(fā)明作用在于提供一種新的纖維素酶系分類(lèi)法，對(duì)傳統(tǒng)的纖維素酶系分類(lèi)提出挑戰(zhàn)，為深入研究該菌株的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)提供理論依據(jù)，同時(shí)為微生物多酶體系的分離純化提供具體可行方案。文檔編號(hào)C12R1/885GK101781642SQ200910209538公開(kāi)日2010年7月21日申請(qǐng)日期2009年10月29日優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日發(fā)明者林元山,梁智群申請(qǐng)人:林元山