專利名稱：一株用于發酵的克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于應用微生物領域，涉及一株用于發酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08及其應用。
背景技術：
隨著社會的發展，傳統利用生物質能的比例將越來越少，而現代發酵工業系利用 微生物的代謝活動經生物轉化大規模制造產品的一門工業。則這可以進一步說明現代發酵 工業體系將在今后幾十年內在以后能源體系的重要地位。現代發酵微生物實驗技術微生物 是發酵工業的根本，優良菌株是高效發酵結果的前提，生產過程中不斷強化菌種的性能是 保持技術經濟優勢的必需。而現代發酵產酒精主要是工業是以純種菌種的培養為基礎，所 以采用各種不同的篩選手段來進行菌種選育，進一步選出產量高、符合生產的各種條件的 純種，這是發酵產酒精的關鍵一步。野生菌種很適應于培養條件，并逐漸顯示出它的生長優 勢，這種優勢的發展，促使它優良的生產性能表露。進行類似新種篩選分離，達到獲得新的 優良生產菌種的目的。由于克雷伯氏菌為自然界中篩選的野生菌種，是自然界長期演化的 結果，因而相當的穩定，并且能夠適應環境，一般采用克雷伯氏菌產氫，本發明采用了利用 克雷伯氏菌分別對葡萄糖、木糖、蒸汽爆破材料酶解液進行發酵產乙醇，通過實驗，得到了 一個相對穩定、高產的產乙醇菌株。
發明內容
本發明在于提供一種能夠高產酒精的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08，并提供 該菌種的分離純化方法及對葡萄糖降解產酸和對葡萄糖或蒸汽爆破材料酶解液進行發酵 產乙醇的應用。本發明的目的是通過以下方式實現的。一株用于發酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08，其保藏號為CCTCC M 209219。所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的形態學特征如下菌落呈白色， 圓形，表面光滑、濕潤、隆起，邊緣整齊、粘液狀，菌落相互融合；細胞呈桿狀，(0. 3 1. 5) X (0. 6 6. 0)微米，呈短鏈狀排列。所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的生理生化特征如下在葡萄糖培養基 和LB培養基中均可分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培養基中可發酵葡萄糖；在溴麝香草酚 藍培養基中，以檸檬酸鈉作為碳源，產生酸性物質，菌落成藍色，且產生吲哚。所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的應用在于其能使葡萄糖降解產生酸 性物質。所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的應用在于其能對葡萄糖進行發酵產乙醇。
所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的應用在于其能對蒸汽爆破材料酶解 液進行發酵產乙醇。所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A_08的應用在于其能分別與釀酒酵母CICC 編號1517、大腸埃希氏菌CICC編號10308混合對蒸汽爆破材料酶解液進行發酵產乙醇。將菌培養12小時，用試劑盒抽提總DNA，凝膠電泳，用純化試劑盒純化，再將純化 產物進行PCR擴增，所得PCR產物進行測序。由南京金思特生物公司測序結果及在GenBank 數據庫中的BLAST結果可知此菌為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp)，該菌株的登錄號為 AY363386,16sDNA 的序列為agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc
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發明的效果或特點
由于克雷伯氏菌Klebsiella sp. A-08保藏號CCTCC M 209219，為自然界
選的野生菌種，是自然界長期演化的結果，因而相當的穩定，并且能夠適應環境，本發明利 用克雷伯氏菌在葡萄糖培養基中產生酸性物質，分別對葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液進行 發酵產乙醇，以及與釀酒酵母、大腸埃希氏菌混合對蒸汽爆破材料酶解液進行發酵產乙
4醇，足以證明克雷伯氏菌Klebsiella sp. A_08是一個相對穩定、高產的產乙醇菌株。把 Klebsiella sp. A-08與其他菌如大腸埃希氏菌、釀酒酵母混合發酵可以更好提高乙醇的產 率，而且相較于其它策略(如代謝工程)更為簡單和經濟，有利于提高資源利用率和生物 乙醇的市場競爭力，具有很好的應用前景，與其他產乙醇菌相比，克雷伯氏菌為自然界中篩 選的野生菌種，更加能夠適應環境，可以抵制酶解液中的各種不利因素的影響，若能經過改 造，能夠更加提高利用率。克雷伯氏菌Klebsiella sp. A-08保藏日期2009年10月9日保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心保藏單位簡稱CCTCC保藏號CCTCCNO :M 209219
圖1為克雷伯氏菌在顯微鏡下觀察的形狀；圖2為克雷伯氏菌落在顯微鏡下觀察的形狀；圖3為克雷伯氏菌生長pH曲線圖。
具體實施方案以下實施例旨在進一步說明本發明，而不是限制本發明。實施例1克雷伯氏菌Klebsiella sp. A-08的分離篩選。1、菌種來源長沙污水處理廠的廢水中的污泥。2、培養基及初步篩選原理、方法克雷伯氏菌能利用檸檬酸鈉作為碳源，而大腸桿菌不能，克雷伯氏菌在分解檸檬 酸鹽及培養基中的磷酸氨后，產生堿性化合物使PH值升高，在有溴麝香草酚藍指示劑的 情況下，培養基由綠色變為深藍色，溴麝香草酚藍指示范圍為pH小于6時呈黃色，pH為 6. 0-7. 6時為綠色，pH大于7. 6時呈藍色。分別取20g污泥，稀釋后接種于LB培養基，1天 后，挑取菌落接種于溴麝香草酚藍瓊脂培養基上，37°C培養72h，每天觀察，培養基由綠色變 為藍色，挑取藍色菌落，稀釋，純化。將純化后的菌種用普通LB培養基保存，完成初步篩選。 再將培養24h的菌液2ml置于5ml離心管中，再加入Iml乙醚，充分振蕩，使吲哚溶于乙醚， 靜置片刻，乙醚層浮與菌液上層然后沿離心管壁加入10滴5%的對二甲基氨基甲醛溶液， 如果有吲哚產生，則乙醚層呈現玫瑰紅色。(克雷伯氏菌屬于腸桿菌科，能夠氧化分解蛋白 胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚無色，可與對二甲基氨基甲醛結合，生成紅色的玫瑰吲哚。加 入對二甲基氨基甲醛后切勿搖動，否則紅色不明顯)。根據以上原理和方法，對初步篩選的 88株菌進行吲哚實驗，結果有22株菌呈現玫瑰紅，然后用10 %的葡萄糖液體培養基對以上 22株菌進行發酵實驗，淘汰產乙醇含量極低的菌，篩出1株編號為A08的菌株。其發酵能力 遠遠大于其他菌株，將其選為發酵所需菌種。所述的溴麝香草酚藍培養基成分為NaCl25g、MgSO4 · 7H200. 2g、(NH4)H2PO4Ig,K2H2P04lg、檸檬酸鈉5g、瓊脂12g、蒸餾水1000ml、0.2%溴麝香草酚藍溶液40ml、肌醇、 pH6.8。121°C高壓滅菌20min。其中0. 2%溴麝香草酚藍溶液用過濾滅菌。所述的普通LB培養基成分為蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl25g、瓊脂粉10g、蒸餾 水1000ml,自然pH值。所述克雷伯氏菌株A-08的形態學特征總結如下菌落呈白色，圓形，表面光滑、濕 潤、隆起，邊緣整齊、粘液狀，菌落相互融合；細胞呈桿狀，(0. 3 1. 5) X (0. 6 6. 0)微米， 呈短鏈狀排列。所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的生理生化總結特征如下在葡萄糖培 養基和LB培養基中均可分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培養基中可發酵葡萄糖；在溴麝香 草酚藍培養基中，以檸檬酸鈉作為碳源，產生酸性物質，菌落成藍色，且產生吲哚。3、克雷伯氏菌A-08生長條件A:克雷伯氏菌A-08生長pH值(圖3)用pH 梯度為 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,8. 5,9. 0、10、11、12 的 LB 液體培養基對
克雷伯氏菌進行培養，溫度37°C，轉速120r/min，培養3d。選出最佳生長pH值為7. 0。B 克雷伯氏菌A-08生長pH值的變化將菌接入pH值在3-8之間的LB液體培養基中，菌的生長會產生堿性物質，致使pH 上升，在8-12之間會產生酸性物質，致使pH值減小，pH在8時，基本保持不變，見表1。表1克雷伯氏菌A-08在LB液體培養基不同pH值條件下生長時pH值的變化
權利要求
一株用于發酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A 08，其特征在于，所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A 08的保藏號為CCTCC M 209219。
2.根據權利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08，其特征在于，所述克雷 伯氏菌株A08的形態學特征如下菌落呈白色，圓形，表面光滑、濕潤、隆起，邊緣整齊、粘液 狀，菌落相互融合；細胞呈桿狀，(0. 3 1. 5) X (0. 6 6. 0)微米，呈短鏈狀排列。
3.根據權利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08，其特征在于，所述克雷 伯氏菌株Klebsiella sp. A-08的生理生化特征如下在葡萄糖培養基和LB培養基中均可 分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培養基中可發酵葡萄糖；在溴麝香草酚藍培養基中，以檸檬 酸鈉作為碳源，產生酸性物質，菌落成藍色，且產生吲哚。
4.權利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08的應用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08降解葡萄糖產生酸性物質。
5.權利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A-08的應用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A_08對葡萄糖進行發酵產乙醇。
6.權利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08的應用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08對蒸汽爆破材料酶解液進行發酵產乙醇。
7.權利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiellasp. A_08的應用，其特征在于，所述的 克雷伯氏菌株Klebsiella sp. A-08分別與釀酒酵母CICC編號1517、大腸埃希氏菌CICC 編號10308混合對蒸汽爆破材料酶解液進行發酵產乙醇。
全文摘要
本發明涉及一種產酸且能夠利用還原糖產乙醇的新菌種克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08，保藏號為CCTCC M 209219，是從造紙廠污泥中分離的一株細菌，結合16S rRNA基因序列分析和菌株形態、生理特性分析，確定該菌株為克雷伯氏菌。利用該菌能夠降解葡萄糖生成酸性物質，還能對葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液進行發酵產乙醇，且相對穩定、高產。
文檔編號C12N1/20GK101935619SQ20091020739
公開日2011年1月5日 申請日期2009年10月20日 優先權日2009年10月20日
發明者易琳琳, 王義強, 陳介南 申請人:中南林業科技大學