專利名稱：3＇-ｏ-熒光修飾的核苷酸及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有可用化學方法除去的熒光3 ‘ -0-阻斷基團的三磷酸 核苷(3 ‘ -Ο-FL-dNTP)以及使用該物質進行的DNA測序方法(邊合成邊測序 (sequencing-by-synthesis)) 0背景技術
根據最近完成的人類基因組工程(HGP)的成功結果，可獲得人類基因組的信息。 雖然該信息包含人類基因組的共同序列，但其并未在該基因組中呈現出個體差異。為了獲 得完整的個體基因組信息，必須對個人基因組進行分析。由于單倍體人類基因組占有大約 30億個DNA堿基對，如果將迄今已被廣泛用于DNA測序的、基于毛細管電泳的Sanger方法 用于個人基因組的測序，那么為了獲得個體基因組的信息將會需要與完成HGP類似的成本 和時間(G. M Church 等人，Nature Reviews，2004，5，335-344)。自 2004 年以來，美國國家 人類基因組研究中心(NationalHuman Genome Research hstitute，NHGRI，USA)支持了能 夠使每一個體的全基因組測序成本顯著降低的技術的發展，特別是短期成本達到100，000 美元以及長期成本達到1，000美元的技術。于是，能夠以大約50，000美元的成本進行個體 全基因組測序的測序平臺目前已經商品化。這類設備基于兩個主要的技術焦磷酸測序以 及邊合成邊測序(SBS)。由454 Life Sciences，Roche公司提供的GS TLX鈦系列設備是 以焦磷酸測序技術為基礎。其可在10小時內分析4-6億個堿基并可立即對長鏈(大約200 個核苷酸)進行比較分析。而由Solexa公司提供的基因組分析器則是以SBS技術為基礎。
本發明所直接涉及到的邊合成邊測序(SBQ使用的是熒光標記的核苷酸。特別是 根據所述的技術，用聚合酶將每個核苷酸引入到DNA引物中，然后測定來自核苷酸的熒光 信號以鑒別該核苷酸的堿基并可同時分析其互補堿基(參見圖2)。
用于SBS的三磷酸核苷(dNTP)基本上為雙修飾的可逆終止子(DRT)，這些雙修飾 的可逆終止子是在三磷酸核苷的3' -OH部分具有可逆的阻斷基團(3 ‘ -0-阻斷基團)以 及在堿基上具有熒光團(FL)的修飾的三磷酸核苷(參見圖1左圖)。此時，4種堿基(A、 T、G和C)使用發出不同波長的光的不同熒光團進行標記。將目標DNA作為用于利用此類 修飾的三磷酸核苷進行聚合反應的模板。然后，一旦用DNA聚合酶將核苷酸引入到引物鏈 當中，由于所引入核苷酸的3' -0-阻斷基團的作用，其他三磷酸核苷就不能引入到這個鏈 當中。然后，對連接到所引入核苷酸堿基上的熒光團的熒光進行測定，來鑒別所引入核苷酸 的堿基，從而實現對該模板鏈的互補核苷酸序列的分析。當除去所述的熒光團和3' -0-阻 斷基團時，則重新獲得了游離的3' -OH官能團，從而使隨后的核苷酸可以引入。所引入核 苷酸的堿基可以用如上所述的相同方法進行鑒別，從而實現對模板鏈的測序。這一逐步測 序的過程被稱作“邊合成邊測序(SBS) ”。
用于商品SBS的雙修飾的可逆終止子(DRT)具有通過炔鍵連接到堿基上的熒光基 團。在這種情況下，即使將3' -0-阻斷基團和熒光基團在DRT插入和測序后除去，將熒光 基團連接到堿基上的連接鍵部分仍然殘留在上面。該殘留部分被稱作分子疤(molecularscar) 0隨著測序的進行，新聚合的鏈包含有更多分子疤。由于此類分子疤的累積降低了隨 后聚合酶的活性和保真度，導致所測序的堿基的數目受到限制。由于該問題的存在，相比于 基于焦磷酸測序的方法，SBS已知具有相對較短的讀取長度，大約25-35個堿基。因此，當 對打斷成為若干用于SBS的短片段的長鏈多聚核苷酸進行分析時，這一限制會增加分析多 核苷酸片段的錯誤機率。
要成功地進行SBS有兩個重要因素。首先，需要能夠以幾乎完全的效率引入DRT的 聚合酶。其次，3' -0-阻斷基團和連接到堿基上的熒光團必須在水溶液中以幾乎完全的效 率除去而不破壞DNA。天然的DNA聚合酶已經進化了很長時間，因而選擇性地接受具有游離 3' -OH的三磷酸核苷。因此，它們不接受在3' -OH上具有阻斷基團的底物。在早期的研 究中，Sarfati等人在1994年報道了用多種聚合酶(AMV逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶和DNA聚 合酶I的Klenow片段)將具有3' -0-鄰氨基苯甲酸酯(ester anthranylic)阻斷基團的 三磷酸核苷引入到DNA鏈中，然后通過利用酯酶切斷酯鍵來繼續聚合反應，從而重新獲得 游離的 3' -OH 官能團(Sarfati 等人，Gene，1994，148 :1-6)。同年，Μ. L. Metzker 等人報道 了他們可以觀察到在聚合酶(AMV逆轉錄酶、M-MuLV逆轉錄酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、 測序酶、Bst DNA聚合酶、AmpliTaq DNA聚合酶、Vent (exo_) DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶 以及Pfu(eX0-)DNA聚合酶)的作用下，包含連接有不同阻斷基團的3' -OH基團的三磷酸 核苷的插入，因此，可通過某些聚合酶插入具有3' -0-甲基和3' -0-(2-硝基芐基)的三 磷酸核苷，從而暫時終止聚合反應(M. L. Metzker等人，Nucleic Acids Research, 1994,22 4259-4267)。然而，就進行連續聚合的效率和保真度而言，上述現有技術并不適用于SBS。
聚合酶不能接受具有大體積的3' -0-阻斷基團的三磷酸核苷作為反應底物的原 因可通過在天然聚合酶的活性部位中僅為3' -OH基團提供狹窄的空間進行解釋(Burgess 等人，A Chemistry European Journal，1999，5 :951-960)。為了用具有 3' -0-阻斷基 團的三磷酸核苷廣泛地進行SBS，需要適當修飾的聚合酶，該聚合酶在其活性部位中在 3' -OH基團周圍具有較大的空間。最近，哥倫比亞大學Ju教授的小組用3' -0-烯丙基 化的三磷酸核苷和3' -0-疊氮甲基化的三磷酸核苷進行了 SBS (Seo等人，PNAS,2005, 102 :5926-5931 ;Guo 等人，PNAS，2008，105 :9145-9150)。為了插入此類具有 3' -0-阻斷 基團的核苷酸，上述小組使用了收集自東太平洋火山口的菌株中獲得的修飾DNA聚合酶 (Southworth等人，PNAS，1996，93 =5281-5285)。該修飾的DNA聚合酶目前在市面上有售，其 商標名禾爾為"Therminator II，，，由 New England Biolabs Inc.提供。HelicosBiosciences Corp.的Kwiatkowski等人設計了 3 ‘ -0-烴基二硫甲基三磷酸核苷用于SBS (Kwiatkowski 等人，2007，US20077279563)，而 Caliper LifeSciences, Inc.的 Parce 等人使用了包含磷 酸酯基團或氨基甲酸酯基團的阻斷基團(Parce等人，2006，US20067105300)。
如果SBS能夠不用雙修飾的可逆終止子而是利用單修飾的可逆終止子(MRT)，其 中在3' -OH基團上的該可逆阻斷基團起到雙重作用，既作為熒光信號的報道子又作為可 逆終止子，那么將不再需要核苷堿基(nucleobase)上的熒光標記。在從3' -OH部分除去 熒光阻斷基團后，MRT能夠隨即轉變回自然狀態而沒有殘留的分子疤(參見圖1右圖)。然 而，這一使用MRT和常規的聚合酶進行測序的原理尚未實現。
本發明的發明者證實能夠按如下過程成功地進行SBS，從而完成了本發明(1) 設計具有既起到阻斷基團作用又能夠發出熒光信號的化學結構的MRT，該化學結構位于其3' -OH基團而非堿基，以及(2)用常規的聚合酶插入所述的MRT —通過識別3' -0-熒光 阻斷基團的熒光信號進行測序一除去所述的熒光阻斷基團一再次插入所述的MRT(參見圖 2)。發明內容
本發明的目的是為了提供一種單修飾的可逆終止子(MRT)以及使用該物質進行 測序的方法(邊合成邊測序)，所述的可逆終止子為在其3' -OH基團處具有可用化學方法 除去的、能夠發出熒光信號的可逆阻斷基團的三磷酸核苷。
為了實現上述目的，本發明提供了一種修飾的三磷酸核苷(dNTP)，所述的三磷酸 核苷在該修飾的三磷酸核苷的3' -OH基團處具有可通過物理作用或化學反應除去的可逆 熒光基團，所述的三磷酸核苷具有核糖或脫氧核糖作為糖的骨架結構。
本發明還提供了一種使用所述的核苷酸單體或其多聚體進行測序的方法。
此外，本發明提供了一種用于邊合成邊測序(SBS)的測序試劑盒，該試劑盒包含 所述的核苷酸單體或其多聚體。
參考附圖可以更好地理解對本發明的優選實施方式的應用，其中
圖1為一組圖，示意了雙修飾的可逆終止子(DRT)，該可逆終止子是用于常規的邊 合成邊測序(SBQ技術的三磷酸核苷，在該三磷酸核苷的3' -OH基團上帶有可逆阻斷基 團、且在核苷堿基上帶有熒光基團(熒光團)；圖1還示意了單修飾的可逆終止子(MRT)，該 可逆終止子是用于本發明所述的SBS的三磷酸核苷，在該三磷酸核苷的3' -OH基團上帶有 同時起到熒光信號報道子和可逆終止子雙重作用的可逆阻斷基團。
圖2為顯示邊合成邊測序(SBQ的過程的圖，包括下列步驟用聚合酶將單修飾的 可逆終止子(MRT)插入；通過測定來自熒光3' -0-阻斷基團的熒光信號進行測序；以及插 入第二個MRT。
圖3為一組圖(a)為引物在與聚合酶和MRT反應以前的MALDI-T0F質譜；(b) 為通過聚合酶使MRT延伸的引物的MALDI-T0F質譜；(c)為含有延伸的MRT的引物在從 3'端除去熒光阻斷基團后的MALDI-T0F質譜；以及(d)為含有再次延伸的MRT的引物的 MALDI-T0F質譜，所述的再次延伸是在除去熒光阻斷基團后通過聚合酶進行的(藍色圓圈 3'端的熒光阻斷基團)。
圖4為顯示通過聚合酶在引物中進行MRT延伸之前(實線)以及之后(虛線)的 熒光強度測量結果的曲線圖。
具體實施方式
以下將對本發明進行具體的描述。
本發明提供了一種新的化合物或其鹽，其具有下列式1的結構
[式1]
權利要求
1.一種核苷酸單體，所述的核苷酸單體在三磷酸核苷的3' -OH部分具有可通過物理 方法或化學方法除去的可逆熒光基團，所述的三磷酸核苷含有核糖或脫氧核糖作為糖的骨 架結構。
2.如權利要求1所述的核苷酸單體，其中所述的可逆熒光基團為熒光團本身，或是由 所述的熒光團與將所述熒光團連接到所述3' -OH部分的連接子組成。
3.如權利要求2所述的核苷酸單體，其中所述的熒光團選自于由下列物質所組成的 組香豆素、AlexaFluor, Bodipy、熒光素、四甲基羅丹明、Cy5、Cy3、得克薩斯紅以及這些物 質的衍生物。
4.如權利要求2所述的核苷酸單體，其中所述的連接子選自于由下列物質所組成的 組烷基、烯丙基、疊氮甲基、二硫基、2-硝基芐基或4-硝基芐基及其混合物。
5.如權利要求1所述的核苷酸單體，其中所述的單體包括由式2表示的化合物式2中，R1為三磷酸酯基團，R2為核苷堿基，R3為熒光團，以及R4為氫或羥基。
6.一種測序方法，所述的測序方法包括下列步驟(1)合成如權利要求1所述的核苷酸單體；(2)以目標核苷酸鏈作為模板，使用步驟(1)所述的核苷酸單體以及DNA聚合酶或RNA 聚合酶將引物延伸一個核苷酸；(3)通過測定熒光信號，對延伸后的核苷酸鏈中的堿基進行鑒別，所述的熒光信號來自 于可逆的熒光阻斷基團，所述的熒光阻斷基團連接到由步驟O)的聚合反應所產生的延伸 后的核苷酸鏈的3' -OH基團上；(4)除去來自于步驟(3)中延伸后的核苷酸鏈的可逆的熒光阻斷基團，然后復原為游 離的3' -OH基團，從而繼續進行聚合反應；以及(5)重復步驟( 至步驟G)，從而對目標模板進行測序。
7.如權利要求6所述的測序方法，其中步驟(2)中所述的模板核酸鏈選自于由基因組 DNA、質粒和寡聚核苷酸所組成的組。
8.如權利要求6所述的測序方法，其中步驟(2)所述的聚合酶選自于由嗜熱聚合酶、嗜 溫聚合酶及其突變體所組成的組。[式2]
9.如權利要求6所述的測序方法，其中步驟(3)中所述的熒光信號通過下列方法進行 測定測量固定有所述模板的雙鏈DNA和引物的固相的熒光或測量含有所述雙鏈DNA的溶 液的熒光。
10.如權利要求6所述的測序方法，其中步驟(4)中所述的可逆熒光基團優選通過使用 化學試劑或酶或照射的方法除去。
11.一種用于邊合成邊測序(SBQ的試劑盒，所述的試劑盒含有如權利要求1所述的核 苷酸單體或其多聚體。
全文摘要
本發明涉及一種使用在其3′-OH端帶有熒光阻斷基團的三磷酸核苷作為可逆終止子進行DNA測序的方法。進一步地講，本發明涉及使用單修飾的可逆終止子(MRT)進行邊合成邊測序的方法，這種新的核苷酸單體在其3′-OH端具有可用化學方法或酶方法除去的可逆的熒光阻斷基團。本發明的測序方法通過用該核苷酸單體終止核苷酸鏈的延伸，然后測定由3′-OH端所發出的熒光信號從而促進了所插入堿基的測序。此時，在對熒光信號進行分析后，連接到3′-OH端的阻斷基團被可有效地除去，這表明可以成功復原游離的3′-OH官能團，以使隨后的單體插入成為可能，從而可以進行連續的測序。
文檔編號C12Q1/68GK102030792SQ200910205998
公開日2011年4月27日 申請日期2009年12月2日 優先權日2009年9月29日
發明者安大魯, 安熙喆, 申東潤 申請人:韓國科學技術研究院