專利名稱：：一種提取蘇云金芽胞桿菌大質粒dna的方法
技術領域：
：本發明涉及一種提取蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA的方法。
背景技術：
：蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在自然界中廣泛存在，生活環境具有極強多樣性，存在于土壤、昆蟲、倉儲農產品、綠色植物葉表以及水棲環境中。Bt可以產生對多種農業害蟲有毒性的晶體蛋白(Insecticidalcrystalprotein,ICP)，是目前世界上使用范圍最廣、應用最成功的微生物殺蟲劑，其殺蟲基因已成功地應用到轉基因抗蟲植物中，是轉基因抗蟲植物主要的基因來源。目前已經發現Bt對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食蟲目等多種昆蟲具有殺蟲活性。ICP蛋白由cry或cyt基因編碼，除極少數cry基因定位于染色體DNA上，絕大部分毒蛋白是由Bt質粒上的基因編碼的。同時，這些質粒還編碼蘇云金素、13"&-外毒素、殺蟲晶體蛋白的調節基因以及結合轉移相關基因。蘇云金芽胞桿菌一般含有1-17個內生質粒，包括含有殺蟲晶體蛋白的質粒以及一些沒有明顯表型特征的隱含質粒，這些質粒大小在2-80MD之間。由于不同分子量的質粒電泳遷移率不同，Bt內生質粒模式可以通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。對Bt質粒的分析，可以用來定位蘇云金芽胞桿菌質粒編碼的cry基因等功能基因，并研究質粒在不同菌株或不同種之間轉移的特點。因此，清晰準確的Bt質粒圖譜對菌株的鑒定以及質粒缺失突變株的分析研究有極其重要的作用。同時，高質量的質粒DNA是構建DNA文庫與克隆質粒編碼基因的前提條件。目前用于細菌質粒DNA抽提的方法不少，如常規的堿裂解法、SDS裂解法等，但蘇云金芽胞桿菌屬于革蘭氏陽性菌，胞壁較厚，多數易形成芽孢，而且含有的質粒大多是低拷貝的大質粒，使用常規的質粒提取方法實驗結果不理想。DNA純化試劑盒一般只適合于0.5-20kb的質粒，而且成本高，不適合大量使用。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于提供一種提取蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA的方法，以解決現有提取方法存在的質粒DNA質量低、產量不高、重復性差等缺陷。本發明利用普通瓊脂糖凝膠電泳即可分析Bt的大質粒圖譜、且操作簡便、安全、質粒圖譜清晰、重復性好，為蘇云金芽胞桿菌分子生物學研究創造了有利條件，可同時適用于多種革蘭氏陽性細菌質粒DNA的提取。為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案來實現—種提取蘇云金芽胞桿菌質粒DNA的方法，包括以下步驟1)菌體的培養與收集挑取蘇云金芽胞桿菌的單菌落于5-10mlLB液體培養基中，3(TC振蕩培養過夜，lwt%轉接到50-100ml新鮮LB液體基中繼續振蕩培養，至細菌生長密度為0D6。。=0.9-1.l，收集約80-120mg菌體于1.5ml離心管中。2)原生體的制備向收集的菌體中加入1-1.2ml預冷的溶液A懸浮細胞，12000g離心，去上清，菌體重懸于200-300ii1溶液B，37。C溫育1.5-2h。3)細胞的裂解和質粒的提取向制備好的原生質體中加入200-300iU溶液C，緩慢混勻，68t:處理10min，裂解細胞；向裂解液中加入100-150yl溶液D，輕輕混勻，于-20。C中放30min;4。C12000g離心20min，將上清液轉移至新1.5ml離心管內，加入lml無水乙醇，-2(TC過夜；4°C12000g離心20min，棄上清，70wt^乙醇洗滌沉淀，真空干燥沉淀；加入200ii1無菌純水溶解沉淀。4)質粒的純化向上述DNA溶液中加入150-250y1的溶液E，輕輕混勻；再加入150-250ii1的Tris飽和酚，輕輕混勻；加入150-250y1的氯仿/異戊醇(體積比1:1)，輕輕混勻；12000g離心3min，小心將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入800ia無水乙醇，輕輕混勻，室溫放置5min;12000g離心10min，棄上清，70wt%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干；加入40-70ii1溶液F，室溫放置10min。其中，上述提取方法中，所述溶液A是由20-30mMTris-HCl、l-5mMEDTA、30-50mMNaCl組成，pH=8.0。所述溶液B是由溶液A中含20wt^蔗糖、2mg/ml溶菌酶和10iig/mlRNase酶組成。所述溶液C是在溶液A中加入8wt%SDS溶液。所述溶液D是3MNaAc，pH=4.8。所述溶液E是由6.0MNH4Ac和1.0mg/ml溴化乙啶組成。所述溶液F是由5.0-10.0mMTris-HCl和0.5-1.OmMEDTA組成，pH=8.0。本發明的提取方法，具有以下優點1)本發明所述的蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA提取方法操作簡單，不需要較為復雜的設備，常規分子生物學或微生物學實驗室就可完成。2)本發明所述的蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA提取方法，選擇適宜的條件進行細菌培養及合適體積的菌液進行質粒提取，可最大限度的提高提取的效率；同時提取的質粒圖譜清晰、重復性好、結構完整，A，/A，均達到了1.80，完全可以滿足常規分子生物學實驗的要求，為蘇云金芽胞桿菌分子生物學的研究創造了有利條件。3)本發明所述的蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA提取方法，應用范圍廣，同樣適用于其它革蘭氏陽性細菌大質粒DNA的提取。圖1為蘇云金芽胞桿菌質粒電泳圖，其中M為超螺旋DNA分子量標準，l為庫斯塔克亞種標準菌株HD73質粒圖譜，2為以色列亞種標準菌株Bti質粒圖譜，3為野生菌株BF6-1，4為野生菌株MD5-2。具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。1、選用材料為Bt菌株及不同的血清型標準菌株(表1)。表lBt菌株及不同血清型標準菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、試劑和儀器瓊脂糖，EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)均為上海生工生物工程公司產品；溶菌酶和RNaseA為日本TaKaRa公司產品；其它試劑均為國產分析純。凝膠電泳分析系統和凝膠成像分析系統為美國Bio-Rad公司產品。實施例1蘇云金芽胞桿菌質粒DNA的分離提取1)蘇云金芽胞桿菌的培養與收集分別挑取不同蘇云金芽胞桿菌菌株的單菌落于5mlLB液體培養基中3(TC振蕩培養過夜，lwt^轉接到50ml新鮮LB液體基中繼續振蕩培養，至細菌生長密度為0D6。。=0.9-1.l，收集5ml菌體于1.5ml離心管中。2)原生體的制備向收集的菌體中加入1.2ml預冷的溶液A懸浮細胞，4t:12000g離心5min，去上清，菌體重懸于200y1溶液B中，37"溫育1.5_2h。3)細胞的裂解和質粒的提取向制備好的原生質體中加入300溶液C，緩慢混勻，68t:處理10min，裂解細胞。向裂解液中加入150溶液D，輕輕混勻，于_20°C中放30min;4。C12000g離心20min，將上清液轉移至新1.5ml離心管內，加入lml無水乙醇，_201:過夜；4。C12000g離心20min，棄上清，70wt^乙醇洗滌沉淀，真空干燥沉淀；加入200iil無菌純水溶解沉淀。4)質粒的純化向上述DNA溶液中加入200ii1的溶液E，輕輕混勻；再加入200ii1的Tris飽和酚，輕輕混勻；加入200ii1的氯仿/異戊醇(體積比1:l)，輕輕混勻；12000g離心3min，小心將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入800iU無水乙醇，輕輕混勻，室溫放置5min;12000g離心10min，棄上清，70wt%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干；加入50y1溶液F，室溫放置10min。4、質粒DNA的濃度及純度分析用分光光度計測定質粒DNA的0D26。和0D28。，結果見表2，發現各菌株提取的質粒DNA濃度在550-963yg/ml之間；樣品0D26。/0D28。比值在1.8-2.0之間。說明獲得的DNA純度較高，完全可以滿足基因克隆、鑒定等分子生物學研究需求。表2Bt菌株及不同血清型標準菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、電泳分析將上述提取到的質粒DNA用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓60v，電泳后紫外下拍照分析(參見圖1)。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。權利要求一種提取蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟1)菌體的培養與收集挑取蘇云金芽胞桿菌的單菌落于5-10mlLB液體培養基中30℃振蕩培養過夜，1wt％轉接到50-100ml新鮮LB液體基中繼續振蕩培養，至細菌生長密度為OD600＝0.9-1.1，收集約80-120mg菌體于1.5ml離心管中；2)原生體的制備向收集的菌體中加入1-1.2ml預冷的溶液A懸浮細胞，12000g離心，去上清。菌體重懸于200-300μl溶液B，37℃溫育1.5-2h；3)細胞的裂解和質粒的提取向制備好的原生質體中加入200-300μl溶液C，緩慢混勻，68℃處理10min，裂解細胞，向裂解液中加入100-150μl溶液D，輕輕混勻，于-20℃中放30min；4℃12000g離心20min，將上清液轉移至新1.5ml離心管內，加入1ml無水乙醇，-20℃過夜；4℃12000g離心20min，棄上清，70wt％乙醇洗滌沉淀，真空干燥沉淀，加入200μl無菌純水溶解沉淀；4)質粒的純化向上述DNA溶液中加入150-250μl的溶液E，輕輕混勻；再加入150-250μl的Tris飽和酚，輕輕混勻；加入150-250μl的氯仿/異戊醇，輕輕混勻；12000g離心3min，小心將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入800μl無水乙醇，輕輕混勻，室溫放置5min；12000g離心10min，棄上清，70wt％乙醇洗滌沉淀，室溫晾干；加入40-70μl溶液F，室溫放置10min；2.根據權利要求l所述的提取方法，其特征在于，所述溶液A是由20-30mMTris-HCl、l-5mMEDTA、30-50mMNaCl組成，pH=8.0。3.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液B是由溶液A中含20wt%蔗糖、2mg/ml溶菌酶和10yg/mlRNase酶組成。4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液C是在溶液A中加入8wt%SDS溶液。5.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液D是3MNaAc，pH=4.8。6.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液E是由6.0MNH4Ac和1.Omg/ml溴化乙啶組成。7.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液F是由5.0-10.0mMTris-HCl和0.5-1.OmMEDTA組成，pH=8.0。8.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿、異戊醇的體積比為1:1。全文摘要本發明公開一種提取蘇云金芽胞桿菌大質粒DNA的方法，包括以下步驟1)菌體的培養與收集；2)原生體的制備；3)細胞的裂解和質粒的提取；4)質粒的純化。應用該方法得到的質粒DNA可直接用來限制性內切酶消化、PCR擴增等多種分子生物學實驗。本發明操作簡便、安全、質量高，可同時適用于多種革蘭氏陽性細菌質粒DNA的提取，因此具有廣泛的適用性。文檔編號C12R1/07GK101717770SQ20091020068公開日2010年6月2日申請日期2009年12月24日優先權日2009年12月24日發明者劉華,吳瀟,唐雪明,朱宏,王利剛,王金斌,蔣玲曦,譚芙蓉,趙凱,陶世如申請人:上海市農業科學院