專利名稱：一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法
技術領域：
本發明涉及現代農業技術的菌種質量評價技術領域，具體的說是一種簡單評價栽 培真姬菇菌種質量變化的方法。
背景技術：
食用菌產業的發展，需要大量的菌種。菌種作為重要的生產資料，對產業的發展起 著重要的作用，從某種意義上甚至可以說是決定了栽培的成敗。但是，由于多年形成的分散 生產經營方式，菌種生產缺乏規范，菌種生產和質量常出現這樣、那樣的問題，隨著產業的 發展，問題日益突出，甚至成為主產區的社會不安定因素。產業的發展迫切需要對菌種進行 科學有效的管理。為了保護和合理利用食用菌種質資源，規范品種選育及生產、經營、使用 和管理，根據《中華人民共和國種子法》(以下簡稱《種子法》)和《中華人民共和國植物新 品種保護條例》，農業部制定了《食用菌菌種管理辦法》(以下簡稱《管理辦法》)。在《管理 辦法》第四章菌種質量禁止生產經營假、劣菌種。但實際生產中，優質菌種經長期無性世代 繁殖，不知不覺中已經發生了退化。突然有一天，這些“退化”一下子表現出來。不同食用 菌退化的表現各異，而這些現象，在營養菌絲階段從形態外觀上通常是無法區分的。真姬菇[Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigelow]，又名蟹味菇、海鮮菇、鴻喜菇、玉 蕈、膠玉蘑，隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是一種質地脆 嫩，味道鮮美，營養豐富，具有多種保健功效的珍稀食用菌，深受廣大消費者的喜愛。真姬菇 是已經實現工廠化生產的主要食用菌之一，產量僅次于金針菇、杏鮑菇。真姬菇是栽培期較 長的食用菌，大約需要90 110d。這主要由于真姬菇菌絲培養必須經一個生理成熟期(后 熟期)，才能長出較好的菇。如果到出菇時才發現是劣質菌種，對于一個日產5噸的中等規 模食用菌工廠，已經生產了 3000000瓶。如上所述，通過栽培試驗檢測菌種質量的方法，雖 然可靠，但對食用菌工廠時間就是效益，閑置廠房設備也是損失。對于菇農來說劣質菌種則 是一季減產甚至是絕收。目前，檢測菌種質量，栽培試驗是最具說服力的方法。該方法主要可以考察菌種是 否均一且性狀穩定，對生長周期短的食用菌可能還可行。菌種在培養基質上生長和出菇的 過程中，一方面可從形態特征、生理生態特性方面考察菌種質量，另一方面可以從畸菇率、 原基發生期、原基發生數量、菇體色澤、產量等方面考察菌種質量。退化品種的菌種經栽培 后，常表現出菇期不一致、菇潮不明顯、產量下降、對不良環境或雜菌的抗性降低等現象，而 老化菌種則表現為出菇提前、菇體變薄等現象。而該檢測菌種質量方法的缺點就是周期長， 尤其對生長周期長的菌種，使用該方法有待商榷。新近發展起來的DNA指紋分析技術，如RAPD、RFLP等，可以從基因組水平進行菌種 鑒別。該方法可以檢測病菌侵染、雜菌污染、菌株混雜等問題，暫且不論該方法是否能解決 菌種質量其他問題(如退化菌株)，但就其操作的復雜性，對缺乏生物技術知識的菇農來說 也是很難接受的。其他還有一些檢測菌種質量的方法，如形態特征觀察、生理特征、生化測 定等，這些方法一般都需要長期的栽培經驗和一定的生物學基礎。根據目前研究，上述方法與菌株質量并不存在必然聯系。因此，無論是食用菌工廠還是廣大菇農都亟需一種快速、簡 便的評價菌種質量的方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種改進的檢測評價真姬菇菌種質量變化的方法，它可克 服現有技術中檢測方法操作復雜、需要長期的栽培經驗和一定的生物學基礎，無法滿足食 用菌工廠和廣大菇農需要的一些不足。為了實現上述目的，本發明的技術方案是一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法， 其特征在于所述的評價方法包括下列步驟a.菌種菌絲體的培養；b.檢測菌種質量液體培養基的配置；c.液體培養標準菌種，并記錄標準參數；d.液體培養待評價菌種；e.觀察培養液變化；測定培養液在615nm處的吸光度，根據公式D = 1-A615 (菌 種培養液)/A615 (空白培養液)，來計算D值；f.將培養液顏色、D值和所建立標準菌種的參數進行比較，檢測菌種質量變化趨勢。上述菌絲體在用于食用菌生產時，為保藏菌種菌絲體和用于栽培的各級菌種；在 用于育種篩選菌株時，為出發菌株和各個衍生菌株。上述接種量可根據培養基的多少放大或縮小，適當正增加接種量可以加速檢測時 間，但需要摸索培養基變色的完成時間即培養天數。上述液體培養基最終顏色評價，黃色一綠色一藍色，為由好到差的順序。根據保藏 種和栽培用各級種比較，向差的方向變化較大的菌種即明顯看出變藍幅度較大的需要謹慎 使用，或不使用。上述利用分光光度計在615nm測定培養液的吸收值并計算出D值，使用于菌種廠 或工業化食用菌生產企業，可以更為精確的檢測菌種的質量細微變化，當D值較保藏菌種 減小30 %，菌種質量較差，變化較大，需謹慎使用或棄用。使用時本發明克服了傳統通過栽培試驗檢測菌種質量周期長效率低的缺點，首次 利用正常菌株與退化菌株在液體培養基中具有不同的使合成染料褪色的能力，而退化菌株 的產量和畸形菇數量與液體培養基顏色成一定的相關性，實現了對真姬菇劣質菌株的有效 鑒別。同時，為其他食用菌菌種評價提供了有效的借鑒。需要說明的是這里提出的評價方法適用于生產中同一菌種質量的相對優劣變化， 該方法不適用于因真假菌種而引起的菌種質量問題。
圖1為本發明評價方法的結構框2為15、18號菌株培養液經離心去菌絲體后和空白CK的顯色結果圖3 圖19為1 18號菌株的全波段掃描結果
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的描述。本發明所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于所述的檢測方 法包括下列步驟a.菌種菌絲體的培養；b.檢測菌種質量液體培養基的配置；c.液體培養標準菌種，并記錄標準參數；d.液體培養待評價菌種；e.觀察培養液變化；測定培養液在615nm處的吸光度，根據公式D = 1-A615 (菌 種培養液)/A615 (空白培養液)，來計算D值；f.將培養液顏色、D值和所建立標準菌種的參數進行比較，檢測菌種質量變化趨勢。步驟a中，菌種菌絲體可以是保藏菌種，母種，生產用各級種，組織分離獲得的菌 種，必須為活體，且可形成子實體的真姬菇菌種純培養物。步驟b中，檢測菌種質量的液 體培養基各成分的重量百分比為乳糖3-6%、蛋白胨7-9%、酵母粉4-5%、溴百里酚藍 0. 02-0. 03%，余量為蒸餾水，pH7. 0，上述各成分的重量百分比之和為100%。步驟c中，標準菌種的選擇為所要評價菌種的保藏菌種，將培養于馬鈴薯葡萄糖 瓊脂平板的保藏菌種和不同批次菌種的菌塊1cm2，接種于裝有50mL液體檢測培養基的 150mL三角瓶中，若進行靜置培養務必使接種的菌塊浮于液面，因為該培養過程是需氧的， 如沉入液內，會影響檢測結果；若搖床培養沒有上述要求，接種后，置于25°C環境培養，搖 床150rpm振蕩培養5天，或靜置培養10天。步驟d中，接種Icm2的菌絲體到IOOmL液體 培養基中，液體培養于23 ^TC,靜置或震蕩均可，150rpm振蕩培養4 5天或靜置培養 10 14天，觀察液體培養基顏色變化，當靜置培養時，接種務必使菌塊浮于液體表面，以保 證培養在較短時間完成。步驟e中，觀察液體培養基顏色的變化黃色一綠色一藍色，為菌種質量由好到 差。使用分光光度計測定培養液在615nm處的吸光度，通過D= 1-A615 (菌種培養液)/ A615 (空白培養液)公式可得到各菌種的D值，D值越大質量越好，反之，質量越差。步驟f中，比較保藏菌種與栽培菌種之間的顏色差異a、若栽培菌種液體培養基 顏色較保藏菌種差異不明顯，則可以使用；b、若栽培菌種液體培養基顏色較保藏菌種明顯 變藍的趨勢，則說明該批次菌種質量不好，產量將下降，畸形菇數量上升，需謹慎使用，或棄 用；C、記錄了每次檢測保藏菌種的顏色，如發現保藏菌種較此前顏色變藍且幅度較 大，則需要對保藏菌種進行提純復壯，或者更換菌種；比較保藏菌種與栽培菌種之間D值變 化，當D值變低小于等于30%時，則可以使用；當D值變低大于30%時，則說明該批次菌種 質量不好，產量將下降，畸形菇數量上升，需謹慎使用，或棄用；當批次間保藏種D值變低大 于30%時，則需要對保藏菌種進行提純復壯，或者更換菌種。步驟f中，所謂菌種質量變化 趨勢的檢測，即預測該菌種用于栽培時，產量、畸形菇數量相對原菌種的變化情況。實施例本發明首先對要評價菌種的保藏種進行檢測，建立該菌種的參數基準(即接種 量，液體培養基量，培養天數和培養方式)，檢測培養液變色幅度，或吸光度；根據上述參數基準，比較保藏種不同批次的變化情況，決定是否需要提純復壯菌種，或更換新菌種；根據 上述參數基準對栽培各級種進行檢測，比較保藏種與栽培各級種培養液變色幅度，或吸光 度，判斷栽培種質量是否發生變化及變化趨勢，再變化情況決定栽培種質量及使用與否。菌種的選擇生產過程中菌種質量檢測時，選擇真姬菇菌株見表1(中國微生物菌種保藏管理 委員會農業微生物中心上海食用菌分中心提供)建立標準檢測體系。18號菌株為上海浦東 天廚菇業有限公司提供生產用白色真姬菇菌株。表1供試真姬菇菌株
權利要求
1.一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于所述的檢測方法包括下列步驟a.菌種菌絲體的培養；b.檢測菌種質量液體培養基的配置；c.液體培養標準菌種，并記錄標準參數；d.液體培養待評價菌種；e.觀察培養液變化；測定培養液在615nm處的吸光度，根據公式D=1_A615(菌種培 養液)/A615 (空白培養液)，來計算D值；f.將培養液顏色、D值和所建立標準菌種的參數進行比較，檢測菌種質量變化趨勢。
2.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟a中， 菌種菌絲體可以是保藏菌種，母種，生產用各級種，組織分離獲得的菌種，必須為活體，且可 形成子實體的真姬菇菌種純培養物。
3.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟b 中，檢測菌種質量的液體培養基各成分的重量百分比為乳糖3-6%、蛋白胨7-9%、酵母粉 4_5%、溴百里酚藍0. 02-0. 03%，余量為蒸餾水，pH7. 0，上述各成分的重量百分比之和為 100%。
4.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟c中， 標準菌種的選擇為所要評價菌種的保藏菌種，將培養于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板的保藏菌種 和不同批次菌種的菌塊Icm2，接種于裝有50mL液體檢測培養基的150mL三角瓶中，若進行 靜置培養務必使接種的菌塊浮于液面，因為該培養過程是需氧的，如沉入液內，會影響檢測 結果；若搖床培養沒有上述要求，接種后，置于25°C環境培養，搖床150rpm振蕩培養5天， 或靜置培養10天。
5.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟d中， 接種Icm2的菌絲體到IOOmL液體培養基中，液體培養于23 ^°C，靜置或震蕩均可，150rpm 振蕩培養4 5天或靜置培養10 14天，觀察液體培養基顏色變化，當靜置培養時，接種 務必使菌塊浮于液體表面，以保證培養在較短時間完成。
6.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟e中， 觀察液體培養基顏色的變化黃色一綠色一藍色，為菌種質量由好到差。
7.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟e中， 使用分光光度計測定培養液在615nm處的吸光度，通過D= 1-A615(菌種培養液)/A615(空 白培養液)公式可得到各菌種的D值，D值越大質量越好，反之，質量越差。
8.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟f中， 比較保藏菌種與栽培菌種之間的顏色差異a、若栽培菌種液體培養基顏色較保藏菌種差異 不明顯，則可以使用；b、若栽培菌種液體培養基顏色較保藏菌種明顯變藍的趨勢，則說明該 批次菌種質量不好，產量將下降，畸形菇數量上升，需謹慎使用，或棄用；c、記錄了每次檢測 保藏菌種的顏色，如發現保藏菌種較此前顏色變藍且幅度較大，則需要對保藏菌種進行提 純復壯，或者更換菌種；比較保藏菌種與栽培菌種之間D值變化，當D值變低小于等于30% 時，則可以使用；當D值變低大于30%時，則說明該批次菌種質量不好，產量將下降，畸形菇 數量上升，需謹慎使用，或棄用；當批次間保藏種D值變低大于30%時，則需要對保藏菌種進行提純復壯，或者更換菌種。
9.如權利要求1所述的一種檢測真姬菇菌種質量變化的方法，其特征在于步驟f中， 所謂菌種質量變化趨勢的檢測，即預測該菌種用于栽培時，產量、畸形菇數量相對原菌種的 變化情況。
全文摘要
本發明公開了一種檢測真姬菇菌種質量的方法，即采用含有活性染料的液體培養基對真姬菇菌種質量進行評價。本發明利用正常菌株與退化菌株具有不同的使合成染料褪色的能力，成功建立了基于該方法的評價技術，實現了對初步真姬菇菌種質量的評價。采用本方法能夠快速、經濟的評價真姬菇菌種質量。
文檔編號C12Q1/02GK102080120SQ200910199728
公開日2011年6月1日 申請日期2009年12月1日 優先權日2009年12月1日
發明者馮志勇, 陳明杰, 陳輝, 高君輝 申請人:上海市農業科學院