青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶編碼序列的制作方法

文檔序號：563270閱讀：256來源：國知局

專利名稱：青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程技術領域的編碼序列，具體是一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列。
背景技術：
青蒿"/^e啦'da a/ /7朋L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。
目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，為0. 01%~1%，低含量使得青蒿素的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大、產量低、成本高，因此人工生產缺乏可行性。也有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中的含量低于干重的0.1%，在芽中含量最高也只有干重的0. 16%,大多數研究沒有檢測到青蒿素。因此，利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的也不具備可行性。Dahua Chen等在《Plant Science》(植物科學)2000年155 期179-185頁發表了題為"Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation"(通過農桿菌介導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因)的論文，文中評述，通過過量表達法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase ，FPS)可在原有基礎上提高青蒿素含量2 倍-3倍，達到1%左右。
隨著近年來植物基因組學的發展，青蒿素合成途徑的基因分離、克隆和功能性研究已經取得了突破性的進展。人們已經初步完成了對參與青蒿素合成途徑關鍵基因的分離和功能驗證工作，并分析了青蒿素合成途徑概貌。
經對現有技術的文獻檢索發現，尚未見與青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列有關的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列。本發明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的異戊二烯類化合物含量，可以使含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉基因植物成為生物反應器，實現青蒿素的大規模生產和其他異戊二烯類化合物的生產。
本發明是通過以下技術方案實現的，
本發明涉及一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，該序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示或者是SEQ ID NO: 3序列中第15~1214位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產生的序列。
所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示。
本發明還涉及一種多肽，序列如SEQ ID NO: 4所示。
本發明還涉及一種利用所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，包括如下步驟
步驟一，將青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列連于植物表達調控序列上，構建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的植物表達載體；
步驟二，將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿；
步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉化細胞，再生轉基因植株。
步驟二中，所述轉入采用凍融法。
本發明中，構建步驟一中含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的植物表達載體時可選用本領域已知的各種載體，例如質粒，粘粒等。本發明中，步驟三中，含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤蘚醇
合酶編碼序列的轉化細胞為真核細胞。進一步地，真核宿主細胞為酵母細胞、擬南芥的生殖細胞或愈傷組織細胞、其他植物的生殖細胞或愈傷組織細胞。
術語"簡并"是指編碼氨基酸的大部分密碼子具有簡并性，即兩個或多個密碼子編碼同一氮基酸。例如GM和GAG都編碼谷氨酰胺。本發明具有如下的有益效果
本發明可提高青蒿素含量；同時本發明可使含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉基因植物成為生物反應器，實現異戊二烯類化合物的大規模生產；利用本發明的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤蘚醇激酶蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明涉及的根癌農桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細良，田云龍，郭萍，朱昌雄；根癌農桿菌介導的哈茨木霉菌遺傳轉化的研究，中國生物工程雜志， 2008, 28 (3) : 38 43》文獻中公開。根癌農桿菌EHA105可通過公開市售的商業渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambarl。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊見New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例
步驟一，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列《M) 的克隆
(1) RNA的提取(RNA extraction) 取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL Eppendorf (EP) 離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。(2)基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根據擬南芥中相關基因所編碼的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART RACE試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行
① 首鏈cDNA的合成
利用SMART RACE試劑盒所提供的5'-CDS primer A和SMART II A oligo 引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成 5，-RACE -Ready cDNA;利用Clontech試劑盒所提供的3，-CDS primer A為引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成 3，-RACE-Ready cDNA。
② 3,-RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物2 (GSP2) (SEQ ID NO: 1)進行3'-RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進行測序。
③ 5, -RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物l (GSP1) (SEQ ID NO: 2)進行5， -RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到PMD18-T載體上進行測序。將測序結果的重疊區拼接，得到該基因的完整編碼區序列。BLAST 分析結果證明從青蒿中得到的基因確為一個4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶的相關基因。
通過上述步驟，獲得了青蒿中參與青蒿素合成的4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO: 3)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。本實施例中得到的新的青蒿C抓的全長cDNA長度為1480bp，詳細序列見SEQ ID NO: 3,其中開放閱讀框位于15~1214位核苷酸(1200個核苷酸，含終止密碼子)。根據所獲得的cDNA推導出青蒿4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶的氨基酸序列，共399個氨基酸殘基，詳細序列見SEQ ID NO: 4。步驟二，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(;-甲基-0-赤蘚醇激酶相關基因的序
列信息與同源性分析
步驟一中得到的青蒿C艦(4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶) 的全長cDNA長度為1200bp (SEQ ID NO: 3)，其中開放閱讀框位于第15-1214 位核苷酸，根據所獲得的cDNA推導出青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶的氨基酸序列(見SEQ ID NO: 4)，共399個氨基酸殘基，分子量為43818. 44,等電點為7.15。利用vectorNTI 9. 0軟件對來源于各種植物的4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D"赤蘚醇激酶的相關氨基酸序列進行同源比對，結果發現，克隆到的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列與擬南芥(Arabidopsis thaliana)，玉米 (Zea may)，煙草 (Nicotiana Benthamiajm)，薄荷(Mentha x piperita)，番茄(Lycopersicon esculent咖) 以及甜葉菊(Stevia rebaudiana) 中同源基因所編碼的氨基酸序列相似性分別為70%, 76%， 72%， 70%， 78%， 78%。由此可見，青蒿0^基因與其他高等植物中的C服相關基因在所編碼的氨基酸水平上存在較高的同源性，可以認為它們的產物在功能上也有較高的相似性。
步驟三，青蒿4-(5， -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶相關蛋白或多肽在青蒿細胞中進行真核細胞表達
(1)含目的基因(青蒿CMK基因)的表達載體的構建
根據青蒿C服的全長編碼序列(SEQ ID NO: 3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入^a/zHI和&cI限制性內切酶位點，以便構建表達載體。以青蒿cDNA為模板，經PCR擴增后，將青蒿C服的編碼區序列連接至中間載體pMD18-T中進行測序。將測序正確的C服的編碼區序列進一步克隆到表達載體pCAMBIA2300中，接著將其轉入根癌農桿菌EHA105，并進行PCR 驗證。結果表明，含青蒿Off基因的植物表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株中。
(2)根癌農桿菌介導C服基因轉化青蒿 ①外植體的預培養
青蒿種子用75% (v/v)乙醇浸泡1 min;再用20% (w/v) NaC10浸泡20 min; 無菌水沖洗3-4次；用無菌吸水紙吸干表面水分；接種于無激素的MS，該MS培養基采用Murashige和Skoog在1962年發明的固體培養基，可以通過商業渠道獲得；25'C、 16小時的日光和8小時的黑夜培養，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。
② 農桿菌與外植體的共培養
將所述的葉片外植體，轉到1/2 MS和100 Mrnol/L AS組成的共培養培養基中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28'C暗培養3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2 MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。
③ 抗性再生植株的篩選
將所述的共培養3d的青蒿外植體轉入到MS、0. 5 mg/L 6-BA、 0. 05 mg/L NAA、 50 mg/L Kan和500mg/L Cb組成的發芽篩選培養基上，于25'C、 16小時的日光和8小時的黑暗中培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代后即可獲得 Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入1/2MS0和125mg/L Cb組成的生根培養基上培養至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。
④ 轉基因青蒿植株的PCR檢測
根據目的基因所在表達盒p35s-CMK -nos序列p35s和C服分別設計正向引物設計和反向引物對C服基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出特異DNA片段，而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
步驟四，利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含量 (1) HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695系統，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (Sy咖etryShieldTMC18， 5 ^m, 250x4. 6咖，Waters),流動相甲醇(methanol): 水為70%:30%，柱溫30'C，流速1. OmL/min,進樣量10 靈敏度(AUFS:l. 0)，理論塔板數按青蒿素峰計算不低于2000。
ELSD:采用water alliance 2420系統，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40 'C,放大系數(gain)為7，載氣壓力5 bar;
精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2.0 mg用1 mL甲醇完全溶解，得到 2 mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于-20'C備用。
本實施例中流動相甲醇(methanol):水為70%:30%時，青蒿素的保留時間為5.1 min,峰型良好。理論塔板數按青蒿素計算不低于2000。(2) 標準曲線的制作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 nL, 4 ^L, 6 nL， 8 pL，
10nL記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X, pg)進行回歸分析。通過研究，本實施例中青蒿素在4-20 pg范圍內呈現良好的log-log線性關系。青蒿素對照品的log-log線性回歸方程為Y=l. 28e+000X+4. 71e+000， R=0.979546。
(3) 樣品的制備和青蒿素含量的測定
青蒿素的提取過程基于Van Nieuwerburgh et al. (2006)中報道的方法取少量新鮮的青蒿葉片(1-2 g鮮重)，于50 ml試管中將其浸沒在10 ml氯仿中搖蕩l分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿揮發完全，取3ml無水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC檢測。同時，氯仿提取后的葉片收集放入60度烘箱進行烘干，稱重(計算青蒿葉片的干重)；
采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 根據峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。
在本實施例中編碼4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶(6MD基因的轉化顯著提髙了青蒿葉片中青蒿素含量，這使得轉基因植株中青蒿素的含量超過對照非轉化普通青蒿的50%以上。由此可見，4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤蘚醇激酶基因可作為一種獲得了青蒿素高產的青蒿植株的候選基因，用于利用轉基因技術提髙植物青蒿素含量和其他異戊二烯類化合物的研究和產業化生產中。
9序列表
〈110>上海交通大學
<120>青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶蛋白編碼序列〈160> 4
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 25 <212〉 DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua L ) <400> 1
aggccgtgga aaatacgatg ctgtt 25
<210> 2 〈211〉 25 <212> 醒
〈213> 青蒿(Artemisia annua L ) 〈400〉 2
cccgtctggc ctcttattgg ttatt 25
<210> 3 <211> 1480 〈212〉 DNA
〈213> 青蒿(Artemisia annua L.) <400> 3
ggtaactaac caccatggca acaatggctg ctgcttcttc tcacttgttt gtatatcatc aaaattcaac aaatcctcca ttactttaaa acaatcttcg agaattgcag aaattttaga acccatttgg、 tggttaaagc ttcttcatct acaccaaaaa tggaagaaaa caagaggagt tggtgtataa tcttgatgag gattagctga tgaggtggat atgaatgctg gattgtcaag actctctttg gtaagatcaa tgttttctta agaataacca ataagaggcc agacgggttt catctctatt tcatgtaatc agcttagggg ataagataaa gttctcctta aaactacaga tcgcctctca actaatgtgc caggaattcc acttgatgaa
tac幼caatg 60
ttttatcata 120
gataataatg 180
aagctaaatc 240
ttttctcctt 300
catgacctag 360
tcaccatcga 420
agaaatttga 480taataaaggc cttaaatcta tatcggaaga agacgggaag tgacaaattc ttttgggtac 540
atgttgataa aaaggttcca actggggctg ggcttggtgg cggaagtagt aatgctgcaa 600
ccgcactttg ggcagcaaac caattcagtg gttgcctagc aacggagcaa gaactccaag 660
aatggtctgg tgagattggt tcagatgtcc ccttcttctt ctccaatgga gccgcctatt 720
gcacgggtag aggcgaggtt gttcaagata taccttcacc tgtacctttt gacttaccaa "780
tggttctgat taagcctcca gaggcatgct ctactgctga agtttacaag cgtttccggt 840
tggatgtatc aagtactgct gatcctttag cattgctgga gaagatctca aaaatatggaa 900
tatcacaaga tgtttgcata aacgatttgg aaccgcctgc ttttgaagtt cttccgtctc 960
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tgtctggaag tggaagcacc atagtaggcg tgggttctgc agatccccca caatttttat 1080
atgatgaatga ggattataag gacgtctttc tatccgaagc taacttcatc acacgcacag 1140
agaaccaatg gtaccaagaa ccatcttcgt caaatactac ttcatttgta gatcaatcca 1200
gttgacaggt ttcaacatta tcaaacatcg
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gctacgctgc aatttaggat atctgttata ttgcggcc犯aaatcattta tcttattgcc aaagtttgat
tatggatgtg tcctttatat
tatgattctt gtctagtcac
tgttgtaaga tcggcttaga eigtcatagaa gtgagcatca atgtagcatc ctttctaaat agttattgtg
tttttatctt ataactttac
〈210> 4 〈211〉 399 〈212〉 PRT
<213> 青蒿(Artemisia annua L ) 〈400〉 4
Met Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser His Leu Phe Tyr Asn Asn Gly
5 10
15
1260 1320 1380 1440 1480
lie Ser Ser Lys Phe Asn Lys Ser Ser lie Thr Leu Lys Gin Ser Ser
20 25
30Phe Tyr His Lys Asn Cys Arg Asn Phe Arg Thr His Leu Val Val Lys 35 40 45
Ala Ser Ser Ser Asp Asn Asn Asp Thr Lys Asn Gly Arg Lys Gin Glu 50 55 60
Glu Leu Val Tyr Asn Leu Asp Glu Lys Leu Asn Arg Leu Ala Asp Glu 65 70 75 80
Val Asp Met Asn Ala Gly Leu Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Pro Cys 85 90 95
Lys lie Asn Val Phe Leu Arg lie Thr Asn Lys Arg Pro Asp Gly Phe 100 105 110
His Asp Leu Ala Ser Leu Phe His Val lie Ser Leu Gly Asp Lys lie 115 120 125
Lys Phe Ser Leu Ser Pro Ser Lys Thr Thr Asp Arg Leu Ser Thr Asn 130 135 140
Val Pro Gly lie Pro Leu Asp Glu Arg Asn Leu lie lie Lys Ala Leu 145 150 155 160
Asn Leu Tyr Arg Lys Lys Thr Gly Ser Asp Lys Phe Phe Trp Val His 165 170 175
Val Asp Lys Lys Val Pro Thr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser 180 185 190
Asn Ala Ala Thr Ala Leu Trp Ala Ala Asn Gin Phe Ser Gly Cys Leu 195 200 205
Ala Thr Glu Gin Glu Leu Gin Glu Trp Ser Gly Glu lie Gly Ser Asp 210 215 220
Val Pro Phe Phe Phe Ser Asn Gly Ala Ala Tyr Cys Thr Gly Arg Gly 225 230 235 240Glu Val Val Gin Asp lie Pro Ser Pro Val Pro Phe Asp Leu Pro Met 245 250 255
Val Leu lie Lys Pro Pro Glu Ala Cys Ser Thr Ala Glu Val Tyr Lys 260 265 270
Arg Phe Arg Leu Asp Val Ser Ser Thr Ala Asp Pro Leu Ala Leu Leu 275 280 285
Glu Lys lie Ser Lys Asn Gly lie Ser Gin Asp Val Cys lie Asn Asp 290 295 300
Leu Glu Pro Pro Ala Phe Glu Val Leu Pro Ser Leu Lys Arg Leu Lys 305 310 315 320
Gin Arg lie Val Ala Ala Gly Arg Gly Lys Tyr Asp Ala Val Phe Met 325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Thr lie Val Gly Val Gly Ser Ala A印Pro Pro 340 345 350
Gin Phe Leu Tyr Asp Glu Glu Asp Tyr Lys Asp Val Phe Leu Ser Glu 355 360 365
Ala Asn Phe lie Thr Arg Thr Glu Asn Gin Trp Tyr Gin Glu Pro Ser 370 375 380
Ser Ser Asn Thr Thr Ser Phe Val Asp Gin Ser Ser Tyr Ala Ala 385 390 39權利要求
1、一種青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，其特征是，該序列如SEQ ID NO3中第15～1214位所示或者是SEQ ID NO3序列中第15～1214位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產生的序列。
2、根據權利要求l所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，其特征是，該序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示。
3、一種多肽，其特征在于，序列如SEQ ID NO: 4所示。
4、一種利用權利要求l所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤蘚醇激酶編碼序列連于植物表達調控序列上，構建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的植物表達載體；步驟二，將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿；步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉化細胞，再生轉基因植株。
5、根據權利要求4所述的利用青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征是，步驟二中，所述轉入具體為采用凍融法進行轉入。
全文摘要
一種基因工程技術領域的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，序列如SEQ ID NO3中第15～1214位所示或者是SEQ ID NO3序列中第15～1214位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產生的序列；利用所述編碼序列提高植物青蒿素含量的方法包括如下步驟將所述編碼序列連于植物表達調控序列上，構建含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的植物表達載體；將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿；通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉化細胞，再生轉基因植株。本發明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的異戊二烯類化合物含量。
文檔編號C12N15/54GK101665796SQ20091019517
公開日2010年3月10日申請日期2009年9月4日優先權日2009年9月4日
發明者唐克軒, 可楊, 王玥月, 翁純純申請人:上海交通大學

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