專利名稱：：一種羊水細胞培養基的制作方法
技術領域：
：本發明一種羊水細胞培養基屬于生物化學領域。
背景技術：
：產前診斷是優生學的重要組成部分，它是建立在遺傳咨詢基礎上通過產前檢測胎兒健康情況，對患有嚴重遺傳病、先天畸形的患兒可以及早采取措施，減少人群中有害基因積累，以減少患兒出生，提高人口素質，因此具有十分重要的意義。產前診斷目前主要有孕早期絨毛組織取材、孕中期羊水和臍帶血、孕婦外周血分離胎兒細胞及植入前診斷等方法，但孕中期羊水細胞檢查仍是最主要的方法。這是因為與其它方法相比，羊水穿剌檢查具有操作安全，妊娠流失率低于自然流產率以及診斷染色體異常較為可靠的優點。羊水穿剌檢查的主要對象為高齡(大于34歲)、不良接觸史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色體異常兒分娩史、夫妻之一核型異常、B超示畸型、家族性連鎖遺傳病史、近親婚配等的孕婦。其中，高齡孕婦是主要檢查對象，在國內占了整個檢查對象的1/3。羊水細胞培養后通過染色體顯帶技術，能夠辨別三體綜合癥、平衡易位、倒位以及性染色體異常等染色體方面的疾病。由于羊水中活細胞少，培養周期長，無菌要求高，稍不注意即致失敗。即使培養成功，因分裂相少、形態不佳而達不到分析要求，無法進行進一步研究，使羊水產前診斷的應用到受限制。因此成功的羊水細胞培養，除需要嚴格的實驗操作技術和經驗外，培養基的組成也是非常關鍵的。羊水細胞可能是胎兒皮膚、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脫落的細胞，其中只有小部分是有活力的細胞(約O.1%)，而活力細胞又以貼壁型細胞為主。如何能促其在體外培養中貼壁增殖，是成功培養羊水細胞的關鍵因素。傳統的羊水培養基組成是基礎培養基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血清(胎牛血清)。但這種培養基培養的成功率低，成功率低于30%，而且平均培養周期長，培養周期需要20天，且分裂相少，不能有效用于羊水細胞檢查；為了縮短羊水細胞培養周期，提高成功率，已有了改良型的培養基的研究報道，基本上是在基礎培養基的基礎上添加含有生長因子的提取物組成。如ChangHC(ChangHC，Jones0W，MasuiH，Humanamnioticfluidcellsgrowninahormone—supplementedmedium-suitabilityforprenataldiagnosis,Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.79，4795-4799(1982))。在DMEM與F12按l:1混合的基礎培養基(DMEM/F12)中添加10種促生長因子，分別為轉鐵蛋白(transferrin)5mg/L、亞硒酸鈉20nMol/L、胰島素(insulin)10mg/L、三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine)0.lnMol/L、胰高血糖素(glucagon)lmg/L、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)10ug/L、氫化可的松(hydrocortisone)lnMol/L、睪酮(testosterone)lnMol/L、雌二醇(estradiol)lnMol/L、孕酮(progesterone)lnMol/L。ChangHC把含此10種促生長因子配方的培養基稱為H培養基，而將此10種促生長因子含量增倍后的培養基稱為H-l培養基。生長因子加倍的H-l培養基的培養效果要明顯好于H培養基，H-l在培養基添加較低含量的胎牛血清的情況下，依然能夠顯著增加羊水細胞的克隆形成率和克隆生長速度，使培養成功率達到99%以上，培養周期縮短到10天左右。3實際培養過程中，我們發現雖然配制的含不同比例胎牛血清的分別在匿EM/F12、a-MEM、F12等常用的基礎培養基基礎上添加而成的H_l培養基都可以成功地培養出羊水細胞，但依然存在著克隆數目較低，克隆增殖較慢，收獲的分裂相細胞仍較少等問題。因此當種植的羊水樣品狀況不佳時，即活性細胞較少，克隆數目只有l-2個，無法在短期內生成足夠的分裂相細胞，此時需胰酶消化后傳代培養，這無疑延長了細胞培養周期。因此H-1培養基的培養效果與臨床檢驗單位的需求仍有一定差距，有必要對培養基配方進行改進。
發明內容本發明的目的在于提供一種能夠迅速有效地增加體外增殖的羊水細胞克隆數目和細胞增殖速度，縮短培養周期，獲得分裂相染色體數目多的羊水細胞培養基及其配方。本發明的目的是通過以下措施來達到的研究表明，在羊水培養中增加抗氧化劑，降低活性氧R0S濃度，會促進羊水細胞的克隆和增殖，在培養基中添加經過優化組合的不同種類的抗氧化劑，降低培養基中的活性氧R0S濃度，以達到增加貼壁型羊水細胞克隆數目，提高細胞增殖速度的協同作用效果。—種羊水細胞培養基是包含下列組份基礎培養基DMEM/F12細胞培養基轉鐵蛋白(transferrin)10mg/L亞硒酸鈉40nMol/L胰島素(insulin)20mg/L三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine)0.2nMol/L胰高血糖素(glucagon)2mg/L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)20ug/L氫化可的松(hydrocortisone)2nMol/L睪酮(testosterone)2nMol/L雌二醇(estradiol)2nMol/L孕酮(progesterone)2nMol/l為了提高羊水細胞培養基的培養效果，增加細胞克隆數和分裂相細胞數，在上述組份的基礎上，添加抗氧化劑。抗氧化劑是維生素E和L-抗壞血酸兩種抗氧化劑的混合物。本發明添加維生素E5mg-20mg/L和L_抗壞血酸25_60mg/L的混合物。本發明添加維生素E和L-抗壞血酸的混合物有較好的效果，維生素E和L-抗壞血酸有顯著的協同作用，可以顯著增加細胞克隆生長速度和分裂相細胞數。而當維生素E為10mg/L、L-抗壞血酸50mg/L有最好的效果。本發明在羊水細胞培養基中添加體積百分比為4_15%的胎牛血清后，可用于羊水細胞培養，在較短的7、8天時間內，可培養得到能夠滿足臨床診斷和科研要求的大量的處于分裂期的羊水細胞。本發明羊水細胞培養效果有顯著改進，克隆形成率和克隆生長速度明顯增加，減少了培養時間，同時提高了細胞培養成功率，充分發揮了不同的抗氧化劑的維生素E和L-抗壞血酸的協同作用，維生素E和L-抗壞血酸的相互促進的協同作用，在較短的時間內，4可以培養得到大量的處于分裂期的羊水細胞，能夠滿足臨床診斷和科研的要求。具體實施例方式實施例1:不同配方的培養基培養效果比較1、配制H-l培養基1L裝量的DMEM/F12細胞培養基，用950ml的注射水溶解后，添加NaHC031.2g、15mMHEPES，添加10種生長因子，包括轉鐵蛋白(transferrin)10mg/L、亞硒酸鈉40nMol/L、胰島素(insulin)20mg/L、三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine)0.2nMol/L、胰高血糖素(glucagon)2mg/L、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)20ug/L、氫化可的松(hydrocortisone)2nMol/L、睪酮(testosterone)2nMol/L、雌二醇(estradiol)2nMol/l、孕酮(progesterone)2nMo1/1。其后添力口注射水定容至1000ml;配置8份H-1培養基。2、配制DF-I1培養基取H-l培養基1份，添加20mg/L的維生素E。3、配制DF-I2培養基取H_l培養基1份，添加L_抗壞血酸60mg/L。4、配制DF-Ja培養基:取H_l培養基1份，添加5mg/L的維生素E和25mg/L的L-抗壞血酸。5、配制DF-Jb培養基取H-l培養基1份，添加20mg/L的維生素E和60mg/L的L-抗壞血酸。6、配制DF-J1培養基取H-l培養基1份，添加10mg/L的維生素E和50mg/L的L-抗壞血酸。7、配制DF-I3培養基取H_l培養基1份，添加5mg/L的維生素E。8、配制DF-I4培養基取H_l培養基1份，添加L_抗壞血酸25mg/L。9、將各配制好的羊水細胞培養基添加體積百分比為4%的胎牛血清，成為羊水細胞完全培養基。7、羊水細胞培養收集10份羊水樣品(為17-22周齡之間的羊水樣品，每份約2-2.5ml，共23ml左右)，混合均勻，得到檢測用羊水細胞收集樣品I，比較不同培養基的培養效果。細胞培養、制片方法按以下步驟進行。①在無菌條件下取羊水各2.5ml/管，共8管。②以453g(1500rpm/min)室溫離心10分鐘。③在無菌操作臺上吸去上清液，每管約留lml，吸管打散細胞。制成細胞懸液，再加入4ml培養基入管內，吸管輕混勻，移至25cm2方形一次性培養瓶中置含5%C02的37。C溫箱飽和濕度行開放式培養。6天后鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮細胞生長，當細胞生長旺盛，在貼壁細胞層的背景上出現圓形細胞時，此時換相應新鮮的羊水培養基5ml，24-48小時后，如細胞生長狀況好，加入秋水仙素0.04-0.08ug/ml，(20ug/ml，7號針頭垂直豎加2滴)4_6h左右行細胞學處理。⑤收獲細胞倒出瓶中細胞液入10ml離心管，0.85%NaCl溶液沖洗細胞壁兩遍，O.25%胰酶消化3-5分鐘，待細胞面出現肉眼可見鈹形改變時即用吸管吹打下細胞453g(1500rpm/min)室溫離心10分鐘，去上清，約留0.5ml。低滲加入37°C0.075MKC14_6ml，吸管吹打，37。C水浴3-5分鐘。5⑦預固定加入1.5ml甲醇冰醋酸=3:1固定劑，輕混勻37。C水浴5分鐘453g(1500rpm/min)室溫離心10分鐘。去上清約留0.5ml。⑧固定加入3:1固定劑8ml，輕混勻，37t:水浴10分鐘，453g(1500rpm/min，印pendorf5810R)室溫離心10分鐘。去上清，約留0.5ml。⑨重復固定同上。453g(1500rpm/min)室溫離心10分鐘，去上清，視管底細胞量加入適當幾滴固定劑。⑩滴片、烤片每片1-2滴，75t:烤箱烘烤3小時。O培養結束染色體制片前統計細胞克隆總數，包括有分裂相的克隆總數，以及有效克隆的大小；制備染色體后統計分裂相細胞數目。g羊水細胞收集樣品I培養8天后收獲，進行染色體制片，結果見表1:表1各配方培養基添加胎牛血后對羊水細胞的培養效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1、表1各培養基配方中的維生素E和L-抗壞血酸濃度是指添加胎牛血清前的濃度。2、克隆大小判斷標準為在100倍倒置顯微鏡下判斷觀察，克隆^l個視野判斷為大克隆；克隆《1/2個視野則判斷為小克隆；介于兩者之間的為中等克隆。3、總克隆數=有分裂相的總克隆數+無分裂相的克隆數；有分裂相總克隆數為大、中、小各克隆數目之和。從結果可以看出，在H-l培養基基礎上同時添加維生素E和L-抗壞血酸的培養基，包括DF-Ja、DF-Jb和DF-J1與只添加一種抗氧化劑的培養基(DF-Il、DF_I2、DF-I3和DF-I4)相比，總克隆數，包括有分裂相的總克隆數和分裂相細胞數目都有明顯的增加，說明維生素E濃度在5-20mg/L范圍以及L_抗壞血酸濃度在25_60mg/L的范圍時兩者有顯著的協同作用，并且DF-J1培養基中的維生素E和L-抗壞血酸濃度是個優化值，有最好的培養效果。經優化后的羊水培養基的培養效果無論從總克隆數、分裂相細胞數目、細胞增殖速度方面都要比現有公開文獻的H-l培養基有了大幅度提高。實施例2:羊水細胞培養基配制1)材料轉鐵蛋白(transferrin)、胰島素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)、三碘甲狀腺氨酸、氫化可的松、皮質醇、雄激素、雌二醇激素，SIMGA公司提供；匿/F12干粉培養基，GIBCO公司提供；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)凍干粉，上海博彩公司提供；丙酮酸鈉、1，4-丁二胺二鹽酸鹽、亞硒酸鈉、維生素、氨基酸、脫氧核苷和核苷、維生素￡丄-抗壞血酸、酚紅、葡萄糖等試劑皆為國產分析純，廣州威加試劑公司提供；2)設備滲透壓檢測儀、pH值檢測儀；3)配制方法①100X氨基酸母液的配制將培養基所需的L-氨基酸混合(谷氨酰胺單獨配制并冷凍保存，不包括其中)，配制100倍氨基酸母液100ml。氨基酸的種類及其具體稱量，根據配方表2，將稱量好的氨基酸干粉混合，加入60ml注射用水后，在磁力攪拌下緩慢滴加1MHC1至氨基酸完全溶解，加注射用水定容至100ml并分裝，4t:保存。②(100X)維生素母液的配制，根據配方表2具體配方，將十種維生素稱配后，按順序添加到注射用水中。每種維生素需完全溶解后再添加另一種，配成ioox維生素母液100ml，分裝，4t:保存。加入順序為D-泛酸鈣、i-肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺、核黃素、維生素H(生物素)、氯化膽堿、葉酸。③L-谷氨酰胺母液的配制根據配方表2，將所需用量的L-谷氨酰胺干粉稱量后用注射用水溶解、分裝，-201:保存備用。(100X)VB12母液的配制根據配方表2，將所需用量的VB12單獨稱量后用注射用水溶解、分裝，4t:保存。⑤無機鹽母液的配制根據配方表2，分別配制100X氯化鈣母液、硫酸銅母液、硝酸鐵母液、硫酸亞鐵母液、氯化鉀母液、氯化鎂母液、硫酸鎂母液、氯化鈉母液、硫酸鋅及磷酸鹽母液各100ml，常溫保存備用。1，4-丁二胺二鹽酸鹽母液的配制根據配方表2配制100X1，4-丁二胺二鹽酸鹽母液100ml，4t:保存。⑦100X葡萄糖母液的配制根據配方表2配制100X葡萄糖母液100ml，分裝后4t:保存。⑧酚紅指示劑母液的配制根據配方表2配制1000X酚紅母液10ml，分裝后4"C保存。⑨10ml(106X)激素母液的配制根據配方表2計算氫化可的松、皮質醇、雄激素、雌二醇激素用量，分別稱量后混合，用無水乙醇(AR級)10ml溶解，配制成(106X)激素母液，分裝后4t:保存。10ml(106X)三碘甲狀腺氨酸母液的配制根據配方表2計算三碘甲狀腺氨酸用量，用1MNaOH10ml溶解，配制成106X三碘甲狀腺氨酸母液，分裝后4"C保存。70100ml(100X)胰島素-轉鐵蛋白_亞硒酸鈉母液的配制根據配方表2分別計算胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉用量，稱量后混合，用pH值為2.0酸化水100ml溶解，分裝后fC保存。0100ml(100X)胰高血糖素母液的配制根據配方表2計算胰高血糖素用量，用pH值為10.0的堿化水溶液100ml溶解，分裝后4t:保存。C5堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)母液的配制根據一個包裝的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量添加注射用水溶解，使bFGF濃度為終濃度的200倍，即4ug/ml，分裝后-2(TC保存。0(103X)胸苷、次黃嘌呤母液的配制根據配方表2計算胸苷和次黃嘌呤用量，分別稱量后混合，用100ml注射用水溶解后分裝，-2(rC保存。10ml(103X)維生素E母液的配制根據配方表2計算維生素E用量，用10ml無水乙醇溶解后分裝，4t:保存。^10ml(105X)a硫辛酸母液的配制根據配方表2計算a硫辛酸用量，用10ml無水乙醇溶解后分裝，4t:避光保存。^100ml(100X)丙酮酸鈉母液的配制根據配方表2計算丙酮酸鈉用量，用100ml注射用水溶解后分裝，4t:保存。^100ml(100X)HEPES母液的配制根據配方表2計算HEPES用量，用100ml注射用水溶解后分裝，4t:保存。^100ml(100X)L_抗壞血酸母液的配制根據配方表2計算維生素L_抗壞血酸用量，用100ml注射用水溶解后分裝，4t:避光保存。紗10ml(105X)亞油酸母液的配制根據配方表2計算亞油酸用量，用10ml無水乙醇溶解后分裝，4t:保存。51000ml羊水細胞培養基的配制在潔凈的燒杯中加入700ml注射用水，在磁力攪拌下加入100X氨基酸母液10ml、100X維生素母液10ml、VB12母液10ml。其后分別緩慢滴加100X氯化鈣母液、硫酸銅母液、硝酸鐵母液、硫酸亞鐵母液、氯化鉀母液、氯化鎂母液、硫酸鎂母液、硫酸鋅及磷酸鹽母液各10ml、氯化鈉母液8ml、l，4-丁二胺二鹽酸鹽母液10ml、葡萄糖母液10ml、酚紅指示劑母液lml、次黃嘌呤母液10ml、丙酮酸鈉母液10ml、L_谷氨酰胺母液10ml、激素母液lul、三碘甲狀腺氨酸母液lul、胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉母液10ml、胰高血糖素母液10ml、bFGF母液5ml、維生素C母液10ml、亞油酸母液100ul、a硫辛酸母液100ul、維生素E母液lml，加注射用水至980ml，隨后加入碳酸氫鈉1.2g、HEPES母液10ml，加1MNaOH或1MHC1數滴，使pH至7.2。檢測溶液滲透壓，根據滲透壓值加入氯化鈉母液(約lml-2ml左右)，使最終的溶液滲透壓保持在280-300mOSM之間。補充注射用水至1000ml，得羊水細胞培養基。4)羊水細胞培養基加入體積百分比為4_15%的胎牛血清(FBS)，混勻后無菌過濾分裝，得到可用于原代或傳代培養的羊水細胞完全培養基，-2(TC保存。表2羊水細胞培養基配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*氯化鈉含量可根據滲透壓值調整實施例3:含不同比例胎牛血清(FBS)的羊水細胞完全培養基培養效果收集8份羊水細胞樣品(為18-21周齡之間的羊水樣品，每份約2-4ml，共22ml左右)，混合均勻，制成檢測用羊水細胞收集樣品。將羊水細胞樣品均分為三份后離心，吸去大部分上清，留lml混勻接種于4ml按實施例2配制的含不同FBS比例的羊水細胞培養基中，比較添加不同體積百分比胎牛血清的羊水細胞完全培養基的培養效果。結果見表3。表3含不同比例FBS的羊水細胞完全培養基培養效果比較FBS比例(％)培養天數總克隆數(含有分裂相的克無分分裂相(天)分裂相的總克隆數裂相細胞數隆數)大中小的克巨隆數4843(41)19121021578846(42)191310315115847(41)201296153從表3可以看出，本發明中添加不同百分體積比胎牛血清的羊水細胞完全培養基之間培養效果并沒有顯著區別，皆可以在短期內收獲大量的分裂相羊水細胞。1權利要求一種羊水細胞培養基，包含下列組份基礎培養基，轉鐵蛋白，亞硒酸鈉，胰島素量，三碘甲狀腺氨酸，胰高血糖素，堿性成纖維細胞生長因子，氫化可的松，睪酮，雌二醇，孕酮，其特征是在上述組份的基礎上，添加維生素E和L-抗壞血酸兩種抗氧化劑的混合物。2.根據權利要求1所述的一種羊水細胞培養基，其包含下列組份其特征是3.根據權利要求2所述的一種羊水細胞培養基，其特征是添加維生素E5mg-20mg/L和L-抗壞血酸25-60mg/L。4.根據權利要求2所述的一種羊水細胞培養基，其特征是添加維生素E10mg/L和L-抗壞血酸50mg/L的混合物。5.根據權利要求1或2或3或4所述的一種羊水細胞培養基，其特征是添加體積百分比為4-15%的胎牛血清。基礎培養基轉鐵蛋白亞硒酸鈉胰島素三碘甲狀腺氨酸胰高血糖素堿性成纖維細胞生長因子氫化可的松睪酮雌二醇孕酮全文摘要本發明一種羊水細胞培養基屬于生物化學領域。羊水細胞培養基是包含下列組份基礎培養，轉鐵蛋白，亞硒酸鈉，胰島素，三碘甲狀腺氨酸，胰高血糖，堿性成纖維細胞生長因子，氫化可的松，睪酮，雌二醇，孕酮，添加抗氧化劑，抗氧化劑是維生素E和L-抗壞血酸的混合物，在羊水細胞培養基中添加體積百分比為4-15％的胎牛血清后，可用于羊水細胞培養，在較短的7、8天時間內可培養得到能夠滿足臨床診斷和科研要求的大量的處于分裂期的羊水細胞。本發明羊水細胞培養效果有顯著改進，克隆形成率和克隆生長速度明顯增加，減少了培養時間，同時提高了細胞培養成功率，充分發揮了不同的抗氧化劑的維生素E和L-抗壞血酸的協同作用。文檔編號C12N5/073GK101705207SQ20091019396公開日2010年5月12日申請日期2009年11月10日優先權日2009年11月10日發明者丘力功,孫希海,李素芬,蔡小杰,韋劍申請人:廣州拜迪生物醫藥有限公司