專利名稱：紅法夫酵母菌株的復合誘變方法
技術領域：
本發明涉及一種紅法夫酵母菌株的誘變方法，尤其涉及通過低溫復合誘變獲得紅 法夫酵母誘變高產菌株的方法。
背景技術：
蝦青素(Astaxanthin)為3，3，- 二羥基_4，4，- 二酮基-β，β，胡蘿卜素，是一 種酮式類胡蘿卜素。色澤為艷麗紅色，具有脂溶性。蝦青素具有許多其它的生理功能，如具 有高度猝滅單原子氧和清除自由基的作用；抗氧化作用，其抗脂肪氧化的能力比胡蘿 卜素高10倍，比維生素高100倍，可有效地防止組織。細胞和DNA被氧化損傷，增強免疫功 能，抗癌作用，保護心血管健康等。蝦青素作為功能色素在醫藥、食品、飼料及化妝品等工業 中具有廣闊的應用前景，近年來受國內外研究人員和各行業的關注。目前國際市場的價格為每千克2500美元，全球每年有10億以上的市場容量。因 此，加緊蝦青素產品的開發，特別是天然蝦青素產品的生產，具有很高的市場價值和十分廣 闊的市場前景。現在，天然蝦青素所占的市場份額很小。就目前的生產和市場情況而言，天 然蝦青素由于產量低、生產成本高而很難與化學合成的蝦青素在價格上進行競爭。但是隨 著生產技術的改進和優化以及生產成本的降低及公眾文化素質的提高，認可并要求購買含 天然蝦青素的水產品或立法上要求使用天然色素添加劑，天然蝦青素與合成蝦青素相比就 具備了一個特殊的價格優勢。紅法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作為蝦青素生物來源的一些必要特征 蝦青素是主要的類胡蘿卜素，大約占到40-95%，能夠利用多種糖作為碳源進行異養代謝； 培養時間短；不需要光照；能夠在發酵罐中實現高密度培養。因而紅法夫酵母被認為是一 種最具研究價值的蝦青素大規模生產的來源。紅法夫酵母中蝦青素的含量雖然是甲殼類動物蝦青素含量的5-50倍，但只有雨 生紅球藻中蝦青素含量的-10%，要想利用紅法夫酵母來進行蝦青素的工業化生產，選 育高產菌株是應用的關鍵。
圖1是本發明所采用技術方案流程示意圖。
發明內容
本發明的目的旨在通過復合誘變得到一株遺傳性狀穩定的高產蝦青素菌株，為紅 法夫酵母發酵生產蝦青素的工業化奠定基礎。為了達到上述目的，本發明一種紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，包括如下步 驟Si、取紅法夫酵母種子培養液，稀釋后涂平板；S2、一次紫外誘變在黑暗環境下，用紫外燈照射平板后，在20_25°C下培養4-5 天；
S3、二次紫外誘變篩選色素產量高且遺傳穩定的菌株，重復涂平板及步驟S2 ；S4、低溫處理篩選色素產量高且遺傳穩定的菌株，制得種子液，保存于1_5°C環 境下2-4天；S5、單線態氧處理將種子液轉移到發酵培養基中培養至對數生長中后期，提取菌 株的單細胞狀態，分別加入濃度為10-15mmol/L的H2O2，振蕩混勻后置于1_5°C環境中培養 10-18小時；S6、單線態氧處理后的菌株，經洗滌、稀釋后涂平板在20_25°C下培養7_10天。優選方式下，本發明紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，在上述步驟S5中，菌株培 養至對數期的方法為將菌株從斜面移到發酵培養基中培養36-60小時，再轉入新鮮液體 培養基培養24-48小時，至對數生長中后期。在上述步驟S5中，提取菌株的單細胞狀態的 方法為用無菌離心管取1毫升菌液，以3500轉/分鐘離心5分鐘收集菌體，用緩沖液洗滌 兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30秒，使菌體散開成為單細胞狀 態。此外，優選方式下，步驟Sl的具體過程為將篩選培養基加熱滅菌后，趁熱倒平 板，15-20ml/板，凝固待用；取紅法夫酵母種子培養液，用滅菌水稀釋IO5-IO7倍，量取稀釋 液涂平板。而制平板的培養基優先選用葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麥芽汁3 克，瓊脂20克，水1升；滅菌冷卻至45°C后，加入適量經過過濾除菌濃度為50-80 μ mol/L的 二苯胺溶液。優選方式下，紫外誘變的具體過程為用15w的紫外燈在距離20cm處照射，照射時 間為10-100秒。此外，本發明上述步驟S1-S6過程中，選用無菌水進行稀釋；緩沖液優先選 用 pH5. 0 的 0. 2mol/L 磷酸。而上述步驟中的篩選方法，包括如下步驟S31、經誘變培養完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單菌 落，用接菌環挑取涂到斜面培養基中培養保存；S32、復篩將初篩的菌種發酵培養，測定其生物量和色素含量，選取其中色素產量 最高的菌種。本發明一種篩選紅法夫酵母高產菌株的方法。首先紅法夫酵母菌株兩次紫外誘 變，得到一株五代內遺傳性狀穩定的突變株，然后又將此突變株低溫處理。經低溫處理的突 變株，又經過單線態氧誘變處理，得到一株在10代內有良好的遺傳穩定性的突變株。將突 變株發酵培養，測定其生物量和色素含量，均高于原始菌株。本發明通過低溫復合誘變得到 一株蝦青素產量較高的紅法夫酵母誘變菌株，為下一步紅法夫酵母工業化生產奠定基礎。
具體實施例方式如圖1所示本發明所采用技術方案采用重復紫外照射與單線態氧誘變結合的方 式對該酵母進行誘變選育，通過帶有二苯胺的篩選培養基對各突變進行篩選，選取最優正 向突變。通過連續傳代，考察突變株的穩定性。并用薄層層析的方法對色素進行純化。實 踐證明紫外誘變、經低溫處理后和單線態氧(過氧化氫)復合誘變處理后，得到突變菌株， 不僅遺傳性狀穩定，色素含量和生物量均高于原始菌株。本發明的具體實施工藝如下一、紫外誘變
將篩選培養基加熱滅菌后，趁熱倒平板，15-20ml/板左右，凝固待用。取種子培養 液，用滅菌水稀釋IO5-IO7倍，準確量取稀釋液0.2ml涂平板。然后用15w的紫外燈在距離 20cm處照射，照射時間為10-100S。將處理后的平板在20_25°C下培養4_5天，這些操作在 黑暗中進行。 其中，篩選培養基的配置最優方案為葡萄糖IOg;蛋白胨5g，酵母膏3g，麥芽汁 3g，瓊脂20g，水1L。滅菌冷卻至45°C后，加入適量經過過濾除菌的二苯胺溶液，是二苯胺的 終濃度 50-80 μ mo 1/L。上述紫外誘變過程重復操作兩次。此外，上述紫外誘變燈源的選擇根據需要設定燈的瓦數、照射距離及時間。本發明 僅提供一中優選方案，其他經過兩次紫外誘變的方案均為本發明的等同方案。同理，篩選培 養基的選擇也根據需要選擇常規篩選培養基或特制篩選培養基均可。二、低溫處理將所選突變株的種子液保存于1_5°C環境下，2-4天。將上述種子液轉移到發酵培 養基中培養96小時，測色素產量和生物量。三、單線態氧誘變選取經低溫處理的紫外誘變的正突變菌株進行單線態氧處理。具體方法為將 菌株從斜面移到液體培養基中培養36-60小時，再轉入新鮮液體培養基培養24-48小時到 對數生長中后期，用無菌離心管取Iml菌液3500r/min離心5min收集菌體，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30s， 使菌體散開而成為單細胞狀態。再分別加入3% H2O2 (最終濃度為10-15mmol/L)振蕩混勻 后置于4°C冰箱內保存10-18小時，離心棄去上清液再用緩沖液洗滌1-2次還原到原體積， 稀釋后涂平板。20-25°C培養7-10天計數。四、誘變菌株色素分析1、經誘變培養完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單菌落， 用接菌環挑取涂到斜面培養基中培養保存。2、復篩將初篩的菌種發酵培養，測定其生物量和色素含量，選取其中色素產量最 高的菌種。實施例1A、第一次紫外誘變將篩選培養基加熱滅菌后，趁熱倒平板，15_20ml/板左右，凝 固待用。取種子培養液，用滅菌水稀釋IO5倍，準確量取稀釋液0.2ml涂平板。然后用15w 的紫外燈在距離20cm處照射，照射時間為70S。將處理后的平板在20-25°C下培養4-5天， 這些操作在黑暗中進行。B、選擇這期間所得的深紅色菌株，作為目的菌株，進行培養，測其生物量、色產量 和遺傳穩定性。選擇色素產量高且遺傳穩定的菌株進行第二次紫外誘變。C、將所選突變株的種子液保存于4°C環境下，3天。D、選取經過低溫處理的紫外誘變的正突變菌株進行單線態氧處理。具體方法為 將次菌株從斜面移到液體培養基中培養48小時，再轉入新鮮液體培養基培養24小時到 對數生長中后期，用無菌離心管取Iml菌液3500r/min離心5min收集菌體，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30s，使菌體散開而成為單細胞狀態。再分別加入3% H2O2(最終濃度為lOmmol/L)振蕩混勻后 置于4°C冰箱內保存過夜，離心棄去上清液再用緩沖液洗滌1-2次還原到原體積，稀釋后涂 平板，20-25°C培養7-10天計數。E、初篩經誘變培養完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單 菌落，用接菌環挑取涂到斜面培養基中培養保存。復篩將初篩的菌種發酵培養，測定其生 物量和色素含量。經過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內有 良好的遺傳穩定 性的突變株，此突變株的色素產量為5. llmg/L，生物量為10. 7g/L，分別比出發菌株紅法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 94. 2%和 13. 8% 0實施例2與例1的不同之處在于A、B兩次紫外誘變的時間為80秒；C、將所選突變株的種子液保存于3°C環境下，3天。D、單線態氧誘變處理時，H2O2最終濃度為15mmol/L ；其他均與例1相同。經過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內有良好的遺傳穩定 性的突變株，此突變株的色素產量為5. 56mg/L，生物量為12g/L，分別比出發菌株紅法夫酵 母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 111%和 28% 0實施例3.A、B兩次紫外誘變的時間為75秒；C、將所選突變株的種子液保存于5°C環境下，4天。D、單線態氧誘變處理時，H2O2最終濃度為lOmmol/L ；其他均與例1相同。經過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內有良好的遺傳穩定 性的突變株，此突變株的色素產量為5. 47mg/L，生物量為10. 2g/L，分別比出發菌株紅法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 108%和 8.5%。實施例4.Si、篩選培養基加熱滅菌后，趁熱倒平板，18ml/板，凝固待用；取紅法夫酵母種子 培養液，用滅菌水稀釋IO6倍，量取稀釋液涂平板。在黑暗環境下，用紫外燈照射平板后，在 23°C下培養4天；S2、篩選色素產量高且遺傳穩定的菌株，重復涂平板及上述步驟；S3、篩選色素產量高且遺傳穩定的菌株，制得種子液，保存于4°C環境下4天；S4、將種子液轉移到發酵培養基中培養至對數生長中后期，提取菌株的單細胞狀 態，分別加入濃度為12mmol/L的H2O2，振蕩混勻后置于4°C環境中培養12小時；S5、選取經低溫處理的紫外誘變的正突變菌株進行單線態氧處理。具體方法為 將菌株從斜面移到液體培養基中培養55小時，再轉入新鮮液體培養基培養45小時到對 數生長中后期，用無菌離心管取2ml菌液3000轉/分鐘離心7分鐘收集菌體，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30秒， 使菌體散開而成為單細胞狀態。再分別加入3% H2O2振蕩混勻后置于1°C冰箱內保存11小時，離心棄去上清液再用緩沖液洗滌2次還原到原體積，稀釋后涂平板，20°C培養9天計數。經過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內有良好的遺傳穩定 性的突變株，此突變株的色素產量為5. lmg/L，生物量為10. 9g/L，分別比出發菌株紅法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 93. 9%和 20%。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
一種紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，包括如下步驟S1、取紅法夫酵母種子培養液，稀釋后涂平板；S2、一次紫外誘變在黑暗環境下，用紫外燈照射平板后，在20-25℃下培養4-5天；S3、二次紫外誘變篩選色素產量高且遺傳穩定的菌株，重復涂平板及步驟S2；S4、低溫處理篩選色素產量高且遺傳穩定的菌株，制得種子液，保存于1-5℃環境下2-4天；S5、單線態氧處理將所述種子液轉移到發酵培養基中培養至對數生長中后期，提取菌株的單細胞狀態，分別加入濃度為10-15mmol/L的H2O2，振蕩混勻后置于1-5℃環境中培養10-18小時；S6、單線態氧處理后的菌株，經洗滌、稀釋后涂平板在20-25℃下培養7-10天。
2.根據權利要求1所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟S5中，菌株培養至對數期的方法為將菌株從斜面移到發酵培養基中培養36-60 小時，再轉入新鮮液體培養基培養24-48小時，至對數生長中后期；步驟S5中，提取菌株的單細胞狀態的方法為用無菌離心管取1毫升菌液，以3500轉 /分鐘離心5分鐘收集菌體，用緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器 上振蕩20-30秒，使菌體散開成為單細胞狀態。
3.根據權利要求2所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟Sl的具體過程為將篩選培養基加熱滅菌后，趁熱倒平板，15-20ml/板，凝固待 用；取紅法夫酵母種子培養液，用滅菌水稀釋IO5-IO7倍，量取稀釋液涂平板。
4.根據權利要求3所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟S2的具體過程為用15w的紫外燈在距離20cm處照射，照射時間為10-100秒。
5.根據權利要求1-4任一所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟 S1-S6過程中，選用無菌水稀釋；緩沖液選用pH5. 0的0. 2mol/L磷酸。
6.根據權利要求1-4任一所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟 S1-S6中篩選方法包括531、經誘變培養完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單菌落，用 接菌環挑取涂到斜面培養基中培養保存；532、復篩將初篩的菌種發酵培養，測定其生物量和色素含量，選取其中色素產量最高 的菌種。
7.根據權利要求6所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟S1-S3平板所用培養基為葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麥芽汁3克，瓊 脂20克，水1升；滅菌冷卻至45°C后，加入適量經過過濾除菌濃度為50-80 μ mol/L的二苯 胺溶液。
全文摘要
本發明一種紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，首先紅法夫酵母菌株兩次紫外誘變，得到一株五代內遺傳性狀穩定的突變株，然后又將此突變株低溫處理。經低溫處理的突變株，又經過單線態氧誘變處理，得到一株在10代內有良好的遺傳穩定性的突變株。將突變株發酵培養，測定其生物量和色素含量，均高于原始菌株。本發明通過低溫復合誘變得到一株蝦青素產量較高的紅法夫酵母誘變菌株，為下一步紅法夫酵母工業化生產奠定基礎。
文檔編號C12N15/01GK101818141SQ200910188300
公開日2010年9月1日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者侯娟, 葉淑紅, 王晗, 王際輝 申請人:大連工業大學