專利名稱：：檢測atxn3基因cag重復序列動態突變的引物及其pcr擴增方法
技術領域：
：本發明屬于生物醫學領域中的臨床檢測技術，具體涉及一種新的檢測脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物及PCR擴增方法，該檢測結果可用于臨床輔助診斷脊髓小腦共濟失調。
背景技術：
：脊髓小腦共濟失調(SpinocerebellerAtaxia,SCA)是一組以進行性平銜-和協調障礙為特點的中樞神經系統慢性退行性疾病，以前曾被稱為常染色體顯性共濟失調(AutosomalDominantCerebellarAtaxias,ADCAs)。脊ft小腦共濟失調的主要病變部位在脊髓、小腦和腦干，其他組織如脊神經、腦神經、交感神經、基底節、丘腦、丘腦下部和大腦皮質均可受累，還可伴有其他系統異常，如骨骼畸形，眼部病癥，前庭及聽力障礙，心臟、內分泌及皮膚病變等。由于病變部位多樣化及損害程度輕重不等，故癥狀復雜，臨床和病理分類也甚混亂。1983年英國神經病學家Harding按神經病理標準分類將ADCAs分為3種類型I型除小腦共濟失調外還包括眼球運動障礙、慢眼運動、視神經萎縮、錐體束征、肌萎縮、周圍神經病和癡呆；II型以小腦共濟失調伴視網膜色素變性為特征；III型為單純小腦共濟失調。隨分子生物學技術的發展，1993年SCA的第一個亞型SCA1的易感基因被定位克隆，隨后許多SCA的致病基因被識別出來，于是按照各亞型發現的先后順序依次命名為SCA1~SCA27等，這種分子遺傳學分類已經成為國際上慣用的分類方法。SCA具有遺傳異質性，其最具特征的基因缺陷是編碼多聚谷氨酰胺的CAG三核苷酸重復序列的延長，這導致相關蛋白的構象變化并在神經元內形成聚集體，最終導致神經元的缺失。其他突變類型包括CTG三核苷酸(SCA8)、ATTCT五核苷酸(SCA10)重復序列擴增以及某些基因的點突變。由CAG重復序列異常擴增引起的SCA的癥狀往往與CAG重復序列的大小有關，一般而言，重復次數越大，病情愈重。臨床上通常根據共濟失調、構音障礙、錐體束征等典型共同癥狀，以及伴眼肌麻痹、錐體外系癥狀及視網膜色素變性等表現，結合MRI檢查發現小腦、腦干萎縮，排除其他累及小腦和腦干變性病可進行初步診斷。然而，僅才艮據各亞型特征性癥狀、體征確診仍不準確(SCA7除夕卜)，最終確診需要進行基因診斷，具體是檢測相應基因內CAG的重復次數，以準確判定亞型。SCA3又稱為約瑟夫氏病(MJD)，是我國最常見的SCA亞型，相關基因ATXN3位于14q24.3-q32.2，編碼960個氨基酸殘基組成ataxin-3蛋白。CAG重復序列位于4號外顯子，正常人的重復次數在12-41之間，而患者的重復次數為61-89。于是可以通過PCR方法一全測CAG重復序列的大小來判斷該基因是否突變。然而，該基因內CAG重復序列的GC含量高達67。/。，極大地增加了該序列PCR擴增的難度。現有4支術釆用序列表SEQIDNo.1中所示的正向引物堿基序列和序列表SEQIDNo.2中所示的反向引物石成基序列作為一對引物進行PCR擴增，得到的結果如附圖1的左側所示，特異性不高。
發明內容本發明提供一種檢測ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物及其PCR擴增方法，目的是解決現有PCR擴增ATXN3基因CAG重復序列特異性不高的問題。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種檢測ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物，采用以下一對引物(5，一3，)正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG;反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種檢測ATXN3基因CAG重復序列動態突變的PCR擴增方法，(1)PCR擴增采用以下一對引物(5，一3，)正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG;反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG;(2)PCR擴增由第一階段和第二階段構成第一階段由30-40次擴增循環構成，其條件為變性溫度為94°C~98°C;退火起始溫度為70。C,每兩次擴增循環溫度遞減rC,直至擴增循環結束；延伸溫度為68°C~72°C;第二階段由10-20次擴增循環構成，其條件為變性溫度為94°C~98°C;退火溫度為53°C~55°C;延伸溫度為68°C~72°C。上述技術方案中的有關內容解釋如下41、上述方案中，PCR(polymerasechainreaction)擴增是一種體外擴增DNA片段的方法，即聚合酶鏈式反應方法。采用這種方法，在反應系統中只要有一個拷貝的待擴增DNA片段，在短時間內就能擴增出大量拷貝數的特異性DNA片段。該方法廣泛應用于基因斥企測。PCR擴增的基本原理是模仿細胞內發生的DNA復制過程，以DNA互補鏈聚合反應為基礎，通過把DNA變性、引物與模板DNA(待擴增DNA)一側的互補序列退火復性、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過程的多次循環，產生待擴增的特異性DNA片段。一般反應過程是1、將反應體系加熱至9098。C，模板雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA,作為互補鏈聚合反應的模板；2、降溫至376(TC,使兩種引物分別與模板DNA鏈的互補序列退火復性；3、升溫至7075。C，在耐熱性DNA聚合酶催化下，四種脫氧核糖核酸按與模板堿基配對原則沿引物5，—3'方向延伸，合成模板DNA鏈的互補鏈。重復以上過程，就可以出現待擴增的特異性DNA片段。由于上一次循環合成的兩條互補鏈均可作為下一次循環的模板DNA鏈，所以每循環一次，底物DNA的拷貝數增加一倍，因此PCR經過n次循環后，理論上，待擴增的特異性DNA片段可達到2n個拷貝數。2、上述方案中，在PCR擴增的第一階段，退火溫度第一和第二擴增循環為70。c,第三和第四擴增循環69。c，每兩次遞減rc,以此類推。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點和效果1、本發明采用特殊設計的引物，其PCR產物特異性非常高。利用該基因;險測方法，在完成PCR反應和凝膠電泳后，可直接觀察產物的數量和大小來判斷脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變情況。2、本發明采用特殊的PCR程序，PCR效率和靈敏度高，可以檢測微量DDNA樣本中脊髓小腦共濟失調ATXN3基因中CAG重復序列動態突變，為臨床診斷脊髓小腦共濟失調提供可靠的依據。3、本發明經濟，不需測序。4、本發明操作簡單，一般分子生物學實驗室或^r驗室就可操作。5、本發明建立了一個的簡便易行的擴增CAG重復序列的PCR方法，為提高生物樣本臨床檢測水平，及其推廣應用奠定基礎。附圖1為采用現有引物和本發明的PCR擴增方法得到的DNA擴增體系凝月交電泳圖；5附圖2為釆用本發明的《I物和現有PCR擴增方法得到的DNA擴增體系凝膠電泳圖；附圖3為釆用本發明的引物和本發明的PCR擴增方法得到的DNA擴增體系凝膠電泳圖；附圖4為CAG重復序列測序結果。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一一種檢測脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物，采用以下一對引物(5，—3'):正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG;反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG。本實施例可以通過上述一對引物^r測脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變。實施例二一種檢測脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變的PCR擴增方法，包括下列步驟第一步準備DNA(1)、從人體抽取血液樣本。(2)、從血液樣本中獲取DNA,即血液樣本中白細胞基因組DNA樣品準備。試劑準備抗凝劑每100ml抗凝劑含0.48g檸檬酸，1.32g檸檬酸鈉，1.47g葡萄糖。紅細胞裂解液10mmol/LTris-HCl，pH7.6;5mmol/LMgCl2;10mmol/LNaCl;白細胞裂解液10mmol/LTris-HCl，pH7.6;10mmol/LEDTA(pH8.0)50mmol/LNaCl10mg/ml蛋白酶K(ProteaseK):10mgProteaseK溶于1mlddH20(雙蒸水)，分裝，于-20。C保存。使用時，在4。C融化。從血樣中獲取DNA過程①、耳又3ml新鮮血液力口0.5ml抗)疑劑，混勻，1500rpm離心lOmin,小心吸取紅細胞與血清之間呈一層乳白色的白細胞到一個新的15ml離心管。②、力。10ml紅細胞裂解液，輕輕混勻，放置10min,并經常對溶液進行混勻以充分裂解紅細胞。③、1500rpm離心10min,棄上清，沉淀為白細胞。④、加白細胞裂解液3ml，力。50(ill0%SDS和50(il的10mg/ml蛋白酶K，50。C溫育過夜。⑤、加等體積笨盼氯仿(i:i)，輕柔混勻15次，5000rpm離心10min，取上層水溶液。、加60|il5mol/LNaCl，輕輕混勻。再加2/3體積異丙醇，輕輕混勻5min，可見白色絮狀沉淀即基因組DNA。⑦、8000rpm離心10min，棄上清。⑧、加體積濃度為70%的乙醇10ml，輕輕旋轉離心管，使管壁都充分接觸到乙醇。⑨、8000rpm離心5min，棄上清，室溫風干明顯的乙醇液滴，不要使白色沉淀干透，否則基因組DNA難溶于水。⑩、加無菌去離子水500n1,置于搖床，室溫輕輕搖2h。之后，4。C過夜，使其充分溶解。第二步對DNA進行擴增利用PCR擴增方法，以第一步獲取的基因組DNA為模板，采用以下一對引物(5'—3')進行擴增正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG具體操作為①、將上述一對引物分別與獲耳又的DNA、4種堿基、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、去離子水按一定比例混合構成單獨的反應體系，具體見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>時間基因組DNA變性95。C3分鐘變性95。C30秒36次退火起始溫度為7(TC,每兩次循環溫度遞減rc，直到循環結束30秒循環延伸72。C40秒變性95。C30秒15次退火54。C30秒延伸72。C40秒延伸72°C5分鐘保存4°C第三步凝膠電泳采用凝膠電泳系統對上述DNA擴增后的體系做凝膠電泳；得到的凝膠電泳圖如附圖3所示。CAG重復序列測序結構如圖4所示。第四步觀測結果根據凝膠電泳對應泳帶中所顯示的條帶數量和大小來判斷脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變情況，具體判斷方法如下(1)、如果觀察到對應泳帶中出現一條DNA條帶，則該對等位基因CAG重復數相同；如果觀察到對應泳帶中出現兩條DNA條帶，該對等位基因CAG重復數目不同；(2)、當PCR擴增采用如上所述一對引物時，若DNA條帶大于417個堿基時，則CAG重復數目大于60,具體重復次數X計算公式為X=(Nbp-237)/3，其中Nbp為電泳顯示的條帶長度。對比例一采用以下一對引物(5，—3，)正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG反向引物TGGCCTTTCACATGGATGTGAAPCR擴增方法同實施例一，得到的PCR擴增體系凝膠電泳圖如附圖1所示。;于比例二采用以下一對引物(5，—3，)進行擴增正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGGPCR方法采用現有技術方法(即退火溫度不遞減)。得到的PCR擴增體系凝膠電泳圖如附圖2所示。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。序列表OrganizationApplicantStreet:工業園區仁愛路199號蘇州大學醫學部藥理學系City:蘇州市State:江蘇省Country:中國PostalCode:215123PhoneN咖ber:0512-65880406FaxNumber:EmailAddress:〈110〉0rganizdtionName:蘇州大學ApplicationProject<120>Title:檢測ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物及其PCR擴增方法〈130>AppFileReference:〈140>CurrentAppNumber:<141>CurrentFilingDate:2009-09-03Sequence<210>SEQIDNo.1〈213>OrganismName:人類(Homosapiens)〈400〉PreSequenceString:CCAGTGACTACTTTGATTCG20<212>Type:畫〈211>Length:20SequenceN柳e:現有技術正向引物SequenceDescription:Sequence〈210〉SEQIDNo.2<213〉OrganismName:人類(Homosapiens)<400〉PreSequenceString:TGGCCTTTCACATGGATGTGM22〈212〉Type:DNA<211>Length:22SequenceName:現有技術反向引物SequenceDescription:Sequence〈210〉SEQIDNo.3<213>OrganismName:人類(Homosapiens)<400〉PreSequenceString:CCAGTGACTACTTTGATTCG20<212>Type:腿<211>Length:20SequenceName:本專利申請的正向弓l物SequenceDescription:Sequence<210>SEQIDNo.4<213>OrganismName:人類(Homosapiens)〈400>PreSequenceString:CATGATGAATGGTGAGCAGG20<212>Type:脆<211>Length:20SequenceName:本專利申請的反向引物SequenceDescription:1權利要求1、一種檢測ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物，其特征在于采用以下一對引物(5’→3’)正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG；反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG。2、一種檢測ATXN3基因CAG重復序列動態突變的PCR擴增方法，其特征在于(1)PCR擴增采用以下一對引物(5，一3，)正向引物CCAGTGACTACTTTGATTCG;反向引物CATGATGAATGGTGAGCAGG;(2)PCR擴增由第一階段和第二階段構成第一階段由30~40次擴增循環構成，其條件為變性溫度為94°C~98°C;退火起始溫度為70。C,每兩次擴增循環溫度遞減1°C，直至擴增循環結束；延伸溫度為68°C~72°C;第二階段由10~20次擴增循環構成，其條件為變性溫度為94°C~98°C;退火溫度為53°C~55°C;延伸溫度為68°C~72°C。全文摘要一種改進的檢測脊髓小腦共濟失調ATXN3基因CAG重復序列動態突變的引物及方法，其特點是采用專門設計的特殊引物，通過特殊的PCR程序將ATXN3基因內含有CAG重復序列的DNA片段量擴增至凝膠電泳可觀察的程度，利用凝膠電泳觀察PCR擴增產物片段大小并估算ATXN3基因中CAG動態突變的重復次數。本發明的優點是1.簡單經濟，不需測序，一般分子生物學實驗室或檢驗室就可操作，從而建立了一個簡便易行的擴增CAG重復序列的檢測方法。2.靈敏度及可靠性高，25ng基因組DNA就足夠檢測ATXN3基因中CAG動態突變的重復次數，為臨床診斷脊髓小腦共濟失調提供可靠的依據。文檔編號C12Q1/68GK101654711SQ20091018273公開日2010年2月24日申請日期2009年9月4日優先權日2009年9月4日發明者何曉輝,琪方,秦正紅申請人:蘇州大學