一種hbv基因的核苷酸突變位點的檢測方法

專利名稱：：一種hbv基因的核苷酸突變位點的檢測方法
技術領域：
：本發明屬于基因組學和分子生物學中有機生物分子領域，具體而言涉及HBV基因的核苷酸突變位點的檢測方法。
背景技術：
：自然界大多數生物體的遺傳信息均包含在脫氧核糖核酸(DNA)中，人類全基因組中30億個堿基，約4萬個基因，分布在23對染色體上。每個基因通過轉錄、翻譯，編碼特異的蛋白質，調控生物體內特定的生化反應，發揮特異的生物學功能。DNA序列的改變，即基因突變，會導致蛋白質結構、功能的改變或缺失，進而引起相關的遺傳疾病。基因突變包括DNA分子中發生堿基對的插入、缺失和改變(點突變)。研究表明許多疾病的發生，如血友病、地中海貧血、杜氏型肌營養不良、亨廷頓舞蹈癥、老年癡呆癥、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病以及自身免疫等3000多個疾病與基因突變密切相關。另外，近年來人們逐漸認識到癌癥的發生發展也是基因累積突變的結果。在人類基因組中，約90%的差異是以單個核苷酸的差異體現出來的，主要由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點稱作單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，這種變異的發生頻率至少要大于1%，否則被認為是點突變。SNP位點大多數為雙態，即在一個位點上僅有兩種表現形式，并且在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。這些差異極有可能是造成個體差異的遺傳因素，因此發現這些位點可廣泛地應用于遺傳標記的研究、評估個體遺傳關系、評估物種進化等研究領域。目前檢測SNP和基因突變的方法有許多種，如直接PCR測序、RFLP、基因芯片和熒光定量PCR等。其中，直接PCR測序最不敏感，只有耐藥突變株達到20%以上才能被檢測到；也不適用于大規模篩選；RFLP分析只能檢測出在病毒總體中大于5%的突變株，但是對于每個感興趣的突變，必須特別設計單獨的核酸內切酶。針對某些突變的特異性內切酶可能并不存在，因此RFLP分析并不適用于所有的突變。基因芯片技術利用寡核苷酸微點陣，可以檢測新發現的突變，但這種方法代價昂貴，沒有得到廣泛應用。總之，上述這些方法不是費時費力，靈敏度低，準確度低，就是成本高，不適合大規模篩查。乙型肝炎病毒(HBV)及其基因全球有超過350萬人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感染HBV死亡的人數有50萬到120萬，而約有75%的乙肝患者在亞洲。我國是HBV感染高發區，因此對乙肝的治療刻不容緩。乙肝病毒是一種易高度變異的病毒，在其逆轉錄復制過程中因RNA聚合酶和逆轉錄酶缺乏校正功能，可發生一個或多個核苷酸的變異。HBV-DNA可以在慢性持續性感染過程中自然變異，也可以在免疫壓力下發生變異，甚至在各種抗病毒治療藥物誘導下變異。近年來，核苷類藥物已成為乙型肝炎治療的主要方法之一，目前最常用的核苷類藥物是拉米夫定(LAM)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV病毒復制能力極強，因此也極易產生耐藥，而一旦耐藥可能會有爆發性肝炎的危險。因此對這四種核苷類藥物耐藥突變的檢測應該有更加重要的臨床意義。HBV基因的核苷酸突變位點的質譜檢測目前本領域中已有使用質譜分析進行核苷酸突變位點檢測的方法，但是在現有的方法中通常只是針對單個突變基因型進行檢測，即每次質譜僅能檢測單個位點的單個突變型。由于質譜分析成本較高，而HBV基因的突變位點及突變形式又比較多，所以進行多位點和多突變型的檢測方法成本很高，操作程序也相應地繁瑣復雜，費時費力。因此，本領域中亟需新的檢測HBV基因的核苷酸突變位點的方法，從而實現對HBV基因的多個核苷酸突變位點和突變型的快速而簡便的檢測。
發明內容本發明的目的在于提供一種HBV基因的核苷酸突變位點的檢測方法，旨在解決現有HBV基因的核苷酸突變位點的檢測方法效率較低而成本較高的問題。在本發明的第一方面，提供了一種HBV病毒的核苷酸突變位點的檢測方法，包括如下步驟(1)針對待檢核苷酸序列的突變位點，并確定突變位點在待檢序列中的位置；(2)根據突變位點的位置和基因型設計擴增一對引物和至少一條延伸引物，其中擴增引物的長度為30-50bp，其5'端各含lObp的tag;延伸引物的長度為17-28bp，并且其3'末端堿基與突變位點3'端相鄰的堿基完全匹配；(3)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs;(5)通過延伸反應，在延伸引物的3'端連接一個堿基，且該堿基與突變位點上的堿基互補，延伸反應所使用的原料是以擴大分子量差異為目的進行過質量修飾的四種ddNTP分子；(6)采用樹脂純化延伸反應產物；(7)將純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然后用瞬時納秒強激光激發進行質譜檢測，確定突變的基因型。其中所述步驟(2)所使用的擴增引物對為具有下列序列的多核苷酸的組合SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2，或SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:3;并且其中所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDN0:4至SEQIDNO:12任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發明的另一個優選實施方案中，所使用的延伸引物還包括具有SEQIDNO:13至SEQIDN0:16任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發明的另一個優選實施方案中，使用本發明的方法檢測的核苷酸突變位點為乙肝病毒逆轉錄酶區中的180、181、184、202、204、236和250位點中的一種或幾種。在本發明的另一個優選實施方案中，使用本發明的方法檢測的核苷酸突變位點的突變為rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一種或幾種。在本發明的另一個優選實施方案中，本發明方法還包括在反應中設置陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有1000拷貝/mlHBVDNA的血清，所述陰性對照為不含有HBVDNA的血清。另外，本發明還提供了用于上述檢測方法的特異性引物和引物組合，以及該引物和引物組合用于檢測HBV基因的核苷酸突變位點的用途。使用本發明的方法以及引物的組合，可以同時檢測HBV基因的多個核苷酸突變位點和多種突變型，也就是在一次質譜分析中檢測HBV基因的多個核苷酸突變位點和多種突變型，從而極大地提高了檢測效率，簡化了操作程序，還節約了時間和成本。圖1A為本發明實施例1中，所得到的陰性對照A1的質譜圖；圖IB為本發明實施例1中，所得到的待測樣本B1的質譜圖；圖IC是本發明實施例1中，所得到的待測樣本Cl的質譜圖；圖2A為本發明實施例2中，所得到的待測樣品A2的質譜圖；圖2B為本發明實施例2中，所得到的待測樣本B2的質譜圖；圖2C是本發明實施例2中，所得到的待測樣本C2的質譜圖；圖2D為本發明實施例2中，所得到的待測樣本D2的質譜圖；圖2E是本發明實施例2中，所得到的待測樣本E2的質譜圖；圖3A為本發明實施例3中，所得到的待測樣本A3的質譜圖；圖3B至3E分別為圖3A的局部放大圖，其中圖3B為本發明實施例3中，檢測180位點的質譜圖圖3C為本發明實施例3中，檢測204位點的質譜圖；圖3D為本發明實施例3中，檢測250位點的質譜圖；圖3E為本發明實施例3中，檢測184位點的質譜圖。圖4中各圖為本發明實施例4中，所得到的各樣本的質譜圖；其中圖4A表示rtL180M分析結果圖；圖4B表示rtAlglT分析結果圖；圖4C表示rtA181V分析結果圖；圖4D-4E表示rtT184G分析結果圖；圖4F表示rtS2021分析結果圖；圖4G表示rtM204V分析結果圖；圖4H-4I表示rtM204I分析結果圖；圖4J表示rtN236T分析結果圖；圖4K表示rtM250V分析結果圖。圖5為本發明的實施例4中，使用延伸引物236、181#1#1、181#2#1、202同時對測試樣本進行檢測的質譜結果。圖6為使用延伸引物181#1#2、181#2#2、204#1、184#2同時對測試樣本進行檢測的結果。具體實施例方式本發明提供了一種核苷酸突變位點的檢測方法，包括如下步驟(1)針對待檢核苷酸序列的突變位點，確定突變位點在待檢序列中的位置；(2)根據突變位點的位置和基因型設計擴增一對引物和至少一條延伸引物，其中擴增引物的長度為30-50bp，其5'端各含10bp的tag;延伸引物的長度為17-28bp，并且其3'末端堿基與突變位點3'端相鄰的堿基完全匹配；(3)通過PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs;(5)通過延伸反應，在延伸引物的3'端連接一個堿基，且該堿基與突變位點上的堿基互補，延伸反應所使用的原料是以擴大分子量差異為目的進行過質量修飾的四種ddNTP分子；(6)采用樹脂純化延伸反應產物；(7)將純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然后用瞬時納秒強激光激發進行質譜檢測，確定突變的基因型。其中所述步驟(2)所使用的擴增引物對為具有下列序列的多核苷酸的組合SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2，或SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:3;其特征還在于，所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:4至SEQIDNO:12任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。下面具體描述本發明的多個優選實施方案，應該理解的是，這些實施方案旨在詳細說明本發明，并不在任何方面構成對本發明范圍的限制。，頓,點白勺石角g在本發明方法的步驟(1)中，針對待檢核苷酸序列可能存在的突變位點，確定突變位點在待檢序列中的位置。在人類基因組中，約90%的差異是以單個核苷酸的差異體現出來的，主要由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點稱作單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，這種變異的發生頻率至少要大于1%，否則被認為是點突變。SNP位點大多數為雙態，即在一個位點上僅有兩種表現形式，并且在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。以乙肝病毒(HBV)為例，乙肝病毒是一種易高度變異的病毒，在其逆轉錄復制過程中因RNA聚合酶和逆轉錄酶缺乏校正功能，可發生一個或多個核苷酸的變異。HBV-DNA可以在慢性持續性感染過程中自然變異，也可以在免疫壓力下發生變異，甚至在各種抗病毒治療藥物誘導下變異。近年來，核苷類藥物已成為乙型肝炎治療的主要方法之一，目前最常用的核苷類藥物是拉米夫定(LAM)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV病毒復制能力極強，因此也極易產生耐藥，而一旦耐藥可能會有爆發性肝炎的危險。因此對這四種核苷類藥物耐藥突變的檢測應該有更加重要的臨床意義。目前發現HBV基因耐藥突變位點主要集中于其逆轉錄酶(rt)區域，可包括以下突變rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T和rtM250V，在本發明的方法中可以對上述位點的一種或幾種進行檢測。引物設計在本發明方法的步驟(2)中，根據突變位點的位置設計引物，其中包括一對擴增引物，每條引物長度為30-50bp，其5'端各含10bp的tag;以及延伸引物，其長度為17-28bp，并且其3'末端堿基與突變位點3'端相鄰的堿基完全匹配。作為本發明的一個優選實施方式，所述延伸引物的3'末端至少有9個核苷酸與所述突變位點3'端相鄰的核苷酸完全匹配。作為本發明的一個優選的實施方式，上述步驟(2)還可以包括按照引物間，引物與擴增產物/延伸產物間不形成二聚體，引物自身不形成發夾結構，以及引物與模板間不發生錯配的原則設計引物。用于質譜檢測的延伸引物按照下列原則設計每條延伸引物的分子量相互間的差別要大于30Da，各延伸引物與各延伸產物之間的分子量差異不小于9Da，延伸引物與延伸產物的分子量要在4500-8500Da之間。將多個檢測位點的擴增引物與擴增引物混合，延伸引物與延伸引物混合。這樣可以同時檢測多個非連續的SNP位點，提高了效率，節省了成本。作為本發明的另一個優選的實施方式，還可以將連續多個突變位點標記在同一條核苷酸序列上，且共用一對擴增引物，兩端的突變位點采取向左右兩側設計，左側突變位點的延伸引物采取正向設計，右側突變位點的延伸引物采取反向設計；位于中間的突變位點的延伸引物有多條，且包含其上游的突變位點可能存在的所有核苷酸情況。這樣，可以同時檢測連續突變的多個位點，節省了成本，縮短了周期，提高了效率。具體來講，可以采用如下方法設計連續多個突變位點的引物若所述左側突變位點為Snpl，中間的突變位點為Snp2，右側突變位點為Snp3，Snpl/Snp2/Snp3所在序列為......TCAGCGATAT[C/T]C[G/A][T/G]AATTCGTACGATGATCGCTAGA......，貝USnpl[C/T]，右側SNP位點，正向設計，延伸引物為......TCAGCGATATSnp3[T/G]，左側SNP位點，反向設計，延伸引物為......TACGAATTSnp2[G/A]，中間SNP位點，簡并引物，延伸引物為......AGCGATATCC和......AGCGATATTC。PCR擴增在本方法的步驟(3)中，對目的片段進行PCR擴增，擴增反應的條件為本領域技術人員所熟知，在本發明的實施例中也詳細描述了示例性的反應條件。并且根據所使用的本發明引物的具體序列，對擴增反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域技術人員能力范圍之內。在本發明的擴增步驟中，使用的擴增引物對選自具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示序列的多核苷酸的組合。在本發明的另一個優選實施方案中，本發明的方法還包括在反應中設置陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有1000拷貝/mlHBVDNA的血清，所述陰性對照為不含有HBVDNA的血清，將對照樣本與待測樣本按照相同的反應過程進行反應和測試，可以驗證該次檢測的有效性。SAP酶處理在本發明方法的步驟(4)中，對擴增產物進行SAP酶(蟲下堿性磷酸酶)處理，除去所述擴增產物中含有的dNTP，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個堿基。延伸反應在本發明方法的步驟(5)中，對經過SAP處理的擴增產物進行延伸反應，在延伸反應中使用本發明的延伸引物，所得到的延伸產物與延伸引物的區別僅在于其3'端多了一個堿基(ddNTP)。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個堿基，又能使整個系統的分辨率提高。在本發明的方法中使用經過質量修飾的ddNTP，進行質量修飾的主要目的是為了使各延伸產物之間的分子量差距加大，從而提高后續的質譜分析的分辨率。對ddNTP進行質量修飾的方法是已知的。7作為本發明的一個優選實施方式，四種ddNTP為購自美國Sequenom公司的市售產品，其分子量分別是ddATP，271.2Da，ddTTP327.1Da，ddCTP247.2Da，和ddGTP287.2Da;其中分子量差異在16Da以上。在本發明的方法中，所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:4至SEQIDNO:12任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發明的一個優選實施方案中，所使用的延伸引物還包括具有SEQIDN0:13至SEQIDN0:16任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發明的具體實施方案中，在9微升的反應體系中進行延伸反應，可以根據待檢測的位點而使用一種延伸引物或多種的延伸引物的組合，在反應體系中可能含有的各種延伸引物的濃度如下表1所示。表1:延伸反應中所用的延伸引物的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>應該說明的是，在具體的延伸反應中可以使用上表所示引物的一種或多種，如果使用其中的幾種引物，則所述引物在反應體系中的濃度如上表1所示。但是本領域技術人員能夠理解，延伸引物的濃度并不是延伸反應的關鍵因素，完全可以對上表所示的引物濃度做出各種改變或變化，也同樣能夠實現延伸反應。J1H謹斤在本發明方法的步驟(7)中，對經過純化的延伸產物進行質譜分析，從而確定各延伸產物的分子量。在本發明的優選實施方式中，質譜儀選擇基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)。該飛行時間質譜基因分型系統的反應體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，也不需要引入各種標記物，因而準確性高。在所述方法中，將純化產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然后用瞬時納秒強激光激發，由于基質分子經輻射吸收能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附并轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達檢測器。這樣，采用質譜儀檢測待檢測突變位點不僅方便，而且靈敏度高、準確性高。與現有技術相比，本發明采用基質輔助激光解吸附/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)系統進行檢測，在質譜技術中使用的試劑耗材相對簡單且穩定，不需要熒光染料、特殊的酶等價格昂貴的試劑，反應可以在微量體系中進行，減少樣品和各種消耗品的使用。由于質譜技術直接檢測DNA的分子量(質荷比)，直接確定堿基的類型，不需要經過任何形式的信號轉換，理論上只要有一個拷貝的SNP片斷被擴增即可識別，杜絕了假陰性發生的可能。此外質譜技術還有自動化、高通量檢測特點。質譜技術與多引物延伸技術相結合，可以在一個反應體系中同時檢測多個突變位點，PCR反應可以在微量體系中進行，結合DNA自動提取設備、多重PCR引物設計軟件及數據分析軟件，大大減輕了工作量，提高了檢測通量。為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及下述實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例1:檢測乙肝病毒逆轉錄酶區180位密碼子的基因型(1)設計擴增乙肝病毒逆轉錄酶區180位密碼子的引物乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus,I-tBV)感染是嚴重的世界性衛生問題，每年約有近百萬人死于乙肝病毒感染引起的各類疾病。目前治療乙肝的藥物主要是核酸類似物，包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等，這類藥物在病毒DNA復制過程中替代正常dNTP，從而導致DNA合成終止。然而，長期服用某種藥物會導致耐藥性的產生，不僅達不到治療的目的，反而導致反彈。如果對乙肝患者體內的耐藥變異進行研究，即可揭示人群中不同個體對相同藥物的敏感性差異的根本原因，也有助于研究者篩選更合適的藥物。其中，乙肝病毒基因組逆轉錄酶區180位密碼子C/TTG變成ATG，使得氨基酸由亮氨酸變為甲硫氨酸(L180M)，從而產生對抗病毒藥物拉米夫定的耐藥性。對于該突變位點的質譜檢測，首先根據乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NC_003977)，設計一對PCR引物和一條延伸引物，擴增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDN0:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3';(SEQIDNO:2);9延伸引物命名為引物180，序列為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3'(SEQIDNO:4)。其中，小寫字母部分表示10bp的tag。(2)擴增含有乙肝病毒逆轉錄酶區180位密碼子的片段PCR反應片段長度大小為101bp，反應體系為5iil，其中含有4mMMg2+，1X緩沖液，100nM擴增引物，500iiMdNTP，0.5UHottarTaq酶(除擴增引物外，其余均購自美國Sequenom公司)；反應條件95。C15min;45個循環(94°C20s，56°C30s，72°Clmin);72。C3min。PCR反應后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可直接用于后續的SAP處理。(3)SAP處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)；反應總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個堿基。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在-201:保存數周，也可直接用于后續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應后得到一個片段大小為18bp的產物，它與延伸引物(17bp)的區別僅在于3'端多了一個堿基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個堿基，又能使整個系統的分辨率提高。延伸反應體系為9iU，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、iPLEX酶(均購自美國Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應濃度因反應次數的不同而不同(其中所使用的延伸引物180的濃度如表1所示)，反應總體積為9iil(2iil延伸反應混合物+7ii1SAP處理產物)。反應條件94°C30s;40個循環[94°C5s，5個小循環(52°C5s，8(TC5s)]，72°C3min。反應完成后的延伸產物可在4°C保存數天，也可在_201:保存數周，也可直接用于后續的樹脂純化。[OO98](5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂(購自美國Sequenom公司，型號08040)，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質譜檢測。(6)質譜檢測純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入Sequenom質譜儀的真空管中，然后用瞬時納秒強激光激發，進行MALDI-TOF-MS分析。判定標準如下如果沒有發生耐藥突變，延伸產物的質譜結果為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCC-3'或5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCT-3'，分子量分別為5335.5Da和5415.4Da;如果發生耐藥突變，延伸產物的質譜結果為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCA-3'，分子量為5359.5Da。檢測結果如下其中樣本1A為陰性對照樣本，樣本1B和1C為待測樣本。對于陰性對照樣本1A，由于其沒有發生耐藥突變，因此延伸產物的分子量為5415.4Da(見圖1A);對于樣本1B，質10譜檢測到的分子量為5359.5Da，可以確定樣本lB發生了耐藥突變(見圖1B);對于樣本1C，質譜圖上出現了兩個峰，分別在5359.5Da和5415.4Da，可以推斷該樣本中存在野生株和突變株(見圖1C)。實施例2:檢測乙肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的基因型(1)設計擴增乙肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的引物乙肝病毒基因組逆轉錄酶區181位密碼子GCT變成GTT或ACT，使得氨基酸由丙氨酸變為纈氨酸或蘇氨酸(A181V/T)，從而產生對抗病毒藥物阿德福韋酯的耐藥性。對于該突變位點的質譜檢領"根據乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NC_003977)，設計一對擴增引物和5條延伸引物，擴增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDNO:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；(SEQIDNO:2);其中，小寫字母部分表示10bp的tag。由于181位點的上游180位點也容易發生突變，即C/TTG也會變成ATG，而下游184位點也會發生突變，由ACT變成GGT，所以針對181密碼子的第一個堿基設計了3條簡并延伸引物，分別為181#1#1:5'-TCAGTCCGTTTCTCTTG-3'(SEQIDNO:5);181#1#2:5'-TCAGTCCGTTTCTCCTG-3，(SEQIDNO:6);禾口181#1#3:5'-TCAGTCCGTTTCTCATG-3'(SEQIDNO:7)。針對其第二個密碼子設計了2條簡并延伸引物，分別為181#2#1:5，-ATGGCACTAGTAAACTGA-3'(SEQIDNO:8);禾口181#2#2:5'-TGGCACTACCAAACTGA-3(SEQIDNO:9)。(2)擴增含有乙肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的片段PCR反應片段長度大小為98bp，反應體系為5iil，其中含有4mMMg2+，1X緩沖液，100nM擴增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除擴增引物外，其余均購自美國Sequenom公司)；反應條件95。C15min;45個循環(94。C20s，56。C30s，72。Clmin);72°C3min。PCR反應后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在-2(TC保存數周，也可直接用于后續的SAP處理。(3)SAP酶處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)，反應總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個堿基。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可直接用于后續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應后得到一個片段大小為18bp的產物，它與延伸引物的區別僅在于3'端多了一個堿基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個堿基，又能使整個系統的分辨率提高。延伸反應體系為9ii1，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、iPLEX酶(均購自美國Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應濃度因反應次數的不同而不同(其中所使用的各延伸引物的濃度如表l所示)，反應總體積為9iil(2iU延伸反應混合物+7iUSAP處理產物)。反應條件94t:30s;40個循環[94°C5s，5個小循環(52°C5s，8(TC5s)]，72°C3min。反應完成后的延伸產物可在4"保存數天，也可在-2(TC保存數周，也可直接用于后續的樹脂純化。(5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂(購自美國Sequenom公司，型號08040)，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質譜檢測。(6)質譜檢測純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入Sequenom質譜儀的真空管中，然后用瞬時納秒強激光激發，進行MALDI-TOF-MS分析。分型結果依據分子量來判定，標準如下181#1#1，野生型為5405.5Da，突變型為5389.5Da;181#1#2，野生型為5390.5Da，突變型為5374.5Da;181#1#3，野生型為5414.6Da，突變型為5398.5Da;181#2#1，野生型為5818.8Da，突變型為5802.8Da;181#2#2，野生型為5450.6Da，突變型為5434.6Da。檢測結果如下樣本2A、2B、2C、2D和2E為臨床待測樣本。樣本2A，由181#1#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5405.5Da禾口5389.5Da(見圖2A);樣本2B，由181#1#2檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5390.5Da和5374.5Da(見圖2B);樣本2C，由181#1#3檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5414.6Da和5398.5Da(見圖2C);樣本2D，由181#2#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5818.8Da和5802.8Da(見圖2D);樣本2E，由181#2#2檢測到突變型，因此延伸產物的分子量為5434.6Da(見圖2E)。實施例3:同時檢測乙肝病毒逆轉錄酶區180、204、250和184位密碼子的基因型(1)設計擴增乙肝病毒逆轉錄酶區180、204、250和184位密碼子的引物乙肝病毒基因組逆轉錄酶區180位密碼子TTG或CTG可突變成ATG，204位密碼子ATG可突變成ATT，250位密碼子ATG可突變成GTG，以及184位密碼子ACT可突變成GCT，從而產生抗病毒藥物耐藥性。對于這些突變位點的質譜檢測，根據乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NC_003977)，設計1對擴增引物和4條延伸引物，擴增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDNO:1);下游5'-acgttggatgACCCCAACTTCCAATTACAT-3，(SEQIDNO:3);其中，小寫字母部分表示lObp的tag。4條延伸引物分別對應4個檢測位點，引物序列如下180位點5，-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3，(SEQIDNO:4);204位點5，-CCCCCAATACCACATCATC-3，(SEQIDNO:10);250位點5，-GGGCTACTCCCTTAACTTC-3'(SEQIDNO:11);禾口184位點5，-ACTGAACAAATGGCACTAC-3'(SEQIDNO:12)。(2)擴增含有乙肝病毒逆轉錄酶區181位密碼子的片段PCR反應片段長度大小為293bp，反應體系為5iil，其中含有4mMMg2+，lX緩沖液，100nM擴增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除擴增引物外，其余均購自美國Sequenom公司)；反應條件95。C15min;45個循環(94°C20s，56。C30s，72。Clmin);72。C3min。PCR反應后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可直接用于后續的SAP處理。(3)SAP酶處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)，反應總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產物)。反應條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個堿基。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可直接用于后續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應后得到4個片段大小為18-29bp的產物，它與延伸引物的區別僅在于3'端多了一個堿基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個堿基，又能使整個系統的分辨率提高。延伸反應體系為9ii1，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、iPLEX酶(均購自美國Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應濃度因反應次數的不同而不同(其中所使用的各延伸引物的濃度如表1所示)，反應總體積為9iil(2iU延伸反應混合物+7iUSAP處理產物)。反應條件94t:30s;40個循環[94°C5s，5個小循環(52°C5s，80°C5s)]，72°C3min。反應完成后的延伸產物可在4"保存數天，也可在-2(TC保存數周，也可直接用于后續的樹脂純化。[OH7](5)樹脂純化在延伸反應的產物中加入6mg樹脂(購自美國Sequenom公司，型號08040)，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質譜檢測。(6)質譜檢測純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入Sequenom質譜儀的真空管中，然后用瞬時納秒強激光激發，進行MALDI-TOF-MS分析。分型結果依據分子量來判定，標準如下180位密碼子，野生型為5335.5Da，突變型為5359.5Da;204位密碼子，野生型為5868.9Da，突變型為5892.9Da;250位密碼子，野生型為5985.9Da，突變型為6001.9Da;184位密碼子，野生型為6116.9Da，突變型為6037.0Da。檢測結果如下樣本3A為臨床待測樣本。從圖中可以看出，通過這一次反應，實現了4個位點同時檢測(圖3A)。其中檢測到180位點為野生型，分子量為5335.5Da(圖3B);204位點為野生型，分子量為5868.9Da(圖3C);250位點為野生型，分子量為5985.9Da(圖3D);184位點為突變型，分子量為6037.ODa(圖3E)。實施例4:同時檢測乙肝病毒逆轉錄酶區的180、181、184、202、204、236和250位點的基因型在本實施例中，通過使用本發明的特異性引物，可以同時檢測乙肝病毒逆轉錄酶區中的rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一種或幾種突變。(1)引物設計根據乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號NCJ)03977)，設計了一對擴增引物，該擴增引物3'位置與基因組序列有12個堿基的完全匹配，且該擴增引物帶了IO個堿基acgttggatg的標簽序列；同時還設計了12條延伸引物，這些延伸引物的長度為17-28堿基，并與突變位點的3'端的至少9個堿基完全匹配；所述延伸引物與延伸產物之間，各個型別的延伸產物間的分子量差異不小于9Da。擴增引物經過PAGE純化，延伸引物經過HPLC純化。所使用的擴增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDN0:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；(SEQIDNO:2);其中，小寫字母部分表示10bp的tag。所用的延伸弓I物的序列參見表2表2:延伸引物的名稱和序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(2)PCR擴增隨機選擇了11個臨床血清樣本(分別命名為4A至4K)，分別從血清中提取DNA進行測試，同時還在反應中設置陽性對照和陰性對照，陽性對照為含有1000拷貝/mlHBVDNA的血清，陰性對照為不含有HBVDNA的血清。PCR反應片段長度大小為273bp，反應體系為5iil，其中含有4mMMg2+，lX緩沖液，100nM擴增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除擴增引物外，其余均購自美國Sequenom公司)；反應條件95。C15min;45個循環(94°C20s，56°C30s，72。Clmin);72°C3min。PCR反應后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點的核苷酸序列的拷貝數得到了放大。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可直接用于后續的SAP處理。(3)SAP處理PCR反應產物經過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)，反應總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產物)。反應條件為37°C°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續反應中，以確保延伸反應時只延伸一個堿基。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在-201:保存數周，也可直接用于后續的延伸反應。(4)延伸反應延伸反應后得到ll個片段大小為18-29bp的產物，它與延伸引物的區別僅在于3'端多了一個堿基。延伸反應所使用的原料是經過質量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應只連接一個堿基，又能使整個系統的分辨率提高。延伸反應體系為9ii1，緩沖液、ddNTPs(質量經過修飾)、iPLEX酶(均購自美國Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應濃度因反應次數的不同而不同，反應總體積為9iil(2iil延伸反應混合物+7ii1SAP處理產物)(所使用的各延伸引物的濃度見表l)。反應條件94。C30s;40個循環[94。C5s，5個小循環(52。C5s，80。C5s)]，72。C3min。反應完成后的延伸產物可在4。C保存數天，也可在_20°C保存數周，也可直接用于后續的樹脂純化。在本實施例中，還使用了如下所述的各引物組合進行延伸反應和隨后的質譜測序(l)將180、204、250、184組合用于一個延伸反應體系并將反應產物同時置于質譜儀的一個well中進行檢測；(2)將236、181#1#1、181#2#1、202組合用于一個延伸反應體系并將反應產物同時置于質譜儀的一個well中進行檢測；(3)將181#1#2、181#2#2、204#1、184#2組合用于一個延伸反應體系并將反應產物同時置于質譜儀的一個well中進行檢測。(5)采用樹脂純化延伸反應產物。在延伸反應的產物中加入6mg樹脂(購自美國Sequenom公司，型號08040)，上下顛倒30min。經過本步反應，樹脂將充分與反應體系中的陽離子結合，從而使反應體系脫鹽。反應完成后的純化產物可在4t:保存數天，也可在_201:保存數周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質譜檢測。(6)質譜檢測純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入Sequenom質譜儀的真空管中，然后用瞬時納秒強激光激發，進行MALDI-TOF-MS分析。從而確定待檢測HBV基因耐藥突變位點的基因型。15質譜檢測的結果見圖4A-4K和圖5樣本4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K為臨床待測樣本，樣本4A，由180檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5415.4Da和5359.5Da(見圖4A);樣本4B，由181#1#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5405.5Da和5389.5Da(見圖4B);樣本4C，由181#2#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5818.8Da和5802.8Da(見圖4C);樣本4D，由184#1檢測到突變型，因此延伸產物的分子量為6116.9Da(見圖4D);樣本4E，由184#2檢測到突變型，因此延伸產物的分子量為5747.8Da(見圖4E);樣本4F，由202檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5767.7Da禾口5807.6Da(見圖4F);樣本4G，由204#1檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5972.8Da和5892.9(見圖4G);樣本4H，由204檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5868.9Da禾口5908.9Da(見圖4H);樣本41，由204檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5868.9Da和5892.9(見圖41);樣本4J，由236檢測到突變型，因此延伸產物的分子量分別為6512.2Da(見圖4J);樣本4K，由250檢測到野生型和突變型，因此延伸產物的分子量分別為5985.9Da和6001.9Da(見圖4K).圖5為使用延伸引物236、181#1#1、181#2#1、202同時對測試樣本進行檢測的結果。對樣本的檢測結果顯示，所述樣本的181#1#1位點的延伸產物分子量為5405.5Da，因此該位點為野生型，；181#2#1位點的延伸產物分子量為5818.8Da，因此該位點為野生型；202位點的延伸產物分子量為5767.7Da，因此該位點為野生型；236位點的延伸產物分子量為6536.2Da，因此該位點為野生型。圖6為使用延伸引物181#1#2、181#2#2、204#1、184#2同時對測試樣本進行檢測的結果。對樣本的檢測結果顯示，所述樣本的181#1#2位點的延伸產物分子量為5390.5Da，因此該位點為野生型，；181#2#2位點的延伸產物分子量為5450.6Da，因此該位點為野生型；204#1位點的延伸產物分子量為5972.8Da，因此該位點為野生型；184#2位點的延伸產物分子量為5787.8Da，因此該位點為野生型。從上述結果可以看出，使用本發明的方法和引物檢測HBV病毒的耐藥性突變位點，可以在一次質譜檢測中同時檢測多個突變位點的多種突變型，這與現有技術相比，極大地提高了檢測效率，并降低了檢測成本。以上所述僅為本發明的優選和具體的實施方案，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。序列表〈110〉深圳華大基因科技有限公司〈120〉一種HBV基因的核苷酸突變位點的檢測方法〈130>CP1091109/CB〈160>16〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1acgttggatgaagattcctetgggagtggg30〈210>2〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2acgttggatgagccctacgaaccactgaac30<210>3〈211〉30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3acgttggatgaccccaacttccaattacat30〈210>4〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gcctcagtccgtttctc17〈210>5〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5tcagtccgtttctcttg17〈210>6〈211>17〈212>DNA<213>人工序列<400>6tcagtccgtttctcctg17〈210>7〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tcagtccgtttctcatg1717〈210>8〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8atggcactagtaaactga18〈210>9〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9tggcactaccaaactga17〈210>10〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10cccccaataccacatcatc19〈210>11〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11gggctactcccttaacttc19〈210>12〈211>19<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>12actgaacaaatggcactac19〈210>13〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13gtctttgggtatacatttaa〈210>14〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>14cccactgtttggctttca〈210>15〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>15cccaataccacatcatcca〈210>16〈211>18〈212>醒<213>人工序列〈400>163ctg朋c朋3tggcacte權利要求一種HBV基因的核苷酸突變位點的檢測方法，包括如下步驟(1)針對待檢核苷酸序列的突變位點，確定突變位點在待檢序列中的位置；(2)根據突變位點的位置和基因型設計一對擴增引物和至少一條延伸引物，其中，擴增引物的長度為30-50bp，其5’端各含10bp的tag；延伸引物的長度為17-28bp，并且其3’末端堿基與突變位點3’端相鄰的堿基完全匹配；(3)使用所述擴增引物進行PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs；(5)使用所述延伸引物進行延伸反應，在延伸引物的3’端連接一個堿基，且該堿基與突變位點上的堿基互補，延伸反應所使用的原料是以擴大分子量差異為目的進行過質量修飾的四種ddNTP分子；(6)采用樹脂純化延伸反應產物；(7)將純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然后用瞬時納秒強激光激發進行質譜檢測，確定突變的基因型；其中所述步驟(2)所使用的擴增引物對為具有下列序列的多核苷酸的組合SEQIDNO1和SEQIDNO2，或SEQIDNO1和SEQIDNO3；并且其中所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO4至SEQIDNO12任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。2.如權利要求1所述的方法，其中所述步驟(5)中所使用的延伸引物還包括了具有SEQIDNO:13至SEQIDNO:16任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。3.如權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸突變位點為乙肝病毒逆轉錄酶區中的180、181、184、202、204、236和250位點中的一種或幾種。4.如權利要求3所述的方法，其中所述核苷酸突變位點的突變為rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一種或幾種。5.如權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括在反應中設置陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有IOOO拷貝/mlHBVDNA的血清，所述陰性對照為不含有HBVDNA的血清。6.—種多核苷酸，具有SEQIDN0:1至SEQIDNO:16任一項所示的核苷酸序列。7.具有SEQIDNO:l至SEQIDNO:16任一項所示序列的多核苷酸用于檢測HBV基因的核苷酸突變位點的用途。8.—種用于HBV基因的核苷酸突變位點的檢測方法中的引物組合，包括選自具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示序列的一對多核苷酸作為擴增引物，以及選自具有SEQIDNO:6至SEQIDNO:16任一項所示序列的一種或多種多核苷酸作為延伸引物。全文摘要本發明提供了一種檢測基因突變位點的方法，包括如下步驟(1)確定HBV基因逆轉錄酶區的耐藥突變位點；(2)根據這些突變位點設計出擴增引物和每個突變位點的延伸引物；(3)PCR擴增；(4)SAP酶處理；(5)延伸反應；(6)采用樹脂純化延伸反應產物；(7)質譜檢測，確定待檢測HBV基因耐藥位點。采用本發明提供的方法，解決了現有檢測方法靈敏度低、準確率有限，以及通量低，成本高的問題。本發明還提供了檢測HBV基因的耐藥性突變位點的方法。此外，本發明還提供了用于上述方法的特異性引物及其用于上述檢測方法的用途。文檔編號C12R1/93GK101760566SQ200910178449公開日2010年6月30日申請日期2009年9月29日優先權日2009年9月29日發明者劉興旺,華桑,葉葭,呂芳,吳平,喻爽,張俊青,張秀芝,易吉,易鑫,朱德琴,朱江陽,李國宏,李晶晶,楊玲,王威,田超,聶喜芳,韋清,高揚申請人:深圳華大基因科技有限公司