專利名稱：：與人結腸癌相關的基因和多肽的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物科學領域，更具體地涉及癌癥研究領域。本發明具體涉及與細胞增殖機制有關的新基因"WW3，CX4Z)^L7和GCT/Z)/以及由這些基因編碼的多肽。本發明的基因和多肽可用于例如診斷細胞增殖性疾病，以及用作靶分子來開發針對所述疾病的藥物。
背景技術：
：胃癌和結直腸癌是世界范圍內癌癥死亡的誘因。盡管最近在診斷和治療策略方面取得了進步，但晚期癌癥患者的預后仍然很差。盡管分子研究揭示出腫瘤抑制基因和/或癌基因的改變與癌癥發生有關，但其精確的機理仍有待闡明。cDNA微陣列技術使人們能夠獲得正常和惡性細胞中基因表達的全面分布圖，并能比較惡性和相應正常細胞中的基因表達(Okabeetal.,CancerRes61:2129-37(2001);Linetal"Oncogene21:4120-8(2002);Hasegawaetal"CancerRes62:7012-7(2002))。該方法能披露癌癥細胞的復雜性質，并有助于人們了解癌癥發生的機理。鑒定出腫瘤中的失控基因能夠更準確地診斷個體癌癥，并可開發新的治療把(BienzandClevers,Cell103:311-20(2000))。為了從整個基因組的角度揭示腫瘤發生的機理，并且找出用于診斷和新型治療藥開發的靶分子，本發明人使用23040個基因的的cDNA微陣列來分析腫瘤細胞的基因表達分布圖(Okabeetal.，CancerRes61:2129-37(2001);Kitaharaetal"CancerRes61:3544-9(2001);Linetal"Oncogene21:4120-8(2002);Hasegawaetal.,CancerRes62:7012-7(2002》。被設計用于揭示癌癥發生機理的研究推動了抗-腫瘤藥劑分子靶的鑒定。例如，最初被開發用于抑制與Ras有關的生長-信號傳導途徑、其激活依賴于翻譯后法尼基化的法尼基轉移酶抑制劑(FTI)能在動物模型中有效治療Ras-依賴型腫瘤(Heetal.，Cell9—9:335-45(1999))。聯合使用抗癌藥物和抗-HER2單克隆抗體trastuzumab對人進行了臨床試驗，以抵銷原癌基因受體HER2/neu的作用；在乳腺癌患者身上已獲得改善的臨床反應和整體存活率(Linetal.,CancerRes61:6345-9(2001))。選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571被開發用于治療慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的組成型激活對白細胞轉化起決定性作用。這些類型的藥劑被設計用于抑制特定基因產物的致癌活性(Fujitaetal.,CancerRes61:7722-6(2001))。因此，通常在癌細胞中被上調的基因產物可用作開發新抗癌藥劑所用的潛在靶。已闡明CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)能識別MHCI類分子上呈遞的腫瘤-相關抗原(TAA)所衍生的表位肽，并能裂解腫瘤細胞。由于MAGE家族是作為第一例TAA被發現的，因此，使用免疫學方法已發現了多種其它的TAA(Boon,IntJCancer54:177-80(1993);Boonand穆derBruggen,JExpMed183:725-9(1996);vanderBruggenetal"Science254:1643-7(1991);Brichardetal.,JExpMed178:489-95(1993);Kawakamietal.,JExpMed180:347-52(1994))。目前，一些已發現的TAA作為免疫治療的靶正處于臨床研發階段。迄今為止已發現的TAA包括MAGE(vanderBruggenetal"Science254:1643-7(1991))、gp1OO(Kawakamietal"JExpMed180:347-52(1994))、SART(Shichijoetal"JExpMed187:277-88(1998))和NY-ESO-l(Chenetal.，ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8(1997))。另一方面，已證實在肺瘤細胞中特異性過表達的基因產物能作為誘導細胞免疫應答的靶被識別。所述基因產物包括p53(Umanoetal"BritJCancer84:1052-7(2001))、HER2/腿(Tanakaetal"BritJCancer84:94-9(2001))、CEA(Nukayaetal.,IntJCancer80:92-7(1999))等。盡管已在與TAA有關的基礎和臨床研究中取得了顯著進步(Rosenbegetal.,NatureMed4:321-7(1998);Mukherjietal.，ProcNatlAcadSciUSA92:8078-82(1995);Huetal.,CancerRes56:2479-83(1996)),但僅有少量候選TAA可用于治療腺癌，包括結直腸癌。能在癌細胞中大量表達，同時其表達也僅局限于癌細胞的TAA是理想的免疫治療候選靶。另外，鑒定能誘導強有力的特異性抗腫瘤免疫應答的新TAA有望促進肽免疫策略在多種類型的癌癥中的臨床使用(BoonandcanderBruggen,JExpMed183:725-9(1996);vanderBruggenetal.,Science254:1643-7(1991);Brichardetal.,JExpMed178:489-95(1993);Kawakamietal"JExpMed180:347-52(1994);Shichijoetal.,JExpMed187:277-88(1998);Chenetal.,ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8(1997);Harris,JNatlCancerInst88:1442-5(1996);Butterfieldetal"CancerRes59:3134-42(1999);Vissersetal"CancerRes59:5554-9(1999);vanderBurgetal"JImmunol156:3308-14(1996);Tanakaetal"CancerRes57:4465-8(1997);Fujieetal,,IntJCancer80:169-72(1999);Kikuchietal.,IntJCancer81:459-66(1999);Oisoetal.,IntJCancer81:387-94(1999))。據重復報道，得自某些健康供體的經肽刺激的外周血單核細胞(PBMC)對肽反應產生顯著水平的IFN-y,但在51Cr-釋放試驗中卻很少以HLA-A24或-A0201限制性方式發揮抗腫瘤細胞的細胞毒性(Kawanoetal.,CanceRes60:3550-8(2000);Nishizakaetal"CancerRes60:4830-7(2000);Tamuraetal"JpnJCancerRes92:762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201是日本人以及白種人中最常見的HLA等位基因之一(Dateetal.,TissueAntigens47:93-101(1996);Kondoetal.,JImmunol155:4307-12(1995);Kuboetal.，JImmunol152:3913-24(1994);Imanishietal"ProceedingoftheeleventhInternationalHictocompatibilityWorkshopandConferenceOxfordUniversityPress,Oxford,1065(1992);Williamsetal,,TissueAntigen49:129(1997))。因此，由這些HLA呈遞的癌癥抗原肽對于治療日本人和白種人的癌癥特別有用。另外，已知低-親和性CTL的體外誘導通常是因為使用了高濃度的肽，在抗原呈遞細胞(APC)上產生了高水平的特定肽/MHC復合物，而所述復合物能有效激活這些CTL(Alexander國Milleretal.，ProcNatlAcadSciUSA93:4102-7(1996》。發明概述本發明的目的是提供與胃癌或結腸癌細胞的增殖機理有關的新蛋白質和編碼所述蛋白質的基因，以及所述蛋白質和基因的制備方法和使用它們診斷和治療胃癌或結直腸癌的方法。為了揭示胃癌和結直腸癌的癌癥發生機理，并鑒定出新的診斷標記和/或治療這些腫瘤的藥物靶，本發明人使用含有23040個基因的全-基因組cDNA微陣列分析了基因在胃和結腸癌癥發生中的表達分布圖。從藥物學的觀點看，在實際操作中抑制致癌信號比激活腫瘤-抑制效應更加容易。因10此，本發明人檢索了在胃和結腸癌癥發生過程中被上調的基因。從在胃癌中一般被上調的轉錄物中，將新的人基因CXlDW/(柯薩奇病毒和腺病毒受體樣1)和GCCZD"在胃癌中被上調)分別定位于染色體帶3ql3和7p14。CX4Z)iZ7或GC77Z)7的基因轉移促使細胞增殖。另外，通過轉染其特異性的反義S-寡核苷酸或小的干擾RNA來降低CX4Di^/或GCtZD7表達即可抑制胃癌細胞生長。很多抗癌藥物，如DNA和/或RNA合成抑制劑、代謝抑制因子和DNA嵌入劑不僅對癌細胞有毒，對正常生長的細胞也有毒。然而，抑制CXADRL1表達的藥劑對其它器官卻沒有不利的作用，這是.因為該基因的正常表達局限于睪丸和卵巢，因此所述藥劑對治療癌癥非常重要。另外，從在結直腸癌中一般被上調的轉錄物中，鑒定出定位于染色體帶17pter-pl3.1的基因iiVF43(環指蛋白43)。另外，酵母雙-雜合篩選試驗(two-hybridscreeningassay)揭示出RNF43蛋白與NOTCH2或STRIN結合。NOTCH2是大的跨膜受體蛋白，該蛋白質是進化上保守的細胞間信號傳導機制的組分。NOTCH2是Notch信號傳導途徑的蛋白質成員，據報道，它與腎臟中的腎小球發生以及心臟和眼血管系統的發育有關(McCrightetal.:Development128:491-502(2001))。據報道，三種5/Serrate/Lag隱2(DSL)蛋白，即51、Jaggaedl和Jaggaed2是NOTCH2的功能配體(Shimizuetal.,MolCellBiol20:6913-22(2000))。通過包括受體的蛋白酶解和NOTCH蛋白胞內結構域的核轉位的過程，在細胞內傳遞由Notch信號傳導途徑中的配體結合誘導的信號(有關評述可參見Artavanis-Tsakonasetal.，AnnuRevCellBiol7:427-52(1999);Weinmaster，CurrOpinGenetDev10:363-9(2000))。另外，通過轉染與i^A^^相對應的特異性反義S-寡核苦酸或小的干擾RNA來降低i^F43表達即可抑制結腸癌細胞的生長。如上所述，很多抗癌藥物不僅對癌細胞有毒，對正常生長的細胞也有毒。然而，能抑制RNF43表達的藥劑對其它器官卻沒有不利的影響，這是因為該基因的正常表達局限于胎兒，更具體地為胎肺和胎腎，因此所述藥劑對治療癌癥非常重要。因此，本發明提供了分離的新基因CX4D/I7，GC77D/和iWFW,這些基因是候選的癌癥診斷標記，并且是可用于開發新診斷策略和有效抗癌劑的理想的潛在靶。另外，本發明提供了由這些基因編碼的多肽及其制備方法和用途。更具體地，本發明提供了下述內容ii本申請提供了新的人多肽CXADRLl,GCUD1和RNF43或其功能等同物，所述多肽能促進細胞增殖，并且在如胃癌和結直腸癌的細胞增殖疾病中被上調。在優選實施方案中，CXADRL1多肽包括推定的431個氨基酸長的蛋白質，所述蛋白質與CXADR(柯薩奇病毒和腺病毒受體)有約37%的同一性。CXADRL1由SEQIDNO:l的開放閱讀框編碼，并在密碼子29-124和158-232處含有兩個免疫球蛋白結構域，在密碼子246-268處含有跨膜結構域。CXADRLI多肽優選包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本申請還提供了由CX4Z)M7多核苷酸序列的至少一部分或與SEQIDNO:l所示序列至少30%、更優選至少40%互補的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質。另一方面，在優選實施方案中，GCUD1多肽包括推定的414個氨基酸長的蛋白質，該蛋白質由SEQIDNO:3的開放閱讀框編碼。GCUD1多肽優選包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。本申請還提供了由GCW)/多核苷酸序列的至少一部分或與SEQIDNO:3所示序列至少15%、更優選至少25%互補的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質。另外，在優選實施方案中，RNF43多肽包括推定的由SEQIDNO:5的開放閱讀框編碼的783個氨基酸長的蛋白質。RKF43多肽優選包括SEQIDNO:6所示的氨基酸序列，并且在密碼子272-312處含有環指基元。RNF43多肽與環指蛋白同系物DKFZp566H073.1(GenBank登錄號為T08729)的同源性為38%。本申請還提供了由iMW3多核苦酸序列的至少一部分或與SEQIDNO:5所示序列至少30%、更優選至少40%互補的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質。本發明還提供了新的人基因CX4DM/和GCt/D/,與相應的非癌粘膜相比，在絕大多數胃癌中，所述基因的表達顯著升高。除了胃癌外，CXADRL1和GCUD1還在結直腸癌和肝癌中高表達。分離的CX4DiL7基因包括SEQIDNO:l所述的多核苷酸序列。CX4Z)處7cDNA特別地包括3423個核苷酸，其中含有1296個核苦酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:1)。本發明還包括能與SEQIDNO:l所示多核苷酸序列雜交并與其至少30%、更優選至少40%互補的多核苷酸，雜交和互補的程度應使其能編碼CXADRL1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO:l的筒并和等位突變體。另一方面，分離的GCt/D/基因包括SEQIDNO:3所述的多核苦酸序列。cDNA特別地包括4987個核香酸，其中含有1245個核苦酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:3)。本發明還包括能與SEQIDNO:3所示多核苦酸序列雜交并與其至少15%、更優選至少25%互補的多核苷酸，雜交和互補的程度應使其能編碼GCUD1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO:3的簡并和等位突變體。另外，本發明提供了新的人基因i^MW3，與相應的非癌粘膜相比，在絕大多數結腸癌中，所述基因的表達顯著升高。除了結腸癌外，RNF43還在肺癌、胃癌和肝癌中高表達。分離的i^VFW基因包括SEQIDNO:5所述的多核苷酸序列。iA^V3cDNA特別地包括5345個核苷酸，其中含有2352個核苷酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:5)。本發明還包括能與SEQIDNO:5所示多核普酸序列雜交并與其至少30%、更優選至少40%互補的多核苷酸，雜交和互補的程度應使其能編碼RNF43蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO:5的簡并和等位突變體。本文所用的分離基因是一種多核苷酸，其結構與任何天然多核苷酸結構或橫跨三個以上分離基因的天然基因組多核苷酸的任何片段的結構都不相同。因此，該術語包括例如(a)具有生物體基因組中的天然基因組DNA分子的部分序列的DNA,所述DNA天然存在于所述生物體中；(b)以所得分子不同于任何天然載體或基因組DNA的方式摻入原核或真核載體或基因組DNA的多核香酸；(c)分離的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈反應(PCR)產生的片段或限制性片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因，即編碼融合多肽的基因的一部分。因此，本發明一方面提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離的多核苷酸。優選分離的多核苷酸包括與SEQIDNO:1，3或5所示核苷酸序列至少60%相同的核苦酸序列。更優選分離的核酸分子與SEQIDNO:1,3或5所示核苷酸序列的同一性至少為65%,70%，75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%94%,95%，96%,97%，98%,99%或更高。當分離的多核苦酸的長度長于或等于參照序列，如SEQIDNO:1,3或5時，與參照序列的全長進行比較。當分離的多核苷酸的長度短于參照序列，如短于SEQIDNO:1，3或5時，與相同長度的參照序列的區段進行比較(排除同源性計算所需的任何環)。本發明還提供了生產蛋白質的方法，所述方法是用編碼CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的多核脊酸序列轉染或轉化宿主細胞，并且表達所述多核苷酸序列。另外，本發明提供了含有編碼CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的核苷酸序列的載體，和攜有編碼CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸的宿主細胞。所述載體和宿主細胞可用于生產CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白。本申請還提供了識別CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的抗體。在某種程度上還提供了CZ4Z)^L/,GCC/Z)7或^A^^基因的反義多核苦酸(如反義DNA)、核酶和siRNA(小的干擾RNA)。本發明還提供了診斷細胞增殖性疾病的方法，所述方法包括測定樣本生物樣品中基因的表達水平，將CX4Z)^L/，GC77ZX/4U^VFW基因的表達水平與正常樣品中的相比較，將樣品中CX4Z)^ZJ,GCt/D/威iWFW基因的高表達水平定義為患有細胞增殖性疾病，如癌癥。適于通過CX4Z)i^7或GC[/i)7的表達水平診斷的疾病是胃癌、結直腸癌和肝癌；適于用J^7VFW的表達水平檢測的是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，還提供了篩選可用于治療細胞增殖性疾病的化合物的方法。所述方法包括使CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽與受試化合物接觸，并選擇與CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽結合的受試化合物。本發明還提供了篩選可用于治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括使CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽與受試化合物接觸，并選擇能抑制CXADRL1,GCUD1或RNF43多肽的表達水平或生物活性的受試化合物。另外，本發明提供了篩選可用于治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受試化合物的存在下使CXADRL1與AIP1接觸，并選擇抑制CXADRL1與AIP1結合的受試化合物。另外，本發明提供了篩選可用于治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受試化合物的存在下使RNF43與NOTCH2或STRIN接觸，并選擇抑制RNF43與NOTCH2或STRIN結合的受試化合物。本申請還提供了用于治療細胞增殖性疾病，如癌癥的藥物組合物。藥物組合物可以是例如抗癌劑。藥物組合物可被描述為分別如SEQIDNO:1,3或5所示和所述的CX4Z)虹人GC威iNF^多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。適當的反義S-寡核苷酸具有選自核苷酸序列SEQIDNO:23,25，27，29或31。包括具有SEQIDNO:23或25所示核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的CX4DRL/反義S-寡核苷酸適用于治療胃癌；包括具有SEQIDNO:27或29所示核苦酸序列的反義S-寡核香酸的G07D/反義S-寡核香酸適用于治療胃癌、結直腸癌或肝癌；包括具有SEQIDNO:31所示核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的7iW^反義S-寡核苷酸適用于治療結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。適當的siRNA由一套核苷酸組成，所述核苷酸的序列選自SEQIDNO:40和41，42和43,或62和63。由一套核苷酸序列為SEQIDNO:40和41,或42和43的核苷酸組成的CX4D^ZJsiRNA適用于治療胃癌、結直腸癌或肝癌；由一套核苷酸序列為SEQIDNO:62和63的核苷酸組成的"W^siRNA適用于治療結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。藥物組合物也可以含有通過本發明的治療細胞增殖性疾病的化合物的篩選方法所選擇的化合物。藥物組合物的作用過程需要抑制癌細胞的生長。可將所述藥物組合物施用于哺乳動物，包括人和家養的哺乳動物。本發明還提供了使用本發明提供的藥物組合物治療細胞增殖性疾病的方法。另外，本發明提供了治療或預防癌癥的方法，所述方法包括施用CXADRL1,GCUD1或RNF43多肽的步驟。預期施用CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽能引發抗肺瘤免疫力。因此，本發明還提供了引發抗腫瘤免疫力的方法，所述方法包括施用CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽，以及含有CXADRL1,GCUD1或RNF43多肽的治療或預防癌癥的藥物組合物的步驟。應理解不論是上文的發明概述還是下文的詳細描述都是優選的實施方案，而不是對本發明或本發明的其它可替換實施方案的限制。圖la至ld顯示出爿5"S(CX4D^ZJ)和CW27(G07Z^)在胃癌中的表達。圖la顯示出通過cDNA微陣列檢測獲得的爿5^S在14個原發性胃癌中的相對表達率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器(Cy3和Cy5信號都大于25，000)的14個胃癌中，所有胃癌中的A5^S表達被上調(Cy3:Cy5強度比率〉2.0)。圖lb顯示出通過cDNA微陣列檢測獲得的CS"7在12個原發性胃癌中的相對表達率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器的12個胃癌中，10個胃癌中的CS"/表達被上調(Cy3:Cy5強度比率》.0)。圖lc顯示出使用IO個胃癌病例，經半-定量RT-PCR分析獲得的CX4Z)iL/表達。圖ld顯示出使用9個胃癌病例，經15半-定量RT-PCR分析獲得的GCUD/表達。將04尸D仔的表達用作CX4D^L7和GCC/D7表達分析的內部對照。圖2a和2b顯示出CX4D^L/在多種人組織中的表達以及CXADRL1的推定蛋白質結構和蛋白質基元。圖2a提供照片顯示出經多組織Northern印跡分析獲得的CX!D/^/在多種人組織中的表達。圖2b顯示出CXADRL1的推定蛋白質結構。CX4Z)^L/cDNA由3423個核苷酸組成，其中具有1296個的核苷酸長的ORF,并且由7個外顯子組成。圖3a至3c顯示出CXADRL1的生長-促進作用。圖3a提供照片顯示出被CK4D^Z:/轉染的NIH3T3細胞的集落形成試驗結果。圖3b顯示出經半-定量GL4尸Z)/Z的表達用作內部對照。#2,#5,弁6和弁7皆表示被CXADRL1轉染的NIH3T3細胞。圖3c表示NIH3T3細胞的數目。從統計學上看，NIH3T3-CXADRL1細胞在含有10。/。FBS的培養基中的生長要高于模擬(NIH3T3-LacZ)細胞(P〈0.05)。圖4顯示出被指定用于抑制CX4Z)iL7的反義S-寡核苷酸對MKN-l細胞的生長-抑制作用。經證實CXADRL1-AS4和CXADRL1-AS5能抑制MKN-1細胞的生長。圖5A至5C顯示出CXADRU-siRNA對St-4細胞的生長抑制作用。圖5A提供照片顯示出(7^4/)見/和0^011(對照)在被模擬811^八或0:^\011]11-siRNA弁7轉染的St-4細胞中的表達。圖5B提供照片顯示出經對照-siRNA或CXADRL1^1^八#7處理的存活細胞的Giemsa染色結果。圖5C顯示出經對照質粒或表達CXADRLl-siRNA7的質粒轉染的細胞的MTT試驗結果。圖6提供照片顯示出用抗-CXADRLl抗血清或抗-Flag抗體對表達經Flag-標記的外源性CXADRL1蛋白的細胞的免疫印跡分析結果。圖7顯示出通過酵母雙-雜合系統測定的CXADRLl和AIPl之間的相互作用。圖7提供照片顯示出通過雙-雜合系統測定的CXADRL1和AIP1之間的相互作用。圖8顯示出通過CXADRL1-207刺激產生的CTL系的肽特異性細胞毒性。CTL系對被CXADRL1-207脈沖的靶細胞(T2)顯示出高細胞毒活性，而對未經肽脈沖的相同靶細胞(T2)未顯示出顯著的細胞毒活性。圖9顯示出CXADRLl-207CTL克隆對SNU475,MKN74和SNU-C4的細胞毒活性。CXADRL1-207CTL克隆對表達CXADRL1和HLA-A8150201的SNU475顯示出高細胞毒活性。另一方面，CXADRL1-207CTL克隆對表達CXADRL1但不表達HLA-A8150201的MKN74未顯示出顯著的細胞毒活性。另出顯著的細胞毒活性。圖IO顯示出未標記靶的抑制試驗結果。CXADRL1-207CTL克隆以HLA-A*0201限制性方式特異性識別CXADRLl-207。將用Na25icr04標記的SNU475制備成經標記靶，而將經CXADRL1-207肽-脈沖的T2(Peptide+)用作未標記耙(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽脈沖的T2可抑制對SNU475的細胞毒活性，而加入未經肽脈沖的T2幾乎無抑制作用。圖ll顯示出阻斷試驗的結果，該試驗顯示出針對HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8產生的抗體對CXADRLl-207CTL克隆的細胞毒活性的作用。CXADRL1-207CTL克隆以HLA-I類和CD8限制性方式顯示出細胞毒活性。為了檢測用CXADRL1肽產生的CTL克隆的特征，檢測了針對HLA-I類，HLA-n類，CD4和CD8的抗體抑制細胞毒活性的能力。水平軸表示細胞毒性抑制作用的百分比。當使用抗I類和CD8的抗體時，CTL克隆對SNU475靶的細胞毒性顯著降低。該結果表明CTL克隆以依賴于HLA-I類和CD8的方式識別書f生自CXADRL1的肽。圖12提供照片顯示出多種人組織中GCt/IX/的Northern印跡分析結果。GC77D/轉錄物的大小約為3.5-kb。圖13提供照片顯示出GCUD1的亞細胞定位，所述定位是通過免疫細胞化學在經pcDNA3.1myc/His-GCUDl轉染的細胞上觀察得到的。經cMyc-標記的GCUD1蛋白表達自定位于胞質中的質粒。圖14提供照片顯示出通過集落形成試驗檢查到的GCUD1對NIH3T3細胞的生長-促進作用。圖15顯示出被指定用于抑制GC77D7的反義S-寡核苷酸對MKN-28細胞的生長-抑制作用。經證實GCUDl-AS5和GCUDl-AS8能抑制MKN-28細胞的生長。圖16提供照片顯示出重組GCUD1蛋白的純化。圖17提供照片顯示出用抗-GCUDl抗血清或抗-Flag抗體對表達經Flag-標記的外源性GCUD1蛋白的細胞的免疫印跡分析結果。圖18A和18B顯示出通過GCUD1-196(A)或GCUD1-272(B)刺激產生的CTL系的肽特異性細胞毒性。CTL系對被GCUDl-196或GCUDl-272脈沖的靶細胞(T2)顯示出高細胞毒活性，而對未經肽脈沖的相同靶細胞(T2)未顯示出顯著的細胞毒活性。圖19顯示出GCUD1-196CTL克隆對SNU475和MKN45的細胞毒活性。GCUD1-196CTL克隆對表達GCUD1和HLA-A承0201的SNU475顯示出高細胞毒活性。另一方面，GCUD1-196CTL克隆對表達GCUDl但不表達HLA-A*0201的MKN45未顯示出顯著的細胞毒活性。圖20顯示出未標記耙的抑制試驗結果。GCUD1-196CTL克隆以HLA-A*0201限制性方式特異性識別GCUD1-196。將用Na251Cr04標記的SNU475制備成經標記靶，而將經GCUDl-196肽-脈沖的T2(Peptide+)用作未標記耙(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽^P中的T2可抑制對SNU475的細胞毒活性，而加入未經肽脈沖的T2幾乎無抑制作用。圖21顯示出阻斷試驗的結果，該試驗顯示出針對HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8產生的抗體對GCUD1-196CTL克隆的細月包毒活性的作用。GCUD1-196CTL克隆以HLA-I類和CD8限制性方式顯示出細胞毒活性。為了檢測用GCUD1肽產生的CTL克隆的特征，檢測了針對HLA-I類，HLA-II類,CD4和CD8的抗體抑制細胞毒活性的能力。水平軸表示細胞毒性抑制作用的百分比。當使用抗I類和CD8的抗體時，CTL克隆對SNU475靶的細胞毒性顯著降低。該結果表明CTL克隆以依賴于HLA-I類和CD8的方式識別衍生自GCUD1的肽。圖22a至22b顯示出FZJ20W5在結腸癌中的表達。圖22a顯示出通過cDNA微陣列檢測獲得的FZJ20"在ll個原發性結腸癌病例中的相對表達率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器(Cy3和Cy5信號都大于25,000)的ll個結腸癌病例中，IO個病例中的FL/2W"表達被上調(Cy3:Cy5強度比率》.0)。圖22b顯示出使用18個額外的結腸癌病例，經半-定量RT-PCR分析獲得的FZJ20375表達(T，肺瘤組織；N,正常組織)。將G^PD/f的表達用作內部對照。圖23a提供照片顯示出多個人胎組織中iWFW的月臺-組織Northem印跡分析結果。圖23b顯示出RNF43的推定蛋白質結構。圖24a和24b提供照片顯示出經myc-標記的RNF43蛋白的亞細胞定位。圖24a提供照片顯示出使用被pcDNA3.1myc/His-RNF43或對照質粒(模擬質粒)轉染的COS7細胞的提取物對經myc-標記的RNF43蛋白進行Western-印跡分析的結果。圖24b提供照片顯示出用小鼠抗-myc抗體染色并用與FITC偶聯的第二抗體觀察到的轉染細胞。細胞核用DAPI復染。圖25a至25c顯示出iA^W3對細胞生長的影響。圖25a提供照片顯示出NIH3T3細胞中iA^43的集落形成試驗結果。圖25b提供照片顯示出模擬細胞(COS7-pcDNA)和通過用pcDNA-RNF43轉染COS7細胞建立的COS7-RNF43細胞中的/MW3表達。圖25c顯示出穩定表達外源性iA^/3的COS7-RNF43細胞和模擬細胞之間細胞生長的比較結果。圖26a和26b顯示出被指定用于抑制iA^^的反義S-寡核苦酸的生長-抑制作用。圖26a提供照片顯示出通過半-定量RT-PCR分析獲得的、用對照(KNF43-Sl)或反義S-寡核香酸(RNF43-ASl)處理12小時的LoVo細胞中的RNF43表達。圖26b顯示出經MTT試驗測定的、用對照或反義S-寡核苷酸處理后的LoVo細胞的細胞生存力。同時進行三份MTT試驗。圖27A至27C顯示出RNF43-siRNA的生長抑制作用。圖27A提供照片顯示出RNF43-siRNA對RNF43表達的作用。圖27B提供照片顯示出用對照-siRNA或RNF43-siRNA處理后，存活細胞的Giemsa染色結果。圖27C顯示出用對照質粒或表達RNF43-siRNA的質粒轉染的細胞的MTT試驗結果。*表示經Fisher，sprotectedleast顯著性差異試驗測定的顯著性差異(p〈0.05)。圖28A和28B顯示出經標記RNF43蛋白的表達。圖28A提供照片顯示出經pFLAG-5CMV-RNF43(泳道2)或模擬載體(泳道l)轉染的COS7細胞的培養基中分泌的、經Flag-標記的RNF43蛋白的Western-印跡分析結果。圖28B才是供照片顯示出經pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(泳道2)或模擬載體(泳道l)轉染的COS7細胞的培養基中分泌的、經Myc-標記的RNF43蛋白的Western-印跡分析結果。圖29A和29B顯示出含有經Myc-標記或經Flag-標記的RNP43蛋白的條件培養基的生長促進作用。圖29A提供照片顯示出在對照培養基(1)或被模擬載體(2)、pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(3)或pFLAG-5CMV-RNF43(4)轉染的COS7細胞的條件培養基中培養的NIH3T3細胞的形態學。圖29B顯示出在圖29A所述培養基中培養的NIH3T3細胞的數目。所示^:據為每組三^f分實一瞼的平均值；線條表示土SE。*表示與對照，模擬載體相比較的顯著性差異(p<0.05)。圖30A至30C表示RNF43N-末端(N1)和C-末端(C1)重組蛋白質的制備。圖30A圖解表示重組蛋白質RNF43-N1和-Cl的結構。圖30B提供照片顯示出在用(泳道2)或不用(泳道1)0.2mMIPTGi秀導時，經NusTM-標記的RNF43-Nl蛋白在大腸桿菌中的表達。圖30C提供照片顯示出在用(泳道2)或不用(泳道1)0.2mMIPTG誘導時，經NusTM-標記的RNF43-Cl蛋白在大腸桿菌中的表達。圖31A和31B顯示出通過酵母雙-雜合系統4全測到的RNF43和NOTCH2之間的相互作用。圖31A顯示出推定的NOTCH2結構和相互作用區域。(a)顯示出推定的NOTCH2蛋白全長結構，(b)顯示出推定的負責相互作用的區域(ECD,胞外結構域；TM,跨膜結構域；ICD,胞內結構域)。圖31B提供照片顯示出通過雙-雜合系統檢測到的RNF43和NOTCH2之間的相互作用。圖32A和32B顯示出通過酵母雙-雜合系統檢測到的RNF43和STRIN之間的相互作用。圖32A顯示出推定的STRIN結構和相互作用區域。(a)顯示出推定的STRIN蛋白全長結構，(b)顯示出推定的負責相互作用的區域(RING,RING結構域)。圖32B提供照片顯示出通過雙-雜合系統檢測到的RNF43和STRIN之間的相互作用。圖33顯示出通過RNF43-721刺激產生的CTL系的肽特異性細胞毒性。CTL系對經RNF43-721脈沖的靶細胞(TISI)顯示出高細胞毒活性(四邊形)，而對未經肽脈沖的相同靶細胞(TISI)未顯示出顯著的細胞毒活性(三角形)。已證實CTL系具有肽特異性細胞毒性。圖34顯示出通過RNF43-721刺激產生的CTL克隆的肽特異性細胞毒性。按照"材料和方法"中所述檢測13個RNF43-721CTL克隆對經肽-脈沖的耙(TISI)的細胞毒活性。已建立的RNF43-721CTL克隆對經肽-脈沖的靶細胞(TISI)具有很強的細胞毒活性，而對未經任何肽月永沖的相同靶細胞(TISI)未顯示出任何顯著的細胞毒活性。圖35顯示出RNF43-721CTL克隆45對HT29,WiDR和HCT116的細胞毒活性。RNF43-721CTL克隆識別并裂解以HLA限制性方式內源性表達RNF43的腫瘤細胞。HT29，WiDR和HCT116皆內源性表達RNF43，將RNF43-721CTL克隆45用作效應細胞。將TISI用作不表達RNF43的靶。RNF43_721CTL克隆^對同時表達RNF"和HLA-AZ4的HTM(實心三角形)和WiDR(菱形)顯示出高細月包毒活性。另一方面，-RNF43-721CTL克隆45對表達RNF"但不表達HLA-AZ4的HCT11《空心三角形)和表達HLA-AM但不表達RNF43的TISI(空心四邊形)未顯示出顯著的細胞毒活性。另外，RNF43-721CTL克隆45對經不相關的肽脈沖的TISI(點狀實心四邊形)和表達RNF43但幾乎不表達HLA-A24的SNU-C4(實心圓)未顯示出細胞毒活性。圖36顯示出未標記靶的抑制試驗結果。RNF43-721CTL克隆以HLA-A24限制性方式特異性識別RNF43-721。將用Na2"Cr04標記的HT29制備成經標記靶，而將經RNF43-721肽-脈沖的TISI(Peptide+)用作未標記靶(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽脈沖的TISI可抑制對HT29的細胞毒活性(實心四邊形)，而加入未經肽脈沖的TISI幾乎無抑制作用(空心四邊形)。圖37顯示出阻斷試驗的結果，該試驗顯示出針對HLA-I類，HLA-II類,CD3，CD4和CD8產生的抗體對RNF43-721CTL克隆的細胞毒活性的作用。RNF43-721CTL克隆以HLA-I類、CD3和CD8限制性方式顯示出細胞毒活性。為了檢測用RNF43肽產生的CTL克隆的特征，檢測了針對HLA-I類，HLA-II類，CD3,CD4和CD8的抗體抑制細胞毒活性的能力。水平軸表示細胞毒性抑制作用的百分比。當使用抗I類、CD3和CD8的抗體時，CTL克隆對WiDR耙的細胞毒性顯著降低。該結果表明CTL克隆以依賴于HLA-I類、CD3和CD8的方式識別衍生自RNF43的肽。圖38A和38B顯示出用RNF43-1l-9(A)或RNF43-ll-10(B)產生的CTL系的肽特異性細胞毒性。這些CTL系對經RNF43-11-9或RNF43-11-10脈沖的靶細胞(T2)顯示出高細胞毒活性，而對未經肽脈沖的相同靶細胞(T2)未顯示出顯著的細胞毒活性。圖39A和39B顯示出通過RNF43-1l-9(A)或RNF43-ll-10(B)刺激產生的CTL克隆的肽特異性細胞毒性。按照"材料和方法"中所述檢測4個RNF43-ll-9CTL克隆或7個RNF43-11-10克隆對經肽-脈沖的靶(T2)的細胞毒活性。已建立的RNF43-11-9和RNF43-11-10CTL克隆對經肽-脈沖的靶細胞(T2)具有很強的細胞毒活性，而對未經任何肽脈沖的相同耙細胞(T2)未顯示出任何顯著的細胞毒活性。圖40A和40B顯示出RNF43-5CTL克隆卯和RNF43-17CTL克隆25對HT29和DLD-1的細胞毒活性。RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17CTL克隆25識別并裂解以HLA-限制性方式內源性表達RNF43的腫瘤細胞。HT29和DLD-1皆內源性表達RNF43，將RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17CTL克隆25用作效應細胞。將T2用作不表達RNF43的靶。RNF43-5CTL克隆卯和RNF43-17CTL克隆25對同時表達RNF43和HLA-A承0201的DLD-1顯示出高細胞毒活性。另一方面，RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17CTL克隆25對表達RNF43但不表達HLA-A^201的HT29未顯示出顯著的細胞毒活性。圖41顯示出未標記耙的抑制試-驗結果。RNF43-ll-9CTL克隆以HLA-A2限制性方式特異性識別RNF43-ll-9。將用Na2"C.rO4標記的HCTl16制備成經標記乾，而將經RNF43-1l-9肽-脈沖的T2(P印tide+)用作未標記靶(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽脈沖的T2可抑制對HCT116的細胞毒活性，而加入未經肽脈沖的TISI幾乎無抑制作用。發明詳述除非另有說明，本文所用術語"一個"、"一種"指的是"至少一個"和"至少一種"。本申請鑒定出新的人基因CA^DiU和CCC/D/，與相應的非癌組織相比，所述基因在胃癌中的表達顯著升高。CX4DM/cDNA由3423個核苷酸組成，其中含有如SEQIDNO:l所示的1296個核苷酸長的開放閱讀框。開放閱讀框編碼推定的431個-氨基酸長的蛋白質。CXADRL1與AIP1結合。AIPl(atripin-l-相互作用蛋白l)是與atropin-l結合的蛋白質，atropin-l是遺傳病齒狀核紅核-蒼白J求底丘月S核萎縮(dentatorubral-pallidoluysianatrophy)的致病基因。AIP1編碼推定的1455個氨基酸長的蛋白質，其中含有鳥苷酸激酶-樣結構域、2個WW結構域和5個PDZ結構域。已證實AIP1的小鼠同系物能與活化素型IIA相互作用。然而，AIP1的功能仍有待闡明。推測的氨基酸序列與CXADR(柯薩奇病毒和腺病毒受體)的同一性約為37。/。。因此，將該蛋白質命名為CXADRL1(柯薩奇病毒和腺病毒受體樣1)。另一方面，GC77D7cDNA由4987個核苦酸組成，其中含有如SEQIDNO:3所示的1245個核苷酸長的開放閱讀框。開放閱讀框編碼推定的414個-氨基酸長的蛋白質。由于該蛋白質的表達在胃癌中被上調，因此，將其命名為GCUD1(在胃癌中被上調)。此外，本發明包括新的人基因7A^0,與相應的非癌組織相比，所述基因在結腸癌中的表達顯著升高。iWFWcDNA由5345個核苦酸組成，其中含有如SEQID—NO:5所示的2352個核苦酸長的開放閱讀框。開》文閱讀框編碼推定的783個-氨基酸長的蛋白質。RNF43與NOTCH2和STRIN結合。據報道NOTCH2是大的跨膜受體蛋白，該蛋白質是進化上保守的細胞間信號傳導機制的組分。NOTCH2是Notch信號傳導途徑的蛋白質成員，據報道，它與腎臟中的腎小球發生以及心臟和眼血管系統的發育有關。另據報道，三種5/Serrate/Lag-2(DSL)蛋白，即51、Jaggaedl和Jaggaed2是NOTCH2的功能配體。STRIN編碼推定的與小鼠Trif共享79%同一性的蛋白質。STRIN或Trif的功能仍有待闡明。CX4DM/，GCf/i^47MW3在細胞內的外源性表達總能使細胞生長增強，而用反義S-寡核苷酸或小的干擾RNA(siRNA)抑制其表達會導致對癌細胞的顯著生長-抑制作用。這些發現表明CXADRLl,GCUD1和RNF43為癌細胞提供了致癌活性，抑制這些蛋白質的活性不失為一種治療癌癥的理想策略。本發明包括新的人基因CX4Z)M7，其包括SEQIDNO:l所述的多核苷酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼CXADRL1蛋白，所述蛋白質包括SEQIDNO:2所示氨基酸序列或其功能等同物。與CXADRL1蛋白功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人CXADRL1蛋白相對應的同源蛋白質以及人CXADRL1蛋白的突變體。本發明還包括新的人基因GCM^，其包括SEQIDNO:3所述的多核苷酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼GCUD1蛋白，所述蛋白質包括SEQIDNO:4所示氨基酸序列或其功能等同物。與GCUD1功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人GCUD1蛋白相對應的同源蛋白質以及人GCUD1蛋白的突變體。另外，本發.明包括新的人基因/M^3，其包括SEQIDNO:5所述的多核苦酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼RNF43蛋白，所述蛋白質包括SEQIDNO:6所示氨基酸序列或其功能等同物。與RNF43功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人RNF43蛋白相對應的同源蛋白質以及人RNF43蛋白的突變體。在本發明中，術語"功能等同"指的是所述多肽具有類似于CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白的促進細胞增殖的活性，并能賦予癌細胞以致癌活性。通過將編碼所述多肽的DNA導入表達各個多肽的細胞，并檢23測對細胞增殖的促進作用或集落形成活性的提高，即可判新所述多肽是否具有細胞增殖活性。所述細胞包括例如針對CXADRL1和GCUD1的NIH3T3細胞；針對RNF43的NIH3T3細胞，SW480細胞和COS7細胞。或者，可通過檢測其與AIP1的結合能力來判斷所述多肽是否與CXADRL1功能等同。另外，可通過^r測其與NOTCH2或STRIN的結合能力來判斷所述多肽是否與RNF43功能等同。與給定蛋白質功能等同的多肽的制備方法是本領域技術人員眾所周知的，并且包括在蛋白質中導入突變的已知方法。例如，本領域技術人員通過定點誘變(Hashimoto-Gotohetal"Gene152:271-275(1995);ZollerandSmith,MethodsEnzymol100:468-500(1983);Krameretal.,NucleicAcidsRes.12:9441-9456(1984);KramerandFritz,MethodsEnzymol154:350-367(1987);Kunkel,ProcNatlAcadSciUSA82:488-492(1985);Kunkel,MethodsEnzymol85:2763-2766(1988))在人CXADRLl，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列中導入適當的突變，即可制備出與所述的任一種蛋白質功能等同的多肽。氨基酸突變也可自然發生。本發明的多肽包括具有人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列的蛋白質，其中一個或多個氨基酸已經突變，條件是所得突變多肽與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的功能等同。所述突變體中突變氨基酸的數目一般為10個氨基酸或更少，優選為6個氨基酸或更少，更優選為3個氨基酸或更少。已知經突變或修飾的蛋白質能保留原始的生物活性，其中所述蛋白質具有因在某個氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個或多個氨基酸殘基而被修飾的氨基酸序列(Marketal.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-5666(1984);ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-6500(1982);Dalbadie畫McFarlandetal"ProcNatlAcadSciUSA79:6409-6413(1982))。優選將待突變的氨基酸殘基突變成不同的氨基酸，其中氨基酸側鏈的特性是保守的(已知為保守的氨基酸取代過程)。氨基酸側鏈特性的例子為:疏水氨基酸(A,I，L，M，F,P,W，Y,V),親水氨基酸(R,D,N,C,E，Q,G，H,K，S，T),以及具有下述官能團或共有特性的側鏈脂肪族側鏈(G,A,V,L，I,P);含羥基側鏈(S，T，Y);含硫原子側鏈(C,M);含羧酸和酰胺側鏈(D，N,E,Q);含堿基側鏈(R,K，H)和含芳香族側鏈(H，F,Y，W)。需說明的是括號中的字母表示氨基酸的單字母代碼。在人CXADRLI，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列中添加一個或多個氨基酸殘基所得多肽的例子是含有人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人CXADRL1，GCUD1或RKF43蛋白與其它肽或蛋白質的融合蛋白，本發明包括所述融合蛋白。通過本領域技術人員眾所周知的技術即可制備融合蛋白，例如將編碼本發明的人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白質的DNA連接，使得讀碼框匹配，將融合DNA插入表達載體并在宿主中表達所述融合DNA。對于與本發明的蛋白質融合的肽或蛋白質沒有限制。可用于與本發明的蛋白質融合的已知肽包括例如FLAG(Hoppetal.,Biotechnology6:1204-1210(1988))、含有6個His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7-標記、HSV-標記、E-標記、SV40T抗原片段、lck標記、a-微管蛋白片段、B-標記、C蛋白片段等。可與本發明的蛋白質融合的蛋白質包括例如GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區、(3-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結合蛋白)等。通過將編碼上述融合肽或蛋白質的商購DNA與編碼本發明多肽的DNA融合，并表達所制備的融合DNA即可制備出融合蛋白。另一種本領域已知的分離功能等同多肽的方法是例如使用雜交技術的方法(Sambrooketal.,MolecularCloning2nded.9.47-9.58,ColdSpringHarborLab.Press(1989))。本領域技術人員能容易地分離出與編碼人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的DNA序列(即SEQIDN0:l,.3或5)的全部或部分具有高度同源性的DNA,并且能從分離的DNA中分離出人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的功能等同多肽。本發明的多肽包括由能與編碼人CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白的DNA序列的全部或部分雜交的DNA編碼、并且與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括對應于人源蛋白質的哺乳動物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因編碼的多肽)。當從動物中分離與編碼人CXADRL1蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優選使用得自睪丸或卵巢的組織。或者，當從動物中分離與編碼人GCUD1蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優選使用得自睪丸、卵巢或腦的組織。另外，當從動物中分離與編碼人RNF43蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優選使用得自胎肺或胎腎的組織。本領域技術人員可以常規選擇分離DNA所用的雜交條件，所述DNA編碼與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽。例如，可通過于68Gc使用"Rapid-hyb緩沖液，，(AmershamLIFESCIENCE)進行預雜交達30分鐘或更長時間，加入經標記的探針并于68GC加熱1小時或更長時間來進行雜交。例如，可在低嚴緊條件下進行下述洗滌步驟。低嚴緊條件是例如42。C，2xSSC,0.1%SDS,或優選為5(^C，2XSSC，0.1%SDS。更優選使用高度嚴緊條件。高度嚴緊條件是例如室溫下用2xSSC,0.01。/。SDS洗滌3次，每次20分鐘，然后于37^C用lxSSC,0.1%SDS洗滌3次，每次20分鐘，再于5()Gc用lxSSC,0.1%SDS洗滌2次，每次20分鐘。然而，幾個諸如溫度和鹽濃度的因素可影響雜交的嚴緊度，本領域技術人員可適當選擇這些因素以獲得所需的嚴緊度。可以使用基因擴增法，例如聚合酶鏈反應(PCR)法替代雜交來分離DNA,所述DNA編碼與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽，所述方法使用基于編碼蛋白質的DNA序列信息(SEQIDNO:1,3或5)所合成的引物。由通過上述雜交技術或基因擴增技術分離的DNA編碼的、與人CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽一般與人CXADRLl,GCUD1或RKF43蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。"高度同源性"一般指的是同源性為40%或更高，優選為60%或更高，更優選為80°/。或更高，甚至更優選為95%或更高。根據"WilburandLipman,ProcNatlAcadSciUSA80:726-730(1983)，，中的算法即可測定多肽的同源性。本發明多肽的氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的存在或缺乏、或形式可以有所不同，這取決于用于產生所述多肽的細胞或宿主或所使用的純化方法。無論如何，只要其功能等同于本發明的人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白，就落入本發明的范圍。通過本領域技術人員眾所周知的方法可將本發明的多肽制備成重組蛋白質或天然蛋白質。通過下述方法即可制備重組蛋白質，即將編碼本發明多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5的DNA)插入適當的表達載體，將載體導入適當的宿主細胞，獲得提取物，通過對提取物進行層析來純化多肽，所述層析包括例如離子交換層析、反相層析、凝膠過濾、或利用固定有抗本發明蛋白質之抗體的層析柱的親和層析，或一種以上所述柱的組合d另外，當在宿主細胞(例如動物細胞和大腸桿菌)中將本發明的多肽表達成與谷胱甘肽-S-轉移酶的融合蛋白或添加有多個組氨酸的重組蛋白質時，可使用谷胱甘肽柱或鎳柱來純化所表達的重組蛋白質。或者，當將本發明的多肽表達成被c-myc,多個組氨酸或FLAG標記的蛋白質時，可分別使用抗c-myc，His或FLAG的抗體來檢測和純化所述蛋白質。純化融合蛋白之后，必要時也可以通過凝血酶或Xa因子切割來切除非目的多肽區域。通過本領域技術人員已知的方法，例如通過使結合有能與CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白結合的下述抗體的親和柱與表達本發明多肽的組織或細胞提取物接觸，即可分離出天然蛋白質。抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明還包括本發明多肽的部分肽。部分肽具有本發明多肽所特有的氨基酸序列，并由至少7個氨基酸，優選為8個或更多個氨基酸，更優選為9個或更多個氨基酸組成。部分肽可用于例如制備抗本發明多肽的抗體，篩選與本發明多肽結合的化合物，以及篩選本發明多肽的促進劑或抑制劑。通過基因工程，通過已知的肽合成法或通過用適當的肽酶消化本發明的多肽，即可產生本發明的部分肽。例如，可以4吏用固相合成或液相合成來進行肽合成。另外，本發明提供了編碼本發明多肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸可用于體內或體外產生如上所述的本發明多肽，或者可用于因編碼本發明蛋白質的基因中的基因異常所致疾病的基因治療。可以使用任何形式的本發明的多核苦酸，只要它能編碼本發明的多肽即可，其包括mRNA，RNA,cDNA，基因組DNA和化學合成的多核苷酸。本發明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列及其筒并序列的DNA，只要所得DNA能編碼本發明的多肽即可。通過本領域技術人員已知的方法即可制備本發明的多核苦酸。例如，可通過下述方法制備本發明的多核苦酸由表達本發明多肽的細胞制備cDNA文庫，并使用本發明DNA(如SEQIDNO:1,3或5)的部分序列作為探針進行雜交。例如，通過Sambrooketal.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中所述的方法即可制備cDNA文庫；或者也可以使用商購的cDNA文庫。也可通過下述方法制備cDNA文庫從表達本發明多肽的細胞中提取RNA,基于本發明DNA的序列(如SEQIDNO:1,3或5)合成寡DNA，使用寡DNA作為引物進行PCR,并擴增編碼本發明蛋白質的cDNA。另外，通過對所得cDNA的核苦酸進行測序，即可常規測定由cDNA編碼的翻譯區，并能容易地獲得本發明多肽的氨基酸序列。另外，通過使用所得cDNA或其部分作為探針篩選基因組DNA文庫，即可分離出基因組DNA。更具體地，可首先從表達本發明目的多肽的細胞、組織或器官中制備mRNA(CX4i^L/:睪丸或卵巢；GCt/Z)h睪丸、卵巢或腦；7WFW:胎肺或胎腎)。可使用已知方法分離mRNA;例如，通過胍超速離心(Chirgwinetal.,Biochemistry18:5294-5299(1979))或AGPC法(ChomczynskiandSacchi,AnalBiochem162:156-159(1987))即可制備總RNA。另外，可使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等從總RNA中純化mRNA,或者使用QuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。使用逆轉錄酶，用所得mRNA合成cDNA。可使用商購的試劑盒，如AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(SeikagakuKogyo)合成cDNA。或者，可以才艮據5，-RACE法(Frohmanetal.，ProcNatlAcadSciUSA85:8998-卯02(1988);Belyavskyetal.,NucleicAcidsRes17:2919-2932(1989))合成和擴增cDNA,所述方法使用本文所述的引物、5'-AmpliFINDERRACE試劑盒(Clontech)和聚合酶鏈反應(PCR)。由PCR產物制備所需DNA片段，并與載體DNA連接。使用重組載體轉化大腸桿菌等，由選定菌落制備所需重組載體。通過常規方法，如雙脫氧核苦酸鏈終止法證實所需DNA的核苷酸序列。考慮到用于表達的宿主中的密碼子使用頻率，將本發明多核苷酸的核苦酸序列設計成能夠更有效地表達(Granthametal.,NucleicAcidsRes9:43-74(1981))。可通過商購試劑盒或常規方法改變本發明多核苷酸的序列。例如，可通過用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或適當的多核苷酸片段、添加接頭或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA,TGA或TAG)來改變序列。28具體地說，本發明的多核苷酸包括含有核苷酸序歹'JSEQIDNO:1,3或5的DNA。另外，本發明提供了能在嚴緊條件下與具有核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5的多核苦酸雜交、并且編碼與上文所述的本發明CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。本領域技術人員可適當選擇嚴緊條件。例如，可使用低度嚴緊條件。更優選使用高度嚴緊條件。這些條件與上文所述的相同。上述雜交DNA優選為cDNA或染色體DNA。本發明還提供了載體，其中插入了本發明的多核苷酸。本發明的載體可用于在宿主細胞中維持本發明的多核苦酸，尤其是DNA,從而表達本發明的多肽，或者可用于施用本發明的多核苷酸以進行基因治療。當宿主細胞為大腸桿菌，并且在大腸4干菌(如JM109,DH5a,HB101或XLlBlue)中大量擴增和制備載體時，載體應具有欲在大腸桿菌中擴增的"ori"和用于選擇轉化的大腸桿菌的標記基因(例如用藥物進行選擇的藥物-抗性基因，如氨節青霉素、四環素、卡那霉素、氯霉素等)。例如，可使用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，也可使用pGEM-T、pDIRECT和pT7亞克隆和提取cDNA以及上述載體。當使用載體制備本發明的蛋白質時，表達載體特別有用。例如，欲在大腸桿菌中表達的表達載體應具有欲在大腸桿菌中擴增的上述特征。當將大腸桿菌，如JM109，DH5a，HB101或XLlBlue用作宿主細胞時，載體應具有能在大腸桿菌中有效表達所需基因的啟動子，例如lacZ啟動子(Wardetal"Nature341:544-546(1989);FASEBJ6:2422-2427(1992》、araB啟動子(Betteretal.,Science240:1041-1043(1988))或T7啟動子等。在此方面，可使用例如pGEX-5X-l(Pharmacia)、"QIAexpress系統，，(Qiagen)、pEGFP和pET(此時，宿主優選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體也可含有多肽分泌所用的信號序列。介導多肽分泌至大腸桿菌周質的信號序列的例子為peffi信號序列(Leietal"JBacteriol169:4379(1987))。將載體導入靶宿主細胞的方法包括例如氯化鈞法和電穿孔法。除了大腸桿菌外，也可使用下述載體制備本發明的多肽，即得自哺乳動物的表達載體(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(NucleicAcidsRes18(17):5322(1990))，pEF，pCDM8)，得自昆蟲細胞的表達載體(例如"Bac-to-29BAC軒狀病毒表達系統，，(GIBCOBRL),pBacPAK8),得自植物的表達載體(例如pMHl,pMH2),得自動物病毒的表達載體(例如pHSV,pMV,pAdexLcw)，得自逆轉錄病毒的表達載體(例如pZIpneo),得自酵母的表達載體(例如"畢赤氏酵母表達試劑盒，，(Invitrogen)，pNVll,SP-Q01)以及得自枯草芽孢桿菌的表達載體(如pPL608,pKTH50)。為了在動物細胞，如CHO,COS或NIH3T3細胞中表達載體，載體應具有在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulliganetal.,Nature277:108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EFloc啟動子(Mizushimaetal.,NucleicAcidsRes18:5322(1990))、CMV啟動子等，優選還具有選擇轉化子所用的標記基因(例如用藥物進行選擇的藥物抗性基因(如新霉素、G418))。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM,pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV,pOPRSV和pOP13。另外，可使用一些方法在穩定表達基因的同時在細胞內擴增基因的拷貝數。例如，可將含有互補DHFR基因的載體(如pCHOI)導入核酸合成途徑缺失的CHO細胞，然后通過氨甲蝶呤(MTX)進行擴增。另外，當瞬時表達基因時，可以使用這樣一種方法，其中含有SV40復制起點的載體(pcD等)被轉化至染色體上含有表達SV40T抗原的基因的COS細胞。按上述方法獲得的本發明多肽可分離自宿主細胞的內部或外部(如培養基)，并被純化成基本上純的均質多肽。本文所用的與給定多肽有關的術語"基本上純"指的是多肽基本上不含其它生物大分子。基本上純的多肽是指干重至少75%(如至少80,85,95或99%)純。通過任何適當的標準方法皆可測定純度，所述方法包括例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。分離和純化多肽的方法不局限于任何特定的方法；實際上，可使用任何標準方法。例如，可以適當選擇柱層析、過濾、超濾、鹽沉淀、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳、透析和重結晶，并將它們組合用于分離和純化多肽。層析的例子包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層牙斤、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.Ed.DanielR.Marshaketal"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996))。通過液相層析，如HPLC和FPLC即可進行這些層析。因此，本發明提供了通過上述方法制備的高度純化的多肽。通過在純化前或純化后用適當的蛋白質修飾酶處理本發明的多肽，即可對其進行任意修飾或部分缺失。有用的蛋白質修飾酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰內肽酶、蛋白激酶、葡糖苦酶等。本發明提供了與本發明的多肽結合的抗體。本發明的抗體可以任何形式被使用，如單克隆或多克隆抗體，并且包括通過用本發明的多肽免疫動物，如兔獲得的抗血清、所有類別的多克隆和單克隆抗體、人抗體和通過基因重組產生的人源化抗體。可用作抗原以獲得抗體的本發明多肽可得自任何動物，但優選得自哺乳動物，如人、小鼠或大鼠，更優選得自人。人源多肽可得自本文公開的核香酸或氨基酸序列。根據本發明，用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白質或蛋白質的部分肽。部分肽可含有例如本發明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。更具體地，包含密碼子235-276,493-537或70-lll的CXADRLl多肽可用作制備抗本發明CXADRL1的抗體所用的部分肽。或者，為了制備抗本發明多肽的抗體，可使用含有下述氨基酸序列中的任一個的肽。-RNF43;SEQIDNo:80,97或108-CXADRL1;SEQIDNo:124-GCUD1;SEQIDNo:164在本文中，抗體被定義為與本發明多肽的全長或片段反應的蛋白質。可將編碼本發明多肽或其片段的基因插入已知表達載體，然后按本文所述用所述載體轉化宿主細胞。通過任何標準方法從宿主細胞的外部或內部回收所需多肽或其片段，隨后將其用作抗原。或者，將表達多肽的完整細胞或其裂解物或化學合成的多肽用作抗原。可用抗原免疫任何哺乳動物，但優選考慮與細胞融合所用親代細胞的相容性。一般使用嚙齒類、兔形目(Lagomorpha)或靈長類動物。嚙齒類動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如兔。靈長類動物包括例^口Catarrhini浙吳(oldworld猴),長口食蟹猴(Afacaca/osc/cm/otz'力,恒河猴(rhesusmonkey),sacred狒狒和黑猩猩(chimpanzees)。用抗原免疫動物的方法是本領域已知的。腹膜內注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更具體地，可稀釋抗原，將其懸浮于適當量的磷酸緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中。必要時，可將抗原懸浮液與適當量的標準佐劑，如弗氏完全佐劑混合，制成乳劑，然后施用給哺乳動物。優選隨后按照4至21天的間隔多次施用與適當量的弗氏不完全佐劑混合的抗原。適當的載體也可用于免疫。按上文所述進行免疫之后，通過標準方法檢查血清中所需抗體量的增加。通過從經檢查后確定血清中所需抗體量有所增加的經免疫哺乳動物體內收集血液，并通過使用任何常規方法從血液中分離出血清，即可制備抗本發明多肽的多克隆抗體。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，可以從血清中分離含有多克隆抗體的組分。可以使用例如與本發明多肽偶聯的親和柱獲得僅識別本發明多肽的組分，并使用蛋白A或蛋白G柱進一步純化該組分，從而由所述組分制備免疫5求蛋白G或M。為了制備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動物體內收集免疫細胞，按上文所述^r查血清中水平有所增加的所需抗體，并進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優選得自脾臟。其它可與上迷免疫細胞融合的優選親代細胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更優選為具有用藥物選擇融合細胞時所需的獲得型特性的骨髓瘤細胞。可根據已知方法，例如Milstein等的方法(GalfreandMilstein,MethodsEnzymol73:3-46(1981))融合上述免疫細胞和骨髓瘤細胞。通過在標準的選擇培養基，如HAT培養基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養基)中培養即可選擇出通過細胞融合獲得的雜交瘤。一^:在HAT培養基中維持細胞培養物數天至數周，維持的時間應足以使除所需雜交瘤以外的所有其它細胞(非融合細胞)死亡。然后進行標準的有限稀釋以篩選和克隆能產生所需抗體的雜交瘤細胞。除了上文所述的用抗原免疫非人動物以制備雜交瘤的方法外，也可在體外用多肽、表達多肽的細胞或其裂解物免疫人淋巴細胞，例如被EB病毒感染的人淋巴細胞。然后，使經免疫的淋巴細胞與得自人的能夠無限分裂的骨髓瘤細胞，如U266融合，從而產生能生成所需人抗體的雜交瘤，所述抗體能結合所述多肽(未審公開的日本專利申請(JP-A)Sho63-17688)。隨后，將所得雜交瘤移植到小鼠腹腔中并抽取腹水。可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯有本發明多肽的親和柱來純化所獲得的單克隆抗體。本發明的抗體不僅可用于純化和檢測本發明的多肽，還可用作本發明多肽的候選激動劑和拮抗劑。另外，所述抗體還可用于與本發明多肽相關之疾病的抗體治療。當給人體施用所得抗體時(抗體治療)，優選人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。例如，可以用選自多肽、表達多肽的細胞或其裂解物的抗原免疫攜有人抗體基因的轉基因動物。然后從動物體內收集產生抗體的細胞并與骨髓瘤細胞融合，從而獲得雜交瘤，從中可制備出抗所述多肽的人抗體(參見WO92-03918,W093-2227,WO94-02602，W094-25585,W096-33735和W096國34096)。或者，可通過癌基因無限增殖化能產生抗體的免疫細胞，如經免疫的淋巴細胞，并將其用于制備單克隆抗體。也可使用基因工程技術重組制備如此獲得的單克隆抗體(參見例如BorrebaeckandLarrick,TherapeuticMonoclonalAntibodies,publishedintheUnitedKingdombyMacMillanPublishersLTD(1990))。例如，可從能產生抗體的免疫細胞，如雜交瘤或經免疫的淋巴細胞中克隆編碼抗體的DNA，將其插入適當載體，并導入宿主細胞以制備重組抗體。本發明還提供了按上文所述制備的重組抗體。另外，本發明的抗體可以是抗體片段或經修飾的抗體，只要它們能結合本發明的一種或多種多肽即可。例如，抗體片段可以是Fab,F(ab，)2,Fv或單鏈Fv(scFv),其中通過適當接頭連接得自H和L鏈的Fv片段(Hustonetal.:ProcNatlAcadSciUSA85:5879-5883(1988))。更具體地，通過用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體即可產生抗體片段。或者，可構建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在適當宿主細胞中表達(參見例如Coetal.，JImmunol152:2968-2976(1994);BetterandHorwitz，MethodsEnzymol178:476-496(1989);HuckthunandSkerra，MethodsEnzymol178:497-515(1989);Lamoyi，MethodsEnzymol.121:652-663(1986);Rousseauxetal"MethodsEnzymol121:663-669(1986);BirdandWalker,TrendsBiotechnol9:132-137(1991))。通過與多種分子，如聚乙二醇(PEG)偶聯即可修飾抗體。本發明提供了這種經修飾的抗體。通過對抗體進行化學修飾即可獲得經修飾的抗體。33這些修飾方法是本領域的常規技術。或者，本發明的抗體可以是得自非人抗體的可變區與得自人抗體的恒定區之間的嵌合抗體，或者是含有得自非人抗體的互補決定區(CDR)、得自人抗體的構架區(FR)和恒定區的人源化抗體。使用已知技術即可制備出所述抗體。可將按上文所述獲得的抗體純化至均質。例如，可根據用于普通蛋白質的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，通過適當選擇和組合使用柱層析，如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等可以分離抗體(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane，ColdSpringHarborLaboratory,1988)，〈旦并不局P艮于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作親和柱。可以使用的蛋白A柱的例子包括例如HyperD,POROS和SepharoseF.F.(Pharmacia)。除親和層析以外的層析例包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshaketal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996))。可通過液相層析，如HPLC和FPLC進行層析過程。例如，可以使用吸光度測定、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、酶免疫測定性。在ELISA中，將本發明的抗體固定在培養板上，將本發明的多肽上樣于板上，然后上樣含有所需抗體的樣品，如產生抗體的細胞的培養物上清液或純化的抗體樣品。然后上樣能識別第一抗體并#1酶，如石咸性磷酸酶標記的第二抗體，并保溫培養板。接著，在洗滌之后，在培養板中加入酶底物，如對硝基苯磷酸，測定吸光度以評價樣品的抗原結合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可用作多肽。可使用BIAcore(Pharmacia)評價本發明抗體的活性。上述方法通過將本發明的抗體暴露于假定含有本發明多肽的樣品，并^r測或測定抗體和多肽形成的免疫復合物，可以檢測或測定本發明的多肽。由于^r測或測定本發明多肽的方法可特異性^r測或測定多肽，因此，所述方法可用于多種使用所述多肽的實驗。本發明還提供了含有至少15個核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸能與編碼人CXADRLl,GCUD1或RNP43蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:1，3或5)或其互補鏈雜交。優選本發明的多核苦酸是能與編碼本發明多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。本文所用術語"特異性雜交"指的是在通常的雜交條件下，優選在嚴緊雜交條件下不與編碼其它蛋白質的DNA發生顯著交叉雜交。所述多核苷酸包括能與編碼本發明多肽的DNA或其互補鏈特異性雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如反義寡核香酸和核酶)。另外，所述多核苷酸可用于制備DNA芯片。本發明包括能與核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5內的任何位點雜交的反義寡核苷酸。優選所述反義寡核苷酸針對的是核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5中的至少15個連續核苦酸。甚至更優選上述反義寡核苷酸在上述至少15個連續核苷酸中含有起始密碼子。更具體地，所述反義寡核苷酸包括含有核苷酸序列SEQIDNO:23或25的反義寡核苷酸用于抑制CXADRL1表達；含有核苷酸序列SEQIDNO:27或29的反義寡核苷酸用于抑制GCUD1的表達；含有核苷酸序列SEQIDNO:31的反義寡核苷酸用于抑制RNF43的表達。反義寡核苷酸的衍生物或修飾產物可用作反義寡核苷酸。所述修飾產物的例子包括低級烷基磷酸酯修飾，如曱基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型修飾，硫代磷酸酯修飾和氨基磷酸酯修飾。本文所用術語"反義寡核苷酸，，不僅意味著其中與構成DNA或mRNA特定區域的核苦酸相對應的核苦酸能夠完全互補，還意味著其中可含有一個或多個核苷酸錯配，只要DNA或mRNA和反義寡核苷酸能與核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5特異性雜交即可。"至少15個連續核苷酸序列區域"中所包含的這種多核苷酸的同源性至少為70%或更高，優選為80%或更高，更優選為90%或更高，甚至更優選為95%或更高。可以使用本文提及的算法測定同源性。所述多核苷酸可用作探針以按照下文實施例所述分離或檢測編碼本發明的多肽，或用作擴增所用的引物。本發明的反義寡核苷酸衍生物通過下述機制對產生本發明多肽的細胞發揮作用，即與編碼多肽的DNA或mRNA結合，抑制其轉錄或翻譯，促進mRNA降解并抑制本發明多肽的表達，從而導致多肽功能受抑制。通過與對衍生物無活性的適當基質混合，可將本發明的反義寡核香酸衍生物制成外用制劑，如涂抹劑(liniment)或泥罨敷劑(poultice)。必要時，也可通過加入賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑、止痛劑等，將衍生物配制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠嚢、脂質體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。通過下述的一般方法即可制備所述制劑。通過直接施用于病痛部位或注射至血管以使其到達病痛部位，將反義寡核苦酸衍生物施用給患者。也可使用反義寡核苦酸-固定介質增加持久性和膜-通透性。所述介質如脂質體、聚-L-賴氨酸、脂質、膽固醇、脂質轉染試劑，或其衍生物。可根據患者的身體狀況適當調整本發明的反義寡核苷酸衍生物的劑量，并按所需的量使用所述劑量。例如，可以施用的劑量范圍為0.1至100mg/kg,優選為0.1至50mg/kg。本發明還包括小的干擾RNA(siRNA),其含有核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5的有義鏈核酸和反義鏈核酸組合。更具體地，抑制RNF43表達的siRNA包括其有義鏈含有核苷酸序列SEQIDNO:40,41,42或43的siRNA。或者，抑制CXADRLl表達的siRNA包括其有義鏈含有核苷酸序列SEQIDNO:62或63的siRNA。術語"siRNA"指的是能防止靼mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。可使用將siRNA導入細胞的標準技術，包括將DNA用作模板以轉錄RNA的技術。siRNA含有編碼人CXADRLl，GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:1，3或5)的有義核酸序列和反義核酸序列。構建siRNA使得單個轉錄物(雙鏈RNA)具有來自靶基因的有義和互補反義序列，如發夾結構。該方法被用于改變細胞中的基因表達，其中在所述細胞中，作為例如細胞惡性轉化的結果，CXADRL1,GCUD1或RNF43的表達被上調。siRNA與耙細胞中CXADRL1，GCUD1或RNF43轉錄物的結合導致細胞產生的蛋白質減少。寡核苷酸的長度至少為10個核苷酸，并且可以與天然轉錄物一樣長。優選寡核苦酸長度為19-25個核苷酸。最優選寡核苦酸長度少于75，50或25個核香酸。能抑制其在哺乳動物細胞中的表達的CXADRLl,GCUD1或RNF43siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQIDNO:112-114中的任一個的寡核苷酸。這些序列分別是下述siRNA序列的靶序列。SEQIDNO:112,SEQIDNO:40,41(RNF43);SEQIDNO:113,SEQIDNO:42,43(RNF43);和SEQIDNO:114,SEQIDNO:62,63(CXADRL1)。<吏用可4尋自Ambion網站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—fmder.html)的siRNA設計計算機程序設計siRNA的核香酸序列。基于下述方案通過計算機程序選擇siRNA合成所用的核普酸序列。選擇siRNA耙位點1.自目標轉錄物的AUG起始密碼子開始，掃描下游的AA二核苷酸序列。記錄每個AA和3'方向鄰接的19個核苷酸的出現，以作為潛在的siRNA草巴位點。TuscW等推薦針對5'和3'非翻譯區(UTR)和起始密碼子附近的區域(75個堿基以內)設計siRNA,因為所述區域中的調節蛋白結合位點較多。UTR-結合蛋白和/或翻譯起始復合物可干擾siRNA內切核酸酶復合物的結合。2.將潛在的靶位點與人基因組數據庫進行比較，無需考慮任何與其它編碼序列具有顯著同源性的靶序列。可使用能在NCBI服務器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中找到的BLAST進行同源性檢索。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion網站，優選沿著需評價之基因的長度選擇幾個靶序列。本發明的反義寡核苷酸或siRNA能抑制本發明多肽的表達，從而可用于抑制本發明多肽的生物活性。含有本發明的反義寡核苷酸或siRNA的表達-抑制劑也可用于抑制本發明多肽的生物活性。因此，含有本發明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細胞增殖性疾病，如癌癥。另外，本發明提供了使用本發明多肽的表達水平作為診斷標記以診斷細胞增殖性疾病的方法。該診斷方法包括步驟(a)檢測本發明的CX!D7ZJ，GCt/D/或iA^^基因的表達水平；和(b)將表達水平的升高與細胞增殖性疾病，如癌癥相關聯。通過定量與CX4Z)iI/，GCW^減iA^^基因相對應的mRNA或由所述基因編碼的蛋白質，即可估計特定樣品中CX4DiZJ,GCW^4tRM^3基因的表達水平。本領域技術人員已知定量mRNA的方法。例如，通過Northern印跡或RT-PCR即可估計出與CX4DW/,GCC/D7威i2A^V3基因相對應的mRNA的水平。由于CX1D^ZJ,GCt/D7威^A^^基因的全長核苷酸序列示于SEQIDNO:1，3或5,本領咸的任何技術人員都可設計探針或引物的核苷酸序列以定量CX4DiL/,GCt/D/成/iVFW基因。也可基于基因所編碼蛋白質的活性或量來分析CX4Z)虹人GCt/ZX^戈iA^W基因的表達水平。下文將描述測定CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白量的方法。例如，免疫測定法可用于測定生物材料中的蛋白質。任何生物材料都可用于測定蛋白質或其活性。例如，可分析血樣以估計由血清標記編碼的蛋白質。另一方面，可選擇適當方法，以根據每種待分析蛋白質的活性測定CX4i)/Z/，GCM)/4'iA^^基因所編碼蛋白質的活性。估計樣品(檢測樣品)中CX1D/ZJ，GCf/Z)L戎/A^^基因的表達水平，并與正常樣品中的表達水平相比較。當比較結果表明靶基因的表達水平高于正常樣品中的表達水平時，可以判斷受試者患有細胞增殖性疾病。可同時測定得自正常樣品和受試者的樣本中的CX4"^L/,(7C77D/4t^A^O基因的表達水平。或者，以分析先前從對照組收集的樣品中的基因表達水平所得的結果為基礎，通過統計學方法測定表達水平的正常范圍。通過將受試者的樣品與正常范圍相比較得出結果；當結果未落入正常范圍時，可判斷受試者患有細胞增殖性疾病。在本發明中，被診斷的細胞增殖性疾病優選為癌癥。更優選地，當估計出CX4Z)虹7或GCC/D/基因的表達水平并與正常樣品中的表達水平相比較時，診斷出的細胞增殖性疾病是胃癌、結直腸癌或肝癌；而當估計出i^FW基因的表達水平時，診斷出的疾病是結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。在本發明中，還提供了診斷細胞增殖性疾病所用的診斷試劑，所述疾病如癌癥，包括胃癌、結直腸癌、肺癌和肝癌。本發明的診斷試劑含有與本發明的多核苷酸或多肽結合的化合物。優選與本發明的多核苷酸雜交的寡核苦酸或與本發明多肽結合的抗體可用作所述化合物。另外，本發明還提供了使用本發明的多肽篩選治療細胞增殖性疾病的化合物的方法。所述篩選方法的實施方案包括步驟(a)使受試化合物與本發明的多肽接觸，(b)檢測本發明多肽與受試化合物之間的結合活性，和(c)選擇與本發明多肽結合的化合物。用于篩選的本發明多肽可以是重組多肽或得自天然的蛋白質，或其部分肽。可以使用任何受試化合物，例如細胞提取物、細胞培養物上清液、發酵微生物的產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。與受試化合物接觸的本發明多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質、與載體結合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。至于使用本發明的多肽篩選蛋白質，例如與本發明多肽結合的蛋白質的方法，可以使用多種本領域技術人員眾所周知的方法。通過例如免疫沉淀法，特別是按照下述方式即可進行所述篩選。通過將基因插入外源基因的表達載體，如pSV2neo，pcDNAI和pCD8，在動物細胞等中表達編碼本發明多肽的基因。用于表達的啟動子可以是任何常用的啟動子，包括例如SV40早期啟動子(RigbyinWilliamson(ed.),GeneticEngineering,vol.3.AcademicPress,London,83-141(1982))、EF-la啟動子(Kimetal.，Gene91:217-223(1990》、CAG啟動子(Niwaetal.，Gene108:193-200(1991))、RSVLTR啟動子(Cullen，MethodsinEnzymology152:684-704(1987))、SRa啟動子(Takebeetal.，MolCellBiol8:466(1988))、CMV即早期啟動子(SeedandAmffo,ProcNatlAcadSciUSA84:3365-3369(1987))、SV40晚期啟動子(GheysenandFiers,JMolApplGenet1:385-394(1982))、腺病毒晚期啟動子(Kaufmanetal.,MolCellBiol9:946(1989))、HSVTK啟動子等。可根據任何方法將基因導入動物細胞以表達外源基因，所述方法如電穿孔法(Chuetal.,NucleicAcidsRes15:1311-1326(1987))、磷酸鈣法(ChenandOkayama，MolCellBiol7:2745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopataetal.，NucleicAcidsRes12:5707-5717(1984);SussmanandMilman，MolCellBiol4:GAS-WAS(1985))、脂質轉染法(Derijard,BCell7:1025-1037(1994);Lambetal.,NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindranetal.，Science259:230-234(1993))等。通過在本發明多肽的N-或C-末端導入特異性已被揭示的單克隆抗體表位，可將本發明的多肽表達成含有單克隆抗體識別位點(表位)的融合蛋白。可以使用商購的表位-抗體系統(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。利用其多克隆位點表達與例如p-半乳糖苦酶、麥芽糖-結合蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶、綠色焚光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體可以商購。本文還報道了通過僅導入由幾個至十幾個氨基酸組成的小表位而制備的融合蛋白，以致于融合不會改變本發明多肽的特性。諸如聚組氨酸(His-標記)、流感病毒聚集體HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標記)、人單純皰滲病毒糖蛋白(HSV-標記)、E-標記(單克隆噬菌體上的表位)等的表位和識別它們的單克隆抗體可用作表位-抗體系統，用于篩選與本發明多肽結合的蛋白質(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，通過在使用適當去污劑制備的細胞裂解物中加入這些抗體以形成免疫復合物。免疫復合物由本發明的多肽、能與所述多肽結合的多肽和抗體組成。除了使用抗上述表位的抗體外，還可使用可按上文所述制備的抗本發明多肽的抗體進^f亍免疫沉淀。當抗體是小鼠IgG抗體時，可通過例如蛋白ASepharose凝膠或蛋白GSepharose凝膠沉淀免疫復合物。如果本發明的多肽被制備成與表位，如GST的融合蛋白，可按照與使用抗本發明多肽的抗體相同的方式，使用與這些表位特異性結合的物質，如谷胱甘肽-Sepharose4B形成免疫復合物。可根據或按照例如文獻中所述的方法(HarlowandLane,Antibodies,511-552，ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))進4亍免疫沉淀。SDS-PAGE常用于分析被免疫沉淀的蛋白質，使用具有適當濃度的凝膠，通過蛋白質的分子量可分析結合的蛋白質。由于通過普通的染色法，如考馬斯染色或銀染難以檢測與本發明多肽結合的蛋白質，通過在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或35s-半胱氨酸的培養基中培養細胞，標記細胞中的蛋白質并檢測蛋白質即可改善蛋白質的檢測敏感性。當已揭示出蛋白質的分子量時，可直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中純化靶蛋白質并測定其序列。至于使用本發明多肽篩選與所述多肽結合的蛋白質的方法，可以使用例如West-Western印跡分析(Skolniketal.,Cell65:83-卯(1991))。具體地說，可通過下述步驟獲得與本發明多肽結合的蛋白質使用噬菌體載體(如ZAP),由有望表達與本發明多肽結合的蛋白質的細胞、組織、器官(例如，篩選與CXADRL1結合的蛋白質時，所述組織如睪丸和卵巢；篩選與GCUD1結合的蛋白質時，所述組織為睪丸、卵巢和腦；篩選與RNF43結合的蛋白質時，所述組織為胎肺和胎腎)或經培養細胞制備cDNA文庫，在LB-瓊脂糖上表達蛋白質，將表達的蛋白質固定于濾膜上，使經純化和標記的本發明多肽與上述濾膜反應，以及根據標記檢測表達與本發明多肽結合的蛋白質的噬斑。利用生物素和親和素之間的結合，或利用與本發明多肽特異性結合的抗體，或與本發明多肽融合的肽或多肽(如GST),可以標記本發明的多肽。也可利用使用放射性同位素或熒光等的方法。或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可4吏用利用細胞的雙-雜合系統("MATCHMAKER雙-雜合系統，，，"哺乳動物MATCHMAKER雙-雜合試驗試劑盒"，"MATCHMAKER單-雜合系統，，(Clontech);"HybriZAP雙-雜合載體系統"(Stratagene);參見文獻"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)"，"FieldsandSternglanz,TrendsGenet10:286-292(1994)，,)。在雙-雜合系統中，本發明的多肽與SRF-結合區或GAL4-結合區融合并在酵母細胞中表達。cDNA文庫制備自有望表達與本發明多肽結合的蛋白質的細胞，使得所述文庫表達時能與VP16或GAL4轉錄激活區融合。然后將cDNA文庫導入上述酵母細胞，從檢測到的陽性克隆中分離得自文庫的cDNA(當在酵母細胞中表達與本發明多肽結合的蛋白質時，兩者的結合激活了報道基因，使得陽性克隆能被檢測到)。通過將上文分離到的cDNA導入大腸桿菌并表達蛋白質即可制備由cDNA編碼的蛋白質。至于報道基因，除了HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可使用親和層析篩選與本發明多肽結合的化合物。例如，可將本發明的多肽固定在親和柱的載體上，將含有能與本發明多肽結合的蛋白質的受試化合物上樣于親和柱。本文中的受試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。上樣受試化合物之后，洗滌柱，即可制備與本發明多肽結合的化合物。當受試化合物是蛋白質時，分析所得蛋白質的氨基酸序列，基于所述序列合成寡DNA,使用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫以獲得編碼蛋白質的DNA。在本發明中，使用表面胞質基因組共振現象的生物傳感器可用作檢測或定量結合化合物的儀器。當使用所述生物傳感器時，僅使用極少量的多肽并且無需標記，即可實時觀察到表現為表面胞質基因組共振信號的本發明多肽和受試化合物之間的相互作用(例如BIAcore,Pharmacia)。因此，可以使用生物傳感器，如BIAcore評價本發明多肽和受試化合物之間的結合。當固定化的本發明多肽暴露于合成化合物，或天然物質庫，或隨機噬菌體肽展示文庫時篩選結合分子的方法，以及基于組合化學技術(Wrightonetal.,Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan,Nature384:17-9(1996))進行高通量篩選從而不僅分離出蛋白質，還分離出與本發明蛋白質結合的化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法是本領域技術人員眾所周知的。或者，本發明的篩選方法可包括下述步驟a)使候選化合物與已導入載體的細胞接觸，所述載體含有一個或多個標記基因的轉錄調節區和在轉錄調節區控制之下表達的^艮道基因，其中一個或多個標記基因選自CXADRL1,GCUD1和RNF43,b)測定所述報道基因的活性；和c)選擇與對照相比能降低所述報道基因的表達水平的化合物。適當的報道基因和宿主細胞是本領域眾所周知的。通過使用標記基因的轉錄調節區可以制備篩選所需的報道構建體。當標記基因的轉錄調節區已為本領域技術人員所知時，使用先前已知的序列信息即可制備報道構建體。當仍未鑒定出標記基因的轉錄調節區時，可基于標記基因的核苷酸序列信息，從基因組文庫中分離出含有轉錄調節區的核苦酸區段。通過篩選分離出的化合物是能促進或抑制本發明多肽活性的候選藥物，可用于治療或預防例如細胞增殖性疾病所導致的疾病，如癌癥。通過本發明的篩選方法獲得的化合物包括這樣一種化合物，其中通過本發明的篩選方法獲得的、具有與本發明多肽結合之活性的化合物的部分結構通過添加、缺失和/或取代被改變。在另一個實施方案中，本發明提供了篩選候選藥劑的方法，所述藥劑是治療細胞增殖性疾病的潛在靶。如上文所詳細討論的，通過控制CXADRL1,GCUD1或RNF43的表達水平，就可以控制胃癌，或結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌的發生和發展。因此，通過利用CXADRL1，GCUD1或RNF43的表達水平和活性作為指標進行篩選，即可鑒定出身為治療細胞增殖性疾病的潛在靶的候選藥劑。在本發明的上下文中，所述篩選包括例如下述步驟a)使候選化合物與表達CXADRLl，GCUD1或RNF43的細胞接觸；和b)選擇與缺乏所述化合物時檢測到的表達水平相比，能降低CXADRL1GCUD1或RNF43表達水平的化合物。42表達CXADRL1，GCUD1或RNF43中的至少一種的細胞包括例如由胃癌、結直腸癌、肺癌或肝癌建立的細胞系；所述細胞可用于本發明的上述篩選。通過本領域技術人員眾所周知的方法即可估計出表達水平。在篩選方法中，可將能降低CXADRL1，GCUD1或RNF43中的至少一種的表達水平的化合物選擇為候選藥劑。在本發明的另一個篩選治療細胞增殖性疾病所用化合物的方法的實施方案中，所述方法利用本發明多肽的生物活性作為指標。由于本發明的CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白具有促進細胞增殖的活性，使用此活性作為指標可以篩選出能促進或抑制本發明蛋白質之一的此活性的化合物。該篩選方法包括步驟(a)使受試化合物與本發明的多肽接觸；(b)4全測步驟(a)中多肽的生物活性；和(c)選擇與缺乏受試化合物時檢測到的生物活性相比，能抑制多肽生物活性的化合物。任何多肽都可用于篩選，只要它們具有CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的生物活性即可。所述生物活性包括人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的細胞-增殖活性，RNF43與NOTCH2或STRIN結合的活性。例如，可使用人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白，也可使用與這些蛋白質功能等同的多肽。所述多肽可由細胞內源或外源性地表達。可以使用任何受試化合物，例如細胞提取物、細胞培養物上清液、發酵微生物的產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物或天然化合物。通過所述篩選分離出的化合物是本發明多肽的候選激動劑或拮抗劑。術語"激動劑"指的是通過與本發明多肽結合而激活所述多肽功能的分子。類似地，術語"拮抗劑"指的是通過與本發明多肽結合而抑制所述多肽功能的分子。另外，通過所述篩選分離出的化合物是能抑制本發明多肽與分子(包括DNA和蛋白質)的體內相互作用的候選化合物。當本發明方法欲檢測的生物活性是細胞增殖時，通過例如制備能表達本發明多肽的細胞，在受試化合物的存在下培養細胞，并按實施例中所述測定細胞增殖的速度，測定細胞周期，以及測定集落形成活性即可檢測到所述活性。通過上述篩選分離出的化合物是能抑制本發明多肽之活性的候選藥物，并可用于治療與本發明多肽相關的疾病，如包括癌癥的細胞增殖性疾病。更具體地，當將CXADRLi或GCUDl蛋白的生物活性用作指標時，通過本發明的方法篩選的化合物用作治療胃癌、結直腸癌或肝癌的候選藥物。另一方面，當將RNF43蛋白的生物活性用作指標時，通過本發明的方法篩選的化合物還可用作治療結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌的候選藥物。另外，通過本發明的篩選方法可以獲得的化合物還包括這樣一種化合物，其中能抑制CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白之活性的化合物的部分結構通過添加、缺失和/或取代被改變。在本發明的另一個篩選治療細胞增殖性疾病所用化合物的方法的實施方案中，所述方法利用RNF43與NOTCH2或STRIN的結合能力。已證實本發明的RNF43蛋白能與NOTCH2和STRIN結合。這些發現表明本發明的RNF43蛋白通過與諸如NOTCH2和STRIN的分子結合而發揮細胞增殖功能-。因此，抑制RNF43蛋白與NOTCH2或STRIN之間的結合有望導致細胞增殖受抑制，能抑制結合的化合物可用作治療細胞增殖性疾病，如癌癥的直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。該篩選方法包括步驟(a)在受試化合物的存在下使本發明的多肽與NOTCH2或STRIN接觸；(b)檢測多肽與NOTCH2或STRIN之間的結合；和(c)選擇能抑制多肽與NOTCH2或STRIN之間的結合的化合物。用于篩選的本發明的RNF43多肽以及NOTCH2或STRIN可以是重組多肽或天然來源的蛋白質，或者也可以是它們的部分肽，只要能保留彼此之間的結合能力即可。用于篩選的RNF43多肽、NOTCH2或STRIN可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質、與載體結合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。可以使用任何受試化合物，例如細胞提取物、細胞培養物上清液、發酵微生物的產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。至于篩選能抑制RNF43蛋白與NOTCH2或STRIN結合的化合物的方法，可使用多種本領域技術人員眾所周知的方法。可在體外檢測系統，如細胞系統中進行篩選。更具體地，首先使RNF43多肽，或者NOTCH2或STRIN與.支持物結合，再在支持物上添加另一種蛋白質以及受試樣品。接著保溫混合物，洗滌，檢測和/或測定與支持物結合的另一種蛋白質。同樣，通過本發明可分離出能干擾CXADRL1和AIP1結合的化合物。抑制CXADRL1和AIP1之間的結合有望能抑制細胞增殖，而能抑制結合的化合物可用作治療細胞增殖性疾病，如癌癥的藥物。可用于結合蛋白質的支持物包括例如不溶性的多糖，如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；和合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；優選使用由上述材料制備的可商購的珠和板(如多孔板，生物傳感器芯片等)。當使用珠時，可將其填充于柱中。可根據常規方法，如化學鍵合和物理吸附使蛋白質與支持物結合。或者，可經由特異性識別蛋白質的抗體使蛋白質與支持物結合。另外，也可以利用親和素和生物素結合使蛋白質與支持物結合。在例如，但不限于磷酸緩沖液和Tris緩沖液的緩沖液中進行蛋白質之間的結合，只要緩沖液不會抑制蛋白質之間的結合即可。在本發明中，使用表面胞質基因組共振現象的生物傳感器可用作檢測或定量結合蛋白質的儀器。當使用所述生物傳感器時，僅使用極少量的多肽并且無需標記，即可實時觀察到表現為表面胞質基因組共振信號的蛋白質之間的相互作用(例如BIAcore,Pharmacia)。因此，可以4吏用生物傳感器，如BIAcore評價RNF43多肽與NOTCH2或ST腿之間的結合。或者，可標記RNTF43多肽，或NOTCH2或STRIN,結合蛋白質的標記可用于檢測或測定結合蛋白質。具體地，預標記一種蛋白質之后，在受試化合物的存在下使標記的蛋白質與另一種蛋白質接觸，洗滌后根據標記檢測或測定結合蛋白質。在本發明的方法中，可使用標記物質，如放射性同位素(如3fi，14C,32p，33p，35s,125j，13、、酶(如械性磷酸酶、辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶)、熒光物質(如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/親和素標記蛋白質。當用放射性同位素標記蛋白質時，可通過液體閃爍進行4全測或測定。或者，通過加入酶底物，用吸光計;險測底物的酶促變化，如顏色的產生，即可檢測或測定用酶標記的蛋白質。另外，當將熒光物質用作標記時，可使用熒光光度計檢測或測定結合蛋白質。RNF43多肽與NOTCH2或STRIN的結合。例如，使固定于支持物上的RNF43多肽與受試化合物和NOTCH2或STRIN接觸之后，保溫混合物并洗滌，使用抗NOTCH2或STRIN的抗體進行檢測或測定。或者，將NOTCH2或STRIN固定于支持物上，將抗RNF43的抗體用作抗體。當在本發明的篩選方法中使用抗體時，優選用上述的一種標記物質標記抗體，并基于標記物質檢測或測定抗體。或者，將抗RNF43多肽、NOTCH2或STRIN的抗體用作第一抗體，用經標記物質標記的第二抗體可以檢測出所述第一抗體。另外，使用蛋白G或蛋白A柱可以4企測或測定在本發明的篩選方法中與蛋白質結合的抗體。或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可使用利用細胞的雙-雜合系統("MATC畫AKER雙-雜合系統"，"哺乳動物MATCHMAKER雙陽雜合試驗試劑盒"，"MATCHMAKER單-雜合系統，，(Clontedi);"HybriZAP雙-雜合載體系統，，(Stratagene);參見文獻"DaltonandTreisman，Cell68:597-612(1992)，，，"FieldsandStemglanz,TrendsGenet10:286-292(1994)")。在雙-雜合系統中，本發明的RNF43多肽與SRF-結合區或GAL4-結合區融合并在酵母細胞中表達。與本發明的RNF43多肽結合的NOTCH2或STRIN與VP16或GAL4轉錄激活區融合，并能在受試化合物的存在下在酵母細胞中表達。當受試化合物不能抑制RNF43多肽與NOTCH2或STRIN之間的結合時，兩者的結合會激活報道基因，使得陽性克隆能被;險測到。至于報道基因，除了HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。通過篩選分離出的化合物是能抑制本發明RNF43蛋白之活性的候選藥物，并可用于治療與RNF43蛋白相關的疾病，例如細胞增殖性疾病，如癌癥，更具體地為結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。另外，通過本發明的篩選方法可以獲得的化合物還包括這樣一種化合物，其中能抑制RNF43蛋白與代被改變。當將通過本發明的方法分離出的化合物作為藥物施用于人和其它哺乳動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒、黑猩猩以治療細胞增殖性疾病(如癌癥)時，可直接施用分離的化合物，或使用已知的藥物制備方法將其配制成劑量形式。例如，根據需要，可以糖衣片劑、膠嚢、酏劑和微嚢劑型口服藥物，或者以溶于水或任何其它藥物可接受液體的無菌溶液或懸浮液注射劑形式非口服給藥。例如，可以常規藥物實踐所需的單位劑量形式將化合物與藥學可接受載體或介質混合，所述載體或介質具體地為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、增味劑、賦形劑、載體、防腐劑、結合劑等。這些制品中活性成分的量能提供所示范圍內的適當劑量。可與片劑和膠嚢混合的添加劑的例子有如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠的結合劑；如晶體纖維素的賦形劑；如玉米淀粉、明膠和藻酸的膨脹劑；如硬脂酸鎂的潤滑劑；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味劑；如胡椒薄荷、Gaultheriaadenothrix油和櫻桃的增味劑。當單位劑量形式是膠嚢時，上述成分中還可包括液體載體，如油。可使用注射用載體，如蒸餾水，根據常規藥物實踐配制注射用的無菌混合物。'生理鹽水、葡萄糖和其它包括助劑的等滲液體，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉可用作注射用的水溶液。它們可與適當的增溶劑，如醇，特別是乙醇；聚醇，如丙二醇和聚乙二醇；非離子型表面活性劑，如Polysorbate80(TM)和HCO-50—起使用。芝麻油或豆油可用作油質液體，并可與苯曱酸千酯或千醇一起用作增溶劑，并可與如磷酸緩沖液和醋酸鈉緩沖液的緩沖液；如鹽酸普魯卡因的止痛劑；如千醇、酚的穩定劑；和抗氧化劑一起配制。可將制備好的注射液注入適當的安吾瓦中。可使用本領域技術人員眾所周知的方法給患者施用本發明的藥物組合物，例如以動脈內、靜脈內、經皮注射給藥和鼻內、經支氣管、肌內或口服給藥。給藥劑量和方法隨患者體重和年齡的變化而改變；然而，本領域技術人員可常規選擇給藥劑量和方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可將DNA插入基因治療載體，施用所述載體以進行治療。給藥劑量和方法隨患者體重、年齡和癥狀的變化而改變；但本領域技術人員可適當選擇給藥劑量和方法。例如，當給正常成人(體重為60kg)口服給藥時，盡管根據癥狀的不同有一些差異，但與本發明多肽結合并調節其活性的化合物劑量約為0.lmg至100mg/天，優選約為1.0mg至50mg/天，更優選約為1.0mg至20mg/天。當以注射液形式給正常成人(體重為60kg)非腸道給藥時，盡管根據患者、靶器官、癥狀和給藥方法的不同有一些差異，但合適的靜脈內注射劑量約為0.01mg至30mg/天，優選約為0.1至20mg/天，更優選約為0.1至10mg/天。當給其它動物給藥時，可以施用被轉換成60kg體重的量。另外，本發明提供了使用抗本發明多肽的抗體治療或預防細胞增殖性疾病，如癌癥的方法。根據此方法，需施用藥物有效量的抗本發明多肽的抗體。由于CXADRLl,GCUD1和RNF43蛋白的表達在癌細胞中被上調，因此抑制這些蛋白質的表達可導致細胞增殖活性降低，通過抗體與這些蛋白質的結合有望治療或預防細胞增殖性疾病。因此，以足以降低本發明蛋白質活性的劑量施用抗本發明多肽的抗體，所述劑量范圍是0.1至約250mg/kg/天。成人的劑量范圍一般約為5mg至17.5g/天，優選約為5mg至10g/天，最優選約為100mg至3g/天。或者，將與特異于腫瘤細胞的細胞表面標記結合的抗體用作藥物傳遞的工具。例如，以足以損傷腫瘤細胞的劑量施用與細胞毒性劑偶聯的抗體。本發明還涉及誘導抗-腫瘤免疫力的方法，所述方法包括施用CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白或其免疫活性片段，或編碼蛋白質或其片段的多核苦酸的步驟。CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白或其免疫活性片段可用作抗細胞增殖性疾病的疫苗。在某些情況下，蛋白質或其片段可以與T細胞受體(TCR)結合的形式，或者以被抗原呈遞細胞(APC)，如巨噬細胞、樹狀細胞(DC)或B-細胞呈遞的形式被施用。由于DC具有強的抗原呈遞能力，因此在APC中最優選使用DC。在本發明中，抗細胞增殖性疾病的疫苗指的是當接種于動物時，具有誘導抗-腫瘤免疫力功能的物質。根據本發明，含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97或108的多肽是HLA-A24或HLA-A承0201限制性的表位肽，它們能誘導針對表達RNF43的結直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌細胞的強有力的特異性免疫應答。根據本發明，含有氨基酸序列SEQIDNO:124的多肽是HLA-八*0201限制性的表位肽，它們能誘導針對表達CXADRL1的結腸癌、胃癌或肝癌細胞的強有力的特異性免疫應答。根據本發明，含有氨基酸序列SEQIDNO:164的多肽是HLA-A^201限制性的表位肽，它們能誘導針對表達GCUD1的結腸癌、胃癌或肝癌細胞的強有力的特異性免疫應答。因此，本發明還包括使用含有氨基酸序列SEQIDNO:80，97,108,124或164的多肽誘導抗-腫瘤免疫力的方法。一般說來，抗-腫瘤免疫力包括如下所述的免疫應答-誘導抗腫瘤的-細胞毒淋巴細胞，-誘導識別腫瘤的抗體，和-誘導產生抗-肺瘤的細胞因子。因此，當將某種蛋白質接種于動物可誘導任一種免疫應答時，就可以說該蛋白質具有誘導抗-腫瘤免疫力的作用。通過觀察宿主免疫系統在體內或體外針對蛋白質的反應，即可檢測出蛋白質誘導的抗-肺瘤免疫力。例如，檢測細胞毒T淋巴細胞誘導的方法是眾所周知的。進入活體的外源物質通過抗原呈遞細胞(APC)的作用被呈遞至T細胞和B細胞。以抗原特異性方式對APC呈遞的抗原作出反應的T細胞因受抗原的刺激而分化成細胞毒T細胞(或細胞毒T淋巴細胞；CTL),然后進行增殖(也稱作T細胞激活)。因此，通過用APC將某種肽呈遞至T細胞，并檢測CTL的誘導即可評價肽導致的CTL誘導。另外，APC具有激活CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和NK細胞的作用。由于CD4十T細胞和CD8十T細胞對抗-腫瘤免疫力也很重要，因此，使用這些細胞的激活作用作為標志，即可評價肽的抗-腫瘤免疫力誘導作用。知的。DC是APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC。在此方法中，起初使受試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細胞接觸。與DC接觸后檢測到具有針對感興趣細胞的細胞毒作用的T細胞，這表明受試多肽具有誘導細胞毒T細胞的活性。例如，使用"Cr-標記的肺瘤細胞的裂解作為標志，可以檢測抗腫瘤的CTL活性。或者，使用3H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作為標志評價肺瘤細胞損害程度的方法也是眾所周知的。除了DC外，也可將外周血單核細胞(PBMC)用作APC。在這種情況下，據報道，在GM-CSF和IL-4的存在下培養PBMC可以增強CTL誘導。類似地，已證實在匙孔戚血藍蛋白(KLH)和IL-7的存在下培養PBMC可以誘導CTL。經這些方法證實具有CTL誘導活性的受試多肽是具有DC激活作用繼而具有CTL誘導活性的多肽。因此，能誘導針對胂瘤細胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤疫苗。另外，通過與多肽接觸獲得誘導抗腫瘤CTL的能力的APC可用作抗腫瘤疫苗。另外，因APC呈遞多肽抗原而獲得細胞毒性的CTL也可用作抗腫瘤疫苗。使用APC和CTL所導致的抗-腫瘤免疫力的腫瘤治療方法被稱為細胞免疫治療。通常，當使用多肽進行細胞免疫治療時，已知混合多種具有不同結構的多肽并將它們與DC接觸可以增加CTL-誘導的效率。因此，當用蛋白質片段刺激DC時，使用多種類型的片段較為有利。或者，通過觀察對抗腫瘤抗體產生的誘導可以進一步證實多肽對抗-腫瘤免疫力的誘導。例如，當在用多肽免疫的實驗室動物中誘導出抗多肽的抗體時，以及在腫瘤細胞的生長受所述抗體抑制時，可測定出多肽具有誘導抗-腫瘤免疫力的能力。通過施用本發明的疫苗可誘導抗-腫瘤免疫力，所述抗-腫瘤免疫力的誘導可治療和預防細胞增殖性疾病，如胃癌、結直腸癌、肺癌和肝癌。抗癌治療或癌癥發生的預防包括下述步驟中的任何一種，如抑制癌細胞生長、癌癥的退化和對癌癥發生的抑制作用。癌癥的治療或預防也包括患癌個體死亡率的降低、血液中胂瘤標記的減少、與癌癥相伴隨的可測癥狀的減輕等。優選治療和預防作用在統計學上是顯著的，例如，與未施用疫苗的對照相比，優選在5%或更低的顯著性水平上觀察到抗細胞增殖性疾病的治療或預防效果。例如，Student'st-試驗、Mann-WhitneyU-試驗或ANOVA可用于統計學分析。上述具有免疫活性的蛋白質或編碼該蛋白質的載體可與佐劑混合。佐劑指的是當與具有免疫活性的蛋白質一起(或相繼)施用時能增強抗蛋白質的免疫應答的化合物。佐劑的例子包括霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬等，但并不局限于此。另外，本發明的疫苗可與藥物可接受載體適當混合。所述載體的例子是無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液、培養液等。另夕卜，必要時疫苗還可含有穩定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。可全身或局部施用疫苗。可通過單次給藥施用疫苗，或通過多次給藥加強免疫。當使用APC或CTL作為本發明的疫苗時，可通過例如來自體內的方法治療或預防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預防的受試者的PBMC，使來自體內的細胞與多肽接觸，誘導APC或CTL之后，可給受試者施用細胞。也可通過在來自體內的PBMC中導入編碼多肽的載體來誘導APC。在給藥前可克隆在體外誘導的APC或CTL。通過克隆和培養具有較高靶細胞損害活性的細胞，可更有效地進行細胞免疫治療。另外，按此方式分離的APC和CTL不僅可甩于針對細胞所來源的個體的細胞免疫治療，還可用于針對來自其它個體的相似類型腫瘤的細胞免疫治療。另外，本發明提供了用于治療或預防細胞增殖性疾病，如癌癥的藥物組合物，其含有藥物有效量的本發明多肽。藥物組合物可用于產生抗腫瘤免疫力。CXADRL1的正常表達局限于睪丸和卵巢，GCUD1的正常表達局限于睪丸、卵巢和腦；而RNF43的正常表達局限于胎兒，更具體地為胎肺和胎腎。因此，抑制這些基因不會對其它器官有不利影響。因此，優選使用CXADRL1和GCUD1多肽治療細胞增殖性疾病，特別是胃癌、結腸癌或肝癌；優選使用RNF43多肽治療細胞增殖性疾病，特別是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已證實分別含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97和108的RNF43肽片段能誘導抗RNF43的免疫應答，因此，含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97或108的多肽是用于藥物組合物的優選多肽的例子，所述組合物可用于治療或預防細胞增殖性疾病，特別是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已證實分別含有氨基酸序列SEQIDNO:124的CXADRL1肽片段能誘導抗CXADRL1的免疫應答，因此，含有氨基酸序列SEQIDNO:124的多肽是用于藥物組合物的優選多肽的例子，所述組合物可用于治療或預防細胞增殖性疾病，特別是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已證實分別含有氨基酸序列SEQIDNO:164的GCUD1肽片段能誘導抗GCUD1的免疫應答，因此，含有氨基酸序列SEQIDNO:164的多肽是用于藥物組合物的優選多肽的例子，所述組合物可用于治療或預防細胞增殖性疾病，特別是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。在本發明中，以足以誘導抗-月中瘤免疫力的劑量施用多肽或其片段，所述劑量范圍是0.1mg至10mg，優選為0.3mg至5mg，更優選為0.8mg至1.5mg。可以重復給藥。例如，每2周可施用lmg肽或其片段4次以誘導抗-腫瘤免疫力。提供下述實施例是為了闡明本發明，并幫助本領域技術人員制備和使用本發明。這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語與本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員所通常理解的意思相同。盡管在本發明的實踐或檢驗中可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但下文描述了適當的方法和材料。本文提及的任何專利、專利申請和出版物都列入本文作為參考。實施本發明的最佳模式51通過下述實施例詳細闡明本發明，但本發明并不局限于這些實施例。l.材料與方法(1)患者和組織樣本在已接受外科手術的患者知情同意的情況下，從其手術樣品中獲得所有胃癌和結腸癌組織以及相應的非-癌組織。(2)全基因組cDNA微陣列在此研究中使用含有23040個基因的來自機構內部的全基因組cDNA微陣列。從微量解剖組織中提取總RNA，用DNaseI處理提取的總RNA,用AmpliscribeT7轉錄試劑盒(EpicentreTechnologies)進行擴增，并在逆轉錄過程中使用Cy-染料(Amersham)進行標記(分別使用Cy5和Cy3標記得自非-癌組織和腫瘤的RNA)。然后，根據先前描述的方法(Onoetal.，CancerRes60:5007-11(2000))進行雜交、洗滌和4全測，使用ArrayVision軟件(AmershamPharmacia)測定每個靼點Cy5和Cy3的熒光強度。每個點測定雙份數值，減去背景信號之后，計算兩個值的平均值。然后，將載玻片上的所有熒光強度歸一化以調整每個載玻片上52個持家基因的平均Cy5和Cy3強度。從進一步的研究中排除Cy3和Cy5的強度皆低于25,000個熒光單位的基因，選擇Cy3/Cy5信號比率".0的基因進行進一步評價。(3)細月包系人胚腎293(HEK293)得自TaKaRa。C0S7纟田胞、NIH3T3細胞、人宮頸癌細胞系HeLa、人胃癌細胞系MKN-l和MKN-28、人肝癌細胞系Alexander以及人結腸癌細胞系LoVo,HCT116,DLD-1和SW480皆得自美國典型培養-物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。人肝癌細胞系SNU475和人結腸癌細胞系SNUC4和SNUC5得自韓國細胞系庫。在適當培養基單層中培養所有細胞COS7，NIH3T3,HEK293和Alexander使用Dulbecco改進的Eagle培養基；MKN-1，MKN-28,SNU475,SNUC4，DLD-1和SNUC5使用RPMI1640;HCT116使用McCoy's5A培養基；SW480使用Leibovitz，sL-15;LoVo使用HAM,sF-12;HeLa使用Eagle，s極限必需培養基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。所有培養基中都添加有10%胎牛血清和1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)。人胃癌細胞系St-4由日本癌癥研究所的Tsumo博士惠贈。在添加有10%胎牛血清和1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)的RPMI1640單層中培養St-4纟田月包。T2細胞(HLA-A承0201)和EHM(HLA-A3/3)，人B-類淋巴母細胞系由Shiku教授(Univ.Mie)惠贈。HT29(結腸癌細胞系；HLA-A24/01)，WiDR(結腸癌細胞系；HLA-A24/01)和HCT116(結腸癌細胞系；HLA-A02/01),DLD-1(結腸癌細胞系；HLA-A24/01),SNU475(肝細胞癌細胞系；HLA-A*0201)，MKN45(胃癌細胞系；HLA-A2陰性)，MKN7斗(胃癌細胞系；HLA-A2陰性)皆購自ATCC。TISI細胞(HLA-A24/24)由TakaraShuzo有限公司(Otsu，Japan)惠贈。RT-PCR檢測表明CX4i^L/在SNU475和MKN74中強表達。RT-PCR檢測表明GCMW在SNU475和MKN45中強表達。(4)RNA制備和RT-PCR根據廠商提供的方案，使用QiagenRneasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(LifeTechnologies)提取總RNA。使用聚dT12-18引物(AmershamPharmaciaBiotech)與SuperscriptII逆轉錄酶(LifeTechnologies),將10微克總RNA等分試樣逆轉錄成單鏈cDNA。稀釋每個單鏈cDNA制品，隨后在20(JPCR緩沖液(TaKaRa)中通過標準的RT-PCR實驗進行PCR擴增。在下述條件下使用GeneAmpPCR9700系統(Perkin-Elmer,FosterCity,CA)進行擴增94。C變性4分鐘；接著94。C30秒，56。C30秒和72°C45秒共20(GAPDH)，35(CXADRL1)，30(GCUD1)，30(RNF43)輪循環。引物序列為GAPDH:正向，5,畫ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQIDNO:7)和反向，5，-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQIDNO:8);CXADRL1:正向，5，-AGCTGAGACATTTGTTCTCTTG(SEQIDNO:9)和反向5，-TATAAACCAGCTGAGTCCAGAG(SEQIDNO:10);GCUD1正向5，-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(SEQIDNO:11),反向5，-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(SEQIDNO:12),RNF43正向5，-CAGGCTTTGGACGCACAGGACTGGTAC-3，(SEQIDNO:13)和反向5，-CTTTGTGATCATCCTGGCTTCGGTGCT-3，(SEQIDNO:14)。(5)Northern-印跡分析使人多組織印跡(Clontech，PaloAlto,CA)與CXADRLl,GCUDl或RNF43經^P-標記的PCR產物雜交。根據廠商的推薦進行預-雜交，雜交和洗滌。于-80。C用增感屏對印跡進行放射自顯影24至72小時。(6)cDNA末端的5，快速擴增f5，RACE)根據廠商說明，使用MarathoncDNA擴增試劑盒(CIontech)進行5，RACE實驗。為了擴增CXADRL1的5，部分，使用了基因-棒異性的反向引物(5，-GGTTGAGATTTAAGTTCTCAAA-3，(SEQIDNO:15))和試劑盒提供的AP-1引物。由人睪丸mRNA(Clontech)合成cDNA模板。使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆PCR產物，并用ABIPRISM3700DNA測序儀(AppliedBiosystems)測定其序列。(7)構建表達CXADRL1，GCUD1和FU20315的質粒使用下述基因特異性引物套，通過RT-PCR擴增CXADRLl,GCUD1和RNF43的完整編碼區CXADRL1,5，-AGTTAAGCTTGCCGGGATGACTTCTCAGCGTTCCCCTCTGG-3,(SEQIDNO:16)和5,-ATCTCGAGTACCAAGGACCCGGCCCGACTCTG-3,(SEQIDNO:17);GCUD1,5,-GCGGATCCAGGATGGCTGCTGCAGCTCCTCCAAG-3,(SEQIDNO:18)和5,-TAGAATTCTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3，(SEQIDNO:19);forRNF43,5，-TGCAGATCTGCAGCTGGTAGCATGAGTGGTG-3，(SEQIDNO:20)和5，-GAGGAGCTGTGTGAACAGGCTGTGTGAGATGT-3，(SEQIDNO:21)。將PCR產物克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)或pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)載體的適當克隆位點。(8)免疫印跡用PBS將用pcDNA3.1myc/His-CXADRLl,pcDNA3.1myc/His-GCUDl,pcDNA3.lmyc/His-RNF43或pcDNA3.lmyc/His-LacZ轉染的細胞洗滌2次，并收集于裂解緩沖液(150mMNaCl，1°/。TritonX-100,50mMTris-HClpH7.4,lmMDTT和lx完全蛋白酶抑制劑混合物(Boehringer))中。勻漿之后，以10,000xg離心細胞30分鐘，通過Bradford試驗(Bio-Rad)使上清液中的蛋白質濃度標準化。通過10%SDS-PAGE分離蛋白質，并用小鼠抗-myc抗體(SANTACRUZ)進行免疫印跡。將與HRP-偶聯的山羊抗-小鼠IgG(Amersham)用作ECL檢測系統(Amersham)的第二抗體。(9)免疫組化染色用含有4。/o低聚甲醛的PBS將經pcDNA3.1myc/His-CXADRLl，pcDNA3.1myc/His-GCUDl，pcDNA3.1myc/His-RNF43或pcDNA3.1myc/His-LacZ轉染的細胞固定15分鐘，然后，于室溫(RT)下用含有0.P/。TritonX-100的PBS將細胞透化2.5分鐘。隨后，于4。C用含2。/。BSA的PBS覆蓋細胞24小時以阻斷非特異性雜交。將l:1000稀釋的小鼠抗-myc單克隆抗體(Sigma)用作第一抗體，在同與羅丹明-偶聯的抗-小鼠第二抗體(Leinco和ICN)保溫之后觀察反應。用4，,6，-二脒-2，-苯基p引哚二鹽酸化物(DAPI)復染細胞核。在ECLIPSEE800顯微鏡下獲得熒光圖像。(10)集落形成試驗將被表達每種基因的質粒或對照質粒轉染的細胞與適當濃度的遺傳霉素一起保溫10至21天。用100。/。甲醇固定細胞并通過Giemsa溶液染色。所有實驗都進行三份。(11)建立過表達CXADRL1或RNF43的細胞在含有適當濃度遺傳霉素的培養基中維持分別被pcDNA3.1myc/His-CXADRL1,pcDNA3.1myc/His-RNF43,pcDNA3.1myc/His-LacZ或對照質粒轉染的NIH3T3，COS7和LoVo細胞。轉染2周后，選擇存活的單個集落，通過半定量RT-PCR檢查每種基因的表達。〖12)檢查反義寡核苷酸對細胞生長的作用使用LIPOFECTIN試劑(GIBCOBRL),用質粒或者CXADRLl,GCUD1或RNF43的合成S-寡核苷酸轉染鋪于10-cm平皿上的細胞(2xl()5個細胞/皿)。然后在添加有適當濃度遺傳霉素的培養基中培養6至12天。然后，用100%曱醇固定細胞并用Giemsa溶液染色。S-寡核苷酸的序列如下CXADRL1-S4，5,-TCTGCACGGTGAGTAG-3，(SEQIDNO:22);CXADRL1-AS4,5,-CTACTCACCGTGCAGA-3，(SEQIDNO:23);CXADRL1畫S5，5,-TTCTGTAGGTGTTGCA-3，SEQIDNO:24);CXADRL1-AS5,5,-TGCAACACCTACAGAA-3，(SEQIDNO:25);GCUD1-S5，5'-CTTTTCAGGATGGCTG畫3，(SEQIDNO:26);GCUD1-AS5,5，-CAGCCATCCTGAAAAG-3,(SEQIDNO:27);GCUD1-S8,5,-AGGTTGAGGTAAGCCG-3，(SEQIDNO:28);GCUD1-AS8，5，-CGGCTTACCTCAACCT-3，(SEQIDNO:29);RNF43陽S1，5,-TGGTAGCATGAGTGGT-3，(SEQIDNO;30);和RNF43國AS1，5,-ACCACTCATGCTACCA隱3，(SEQIDNO:31)。(13)3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)試驗用指定用于抑制CXADRLl,GCUDl或RNF43的有義或反義S-寡核苷酸轉染三份以5xl()5個細胞/皿的密度鋪于100mm平皿的細胞。轉染72小時之后，用含有500^g/mlMTT(3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四換培養基，將平板置于37。C保溫4小時。然后，加入lml0.01NHCl/10%SDS以裂解細胞。用ELISA平板讀數器，在570nm的檢測波長下(參比波長為630nm)測定裂解液的吸光度。用與對照相比而言的吸光度描述細胞生存力。(14)構建psiHlBX3.0由于據報道H1RNA基因由RNA聚合酶III轉錄，所述酶可在3，末端產生具有尿苷的短轉錄物，因此，使用一套引物5，-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3，[SEQIDNO:32]和5，-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3，[SEQIDNO:33],以人胎盤DNA作為模板，通過PCR擴增含有其啟動子區域的H1RNA基因的基因組片段。純化產物，根據廠商提供的方案使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將產物克隆至pCR2.0質粒載體。純化含有H1RNA基因的5awffl-J^oI片段，將其克隆至pcDNA3.1(+)質粒的第1257至56位核苷酸，使用一套引物5，-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3，(SEQIDNO:34)和5,-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3,(SEQIDNO:35),通過PCR擴增質粒，然后用5amHI和^2oI消化。將連接的DNA用作PCR模板，PCR引物是5，-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3，(SEQIDNO:36)和5，-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3，(SEQIDNO:37)。用歷Win消化產物，隨后自身連接以產生psiHlBX3.0載體質粒。通過將雙鏈寡核苷酸5，-CTTC-3,(SEQIDNO:38)和5,-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO:39)克隆至psiHlBX載體的加jI位點，制備出psiHlBX-EGFP以用作對照。(15)檢查RNF43-或CXADRL1-siRNA的基因沉默作用通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiHlBX3.0載體，制備出表達RNF43-siRNA或CXADRLl-siRNA的質粒。用作RNF43siRNA的寡核苷酸是siRNA16-4,5,-TCCCGTCACCGGATCCAACTCAGTTCAAGAGACTGAGTTGGATCCGGTGAC陽3，(SEQIDNO:40)和5，-AAAAGTCACCGGATCCAACTCAGTCTCTTGAACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3，(SEQIDNO:41);siRNAl834，5，-TCCCGCTATTGCACAGAACGCAGTTCAAGAGACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3，(SEQIDNO:42)和5,畫AAAAGCTATTGCACAGAACGCAGTCTCTTGAACTGCGTTCTOTGCAATAGC-3，CSEQIDNO:43);siRNAl,5,-TCCCCAGAAAGCTGTTATCAGAGTTCAAGAGACTCTGATAACAGCTTTCTG-3,(SEQIDNO:44)和5,-AAAACAGAAAGCTGTTATCAGAGTCTCTTGAACTCTGATAACAGCTTTCTG-3，(SEQIDNO:45);siRNA14,5，-TCCCTGAGCCACCTCCAATCCACTTCAAGAGAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3，(SEQIDNO:46)和5,-AAAATGAGCCACCTCCAATCCACTCTCTTGAAGTGGATTGGAGGTGGCTCA國3，(SEQIDNO:47);siRNAl5,5，-TCCCCTGCACGGACATCAGCCTATTCAAGAGATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3,(SEQIDNO:48)和5，-AAAACTGCACGGACATCAGCCTATCTCTTGAATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3，(SEQIDNO:49)。用作CXADRL1-siRNA的寡核苷酸是siRNA#1,5，-TCCCGTGTCAGAGAGCCCTGGGATTCAAGAGATCCCAGGGCTCTCTGACAC曙3，(SEQIDNO:50)和5，-AAAAGTGTCAGAGAGCCCTGGGATCTCTTGAATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3,(SEQIDNO:51);siRNA#2,5，-TCCCCCTCAATGTCATTTGGATGTTCAAGAGACATCCAAATGCAATTGAGG-3,(SEQIDNO:52)和5TGAGG-3,(SEQIDNO:53);siRNA#3，5,-TCCCTGTCATTTGGATGGTCACTTTCAAGAGAAGTGACCATCCAAATGACA-3，(SEQIDNO:54)和5，-AAAATGTCATTTGGATGGTCACTTCTCTTGAAAGTGACCATCCAAATGACA-3，(SEQIDNO:55);siRNA#4,5，畫TCCCTGCCAACCAACCTGAACAGTTCAAGAGACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3,(SEQIDNO:56)和5,-AAAATGCCAACCAACCTGAACAGTCTCTTGAACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3,(SEQIDNO:57);siRNA#5,5'-TCCCCCAACCTGAACAGGTCATCTTCAAGAGAGATGACCTGTTCAGGTTGG國3，(SEQIDNO:58)和5，-AAAACCAACCTGAACAGGTCATCTCTCTTGAAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3,(SEQIDNO:59);siRNA#6,5，-TCCCCCTGAACAGGTCATCCTGTTTCAAGAGAACAGGATGACCTGTTCAGG-3，(SEQIDNO:60)和5，-AAAACCTGAACAGGTCATCCTGTTCTCTTGAAACAGGATGACCTGTTCAGG-3，(SEQIDNO:61);以及CXADRL-siRNA弁7,5，-TCCCCAGGTCATCCTGTATCAGGTTCAAGAGACCTGATACAGGATGACCTG畫3,(SEQIDNO:62)和5，-AAAACAGGTCATCCTGTATCAGGTCTCTTGAACCTGATACAGGATGACCTG-3，(SEQIDNO:63)。根據廠商推薦的方法，使用FuGENE6試劑(Roche)將psiHlBX-RNF43,psiHlBX-CXADRLl或psiHlBX畫mock質粒轉染至SNUC4或St-4細胞。轉染48小時之后，從細胞中提取總RNA。(16)構建RNF43蛋白重組的氨基-和羧基-末端區域使用下述引物套，通過RT-PCR擴增iiVF^3的氨基-和羧基-末端區域5'-GAAGATCTGCAGCGGTGGAGTCTGAAAG誦3，(SEQIDNO:64)和5，-GGAATTCGGACTGGGAAAATGAATCTCCCTC-3，(SEQIDNO:65)(氨基-末端區域)；以及5，-GGAGATCTCCTGATCAGCAAGTCACC-3，(SEQIDNO:66)和5，-GGAATTCCACAGCCTGTTCACACAGCTCCTC隱3，(SEQIDNO:67)(羧基-末端區域)。用BawHHcoRI消化產物，克隆至pET-43.1a(+)載體(Novagen)的Bawffl-5coRI位點。將質粒轉染至大腸桿菌BL21&xS(DE3)pLysS細胞。加入0.2mMIPTG之后，從在25^C培養16小時的細胞中提取重組RNF43蛋白。(!7)酵母雙-雜合實驗根據廠商提供的方案，使用MATCHMAKERGAL4雙雜合系統3(Clontech)進行酵母雙-雜合試驗。將/2iVF^5完整的編碼序列克隆至pAS2-l載體的五coRI-Saw別位點以作為辨，用以篩選人-睪丸cDNA文庫(Clontech)。為了進一步證實酵母中的相互作用，將pAS2-RNF43用作誘辨載體，將pACT2-NOTCH2和pACT2-STRIN用作捕獲載體。我們將CXADRL1的胞質區克隆至pAS2-1載體的EcoRI位點以作為斜，用以篩選人睪丸cDNA文庫(Clontech)。為了進一步證實酵母中的相互作用，我們將pAS2-CXADRLl用作誘餌載體，將pACT2-AIPl用作捕獲載體。(18)制備CXADRL特異性抗體通過用包含密碼子235-276(Ab-l),493-537(Ab-2)或70-lll(Ab-3)的CXADRL合成肽進行免疫，制備出抗-CXADRL抗血清。使用在被pET-CXADRL質粒轉染的大腸桿菌中制備的經His-標記的重組CXADRLl蛋白純化血清。通過10%SDS-PAGE進一步分離從表達經Flag標記的CXADRLl的細胞中提取的蛋白質，并用抗-CXADRL1血清或抗-Flag抗體進行免疫印跡。分別將與HRP-偶聯的山羊抗-兔IgG或與HRP-偶聯的綿羊抗-小鼠IgG抗58體用作ECL檢測系統(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)的第二抗體。抗-CXADRLl抗血清的免疫印跡顯示出50kD經FLAG-標記的CXADRL1帶，其模式與用抗-FLAG抗體檢測到的相同。(19)制備重組GCUD1蛋白為了產生特異于GCUD1的抗體，需制備重組GCUD1蛋白。使用下述引物套，通過RT-PCR擴增GCOD/的完整編碼區5，-GCGGATCCAGGATGGCTGCAGCTCCTCCAAG-3,(SEQIDNO:68)和5,-CTGAATTCACTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3，(SEQIDNO:69)。純化產物，用5amHl和五coRl消化，克隆至pGEX6P-2的適當克隆位點。將所得質粒稱為pGEX-GCUDl。將pGEX-GCUDl質粒轉化至大腸桿菌DH10B。通過加入IPTG誘導重組蛋白質的產生，根據廠商提供的方法，用GlutathioneSepharoseTM4B(AmershamPharmacia)純4匕蛋白質。(20)制備GCUD1特異性抗體抗GCUD1的多克隆抗體純化自血清。通過10%SDS-PAGE進一步分離用表達經Flag標記的GCUD1的質粒轉染的細胞中的蛋白質，并用抗-GCUD1或抗-Flag抗體進行免疫印跡。分別將與HRP-偶聯的山羊抗-兔IgG(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)或與HRP-偶聯的抗-Flag抗體用作ECL檢測系統(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)的第二抗體。與用抗-FLAG抗體檢測到的相同。(21)統計學分析對數據進行差異分析(ANOVA)和Schef伎，sF試驗。(22)制備肽借且力于纟吉合預領']專欠4牛(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker—comboform)預測能與HLA-A24或HLA-A*0201分子結合的RNF43,CXADRL1或GCUD19聚體和10聚體肽。根據標準的固相合成法，通過Mimotopes,SanDiego,LA合成這些肽，并通過反相HPLC進行純化。分別通過分析型HPLC和質譜分析測定肽的純度(>90%)和同一性。以20mg/ml的濃度將肽溶解于二曱基亞砜(DMSO),并儲存于-80。C。(23)體外CTLi秀導對HLA上呈遞的肽的CTL應答。按文獻所述在體外產生DC(N—ukayaetal.，IntJCancer80:92-7(1999);Tsaietal"JImmunol158:1796-802(1997))。具體地說，使用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液從具有HLA-A*0201或HLA-A24的健康志愿者體內分離外周血單核細胞(PBMC),通過粘附于塑料組織培養瓶(BectonDickinson)分離出PBMC的單核細胞組分。在含有2%熱-滅活的自身血清(AS)、1000U/mlGM-CSF(由KirinBrewery公司提供)和lOOOU/mlIL-4(Genzyme)的AIM-V培養基(Invitrogen)中將所述單核細胞組分培養7天以獲得DC組分。于20。C，在AIM-V中，在3嗎/ml卩2-微球蛋白的存在下將20嗎/ml候選肽脈沖至富含DC的細胞群體上達4小時。然后，照射(5500拉德)這些經肽脈沖的抗原呈遞細胞，并以l:20的比例與自身CD8+T細胞混合，所述T細胞是通過用DynabeadsM-450CD8(Dynal)和Detachabead(Dynal)進行陽性選擇而獲得的。在48-孔培養板(Corning)中建立這些培養物，在每孔0.5ml含有2%AS的AIM-V中含有1.5乂104個經肽脈沖的抗原呈遞細胞，3xl()S個CD8+T細胞和10ng/mlIL-7(Genzyme)。3天后，在這些培養物中添加IL-2(CfflRON)至終濃度為20IU/ml。在第7和14天，使用每次皆按照與上述相同的方法制備的經自身肽-脈沖的抗原呈遞細胞重新刺激T細胞。第21天，收集培養物中的淋巴細胞并檢測其針對經肽-脈沖的TISI或T2細胞的細胞毒性。(24)CTL擴展(ex。ansion)使用與Riddell等所述的方法(Walteretal.,NEnglJMed333:1038-1044，1995;Riddeletal"NatureMed.2:216-223,1996)類似的方法，在培養物中進一步擴展經培養的淋巴細胞，已證實所述細胞對經肽-脈沖的TISI或T2細胞具有顯著的細胞毒性。將5xl(^個淋巴細胞重新懸浮于25ml添加有5%AS的AIM-V中，其中還含有25xl()6個經照射(3300拉德)的PBMC,5xl06個經照射(8000拉德)的EHM細胞和40ng/ml抗-CD3單克隆抗體(Pharmingen)。培養1天后，在培養物中加入120IU/mlIL-2。在第5，8和11天，培養物包含新鮮的AIM-V,其中添加有5。/。AS和30IU/mlIL-2。f25)建立CTL克隆使用一些具有強細胞毒性的淋巴細胞獲得CTL克隆。在96孔圓底微滴板(NalgeNuncInternational)中，將細胞懸浮液稀釋成密度為0.3,1和3CTL/淋巴細胞/孔。在150pl/孔添加有5%AS的AIM-V中培養這些細胞，所迷培養基中含有7xl(^個細胞/孔的同種異體PBMC,lx—104個細胞/孔的EHM,30ng/ml抗-CD3抗體和125U/mlIL-2。IO天后，在培養基中加入50^1/孔IL-2至終濃度為125U/ml。第14天，檢測經培養CTL的細胞毒活性，使用與上述相同的方法擴展CTL克隆。(26)細胞毒性試驗于37。C,在C02溫箱中用100pCiNa251CrO4(PerkinElmerLifeSciences)將靶細胞標記1小時。當使用經肽脈沖的靶時，在用Na^Cr04標記前，于37。C加入20iig/mi肽與靶細胞一起保溫16小時。沖洗耙細胞，在圓底微滴板中與效應細胞混合至終體積為0.2ml。離心微滴板(4分鐘，800xg)以增加細胞與細胞的接觸，并置于37°C的C02溫箱中。保溫4小時之后，從每個孔中收集O.lml上清液，用y計數器測定其放射性。當評價針對內源性表達或CX4DiI7或GCt/D7的耙細胞的細胞毒性時，在過量30倍的未標記K562細胞的存在下檢測細胞裂解活性，K562的存在是為了降低任何由NK-樣效應細胞引起的非-特異性裂解。通過未標記靶的抑制試驗進一步證實抗原特異性，所迷試驗利用被肽脈沖(20jag/ml，16小時，37。C)的未標記TISI或T2細胞以竟爭經"Cr-標記的HT29或SNU475細胞的識別。通過阻斷試驗檢查MHC限制，測定抗HLA-I類(W6/32)抗體和抗HLA-II類抗體，抗CD4抗體和抗CD8抗體(DAKO)對細胞毒性的抑制作用。通過用下述公式計算特異性51Cr-釋放的百分比以測定特異性細胞毒性的百分比{(受試樣品釋放的cpm-自發釋放的cpm)/(最大釋放的cpm-自發釋放的cpm)}x100。通過在缺乏效應細胞時僅保溫靶細胞來測定自發釋放，通過使靶與INHC1保溫獲得最大釋放。所有決定因子都測兩份，平均值的標準誤差始終低于平均值的10%。2.結果n)鑒定兩個常在胃癌中被上調的新的人基因CXADRL1和GCUD1利用含有23040個基因的全基因組cDNA微陣列，將20例胃癌的表達分布圖與相應的非癌粘膜相比較。由微陣列分析檢測到的常被上調的基因中，對應于UniGene簇的EST,Hs.6658(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGeneA)、機構內部登錄號為A5928的基因在4.09至48.60的范圍內過表達(圖la)。由于該基因的開放閱讀框編碼的蛋白質與CXADR(柯薩奇病毒和腺病毒受體)的同一性約為37%。因此，將該基因命名為CXADRL1(柯薩奇病毒和腺病毒受體樣1)。CX4ARZJ也在6例結腸癌的6例中和20例HCC的12例中被上調。另外，通過微陣列我們還注意到對應于UniGene簇的KIAA0913基因產物(Hs.75137)、機構內部登錄號為C8121的基因，與相應的非-癌胃粘膜相比，所述基因在12個胃癌組織的9個中有顯著增強的表達(圖lb)。將機構內部登錄號為C8121的基因稱為GCUD1(在胃癌中被上調)。GCf/D/也在6例結腸癌中的5例，6例HCC中的1例，14例肺癌(鱗狀細胞細胞癌)中的1例，13例睪丸精原細胞瘤中的1例中被上調。為了闡明cDNA微陣列的結果，通過半定量RT-PCR檢查這些轉錄物在胃癌中的表達，以證實CXADRL1在所有10個腫瘤中的表達增加(圖lc)，GCUD1在9例癌癥中的7例中表達提高(圖ld)。(2)新基因CX4i^L7的分離和結構使用CXADRL1PCR產物作為探針的多-組織Northern-印跡分析揭示出3.5-kb轉錄物在睪丸和卵巢中的表達(圖2a)。由于A5928小于在Northern印跡上檢測到的基因，進行5，RACE實驗以測定CX4Z)虹7基因的完整編碼序列。推定的全長cDNA由3423個核苷酸組成，其中1296個核苷酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:l)編碼431個氨基酸長的蛋白質(SEQIDNO:2)(GenBank登錄號AB071618)。第一個ATG的側翼序列為(CCCGGGATGA)(SEQIDNO:70),這與真核生物中起始翻譯所用的共有序列一致，其上游具有框內終止密碼子。使用BLAST程序在NCBI(國立生物技術信息中心)數據庫中進行同源性檢索，鑒定出GenBank登錄號為AC068984的基因組序列，該序列被定位于染色體帶3ql3。將該cDNA與基因組序列相比較，揭示出CXADRLl由7個外顯子組成(圖2b)。用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART，http:〃smart.embl-heiddberg.de)檢索蛋白質基元，結果表明推測的蛋白質含有2個免疫球蛋白結構域(密碼子29-124和158-232)和一個跨膜結構域(密碼子246-268),暗示CXADRLl可能屬于免疫球蛋白超家族。(3)CXADRL1對細胞生長的作用通過用表達CXADRLl的質粒(pcDNA3.1myc/His-CXADRLl)轉染NIH3T3細胞以進行集落-形成試驗。與被模擬載體轉染的細胞相比，被pcDNA3.1myc/His-CXADRLl轉染的細胞產生顯著更多的集落(圖3a)。為62了進一步研究CXADRL1的生長-促進作用，建立了穩定表達外源性CXADRL1的NIH3T3細胞(圖3b)。在含有10%FBS的培養基中，NIH3T3-CXADRL1細胞的生長速度顯著高于親代NIH3T3細胞(圖3c)。(4)通過反義S-寡核苷酸抑制CXADRL1在人胃癌細胞中的表達將6對對應于CX4D^ZJ的對照和反義S-寡核苦酸轉染至MKN-1胃癌細胞，在被4全查的6個胃癌細胞系中，MKN-1顯示出最高水平的CXADRL1表達。轉染6天后，通過MTT試驗測定轉染細胞的生存力。被反義S-寡核苦酸(CXADRL1-AS4或-AS5)轉染的存活細胞顯著少于被對照S-寡核苷酸(CXADRL1-S4或-S5)轉染的存活細胞(圖4)。在三個獨立的實驗中獲得了一致的結果。(5)表達CXADRL1siRNA的質粒的構建及其對胃癌細胞生長的作用構建表達多種CXADRLl-siRNA的質粒，并檢查其對C%4￡>^L7表達的作用。在構建的siRNA中，psiHlBX-CXADRL7能顯著抑制CX4i^L7在St-4細胞中的表達(圖5A)。為了檢測抑制CX4D/U是否能導致結腸癌細胞的生長抑制，用psiHlBX-CXADRL7或模擬載體轉染St-4細胞。用psiHlBX-CXADRL7轉染的存活細胞數目少于存活的對照細胞數目(圖5B和5C)。(6)制備抗-CXADRLl抗體為了檢查CXADRL1的表達并研究其功能，制備了抗CXAD虹1的抗血清。用抗-CXADRLl進行的免疫印跡檢測到50kD經FLAG-標記的CXADRL1帶，這與用抗-FLAG抗體檢測到的大小幾乎相同(圖6)。.(7)通過酵母雙-雜合篩選系統鑒定CXADRLl-相互作用蛋白為了闡明CXADRL1的功能，我們使用酵母雙-雜合篩選系統搜索CXADRLl-相互作用蛋白。在鑒定出的陽性克隆中，通過同時用pAS2.1-CXADRL1和pACT2-AIPl轉化酵母細胞而使核AIP1(atrophin相互作用蛋白l)的C-末端區域與CXADRL1相互作用(圖7)。陽性克隆含有密碼子808至1008，AIP1中負責相互作用的區域就位于該區域內。(8)推測衍生自CXADRL1的候選肽表1以高結合親和性的次序顯示出候選肽(SEQIDNO:115-154)。總共選捧和4企查了下述40個肽。表1推測衍生自CXADRL1的候選肽<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>(9)使用候選肽刺激T細胞并建立CTL克隆按照"材料和方法"中所述的方法，使用這些衍生自CXADRLl的候選肽培養淋巴細胞。擴展所獲得的顯示出可測細胞毒活性的淋巴細胞，并建立CTL克隆。使用有限稀釋法由上述CTL系增殖CTL克隆。與未經任何肽脈沖的乾相比，用CXADRLl-207(ALSSGLYQC)(SEQIDNO:124)誘導的CTL克隆對經肽脈沖的靶顯示出較高的細胞毒活性。圖8顯示了該CTL克隆的細胞毒活性。該CTL克隆對經肽脈沖的靶顯示出很強的細胞毒活性，而對未經任何肽脈沖的靶未顯示出任何細胞毒活性。(10)針對內源性表達CXADRLl以作為靶的腫瘤細胞系的細胞毒活性檢查針對推測肽產生的CTL克隆識別并殺死內源性表達CXADRLl的腫瘤細胞的能力。圖9顯示出針對CXADRLl-207(ALSSGLYQC)(SEQIDNO:124)產生的CTL克隆75的結果。CTL克隆75對表達CXADRLl和HLA-A*0201的SNU475顯示出強有力的細胞毒活性，然而對表達CXADRLl但不表達HLA-A*0201的MKN74,以及表達HLA-A*0201但不表達CXADRLl的SNU-C4卻未顯示出細胞毒活性。(in已建立的CTL的特異性進行未標記靶的抑制試驗以進—一步證實CXADRL1-207CTL克隆的特異性。將經"Cr標記的SNU475細胞用作經標記耙，而將用CXADRL1-207(SEQIDNO:124)脈沖的未經"Cr標記的T2細胞用作未標記耙。當在試驗中以多個比例加入用CXADRL1-207(SEQIDNO:124)脈沖的.T2時，針對SNU475細胞的特異性細胞裂解^C顯著抑制(圖10)。以E/T-20的比例將這些結果表示為特異性裂解的百分比。關于CXADRL1-207CTL克隆，為了檢查這些CTL克隆的特征，檢測了抗HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8的抗體抑制細胞毒活性的能力。當使用抗-HLA-I類抗體和抗-CD8抗體時，CTL克隆對SNU475細胞的細胞毒性受到顯著抑制(圖11),這表明CTL克隆以HLA-I類和CD8方式識別衍生自CXADRL1的肽。(12)表達和鑒定新的人基因GCL^>7使用GCUD1cDNA作為探針進行多-組織Northern印跡分析，結果顯示出5.0-kb轉錄物在睪丸、卵巢和腦中特異性表達(圖12)。盡管與GCUD1相對應的KIAA0913的核苷酸序列(GenBank登錄號XM-014766)由4987個核苦酸組成，使用睪丸、卵巢和癌癥組織的RT-PCR實驗揭示出由由4987個核苷酸組成的轉錄物含有1245個核苦酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:3)(GenBank登錄號AB071705)。另外，在基因組數據庫中檢索對應于Gt/CZ)7的基因組序列以尋找出定位于染色體帶7pl4的草圖序列(GenBank登錄號NT-007819)。將cDNA序列與基因組序列相比較，揭示出Gf/CD/基因由8個外顯子組成。n3)GCUDl的亞細胞定位將對應于GCt/D7的完整編碼區克隆至pCDNA3.1myc/His載體，將構建體瞬時轉染至C0S7細胞。COS7細胞的免疫細胞化學染色揭示出經標記的GCUD1蛋白存在于胞質中(圖13)。(14)GCUD1對細胞生長的作用為了分析GCUD1對細胞生長的作用，通過用表達GCUD1的質粒(pcDNA3.1myc/His-GCUDl)轉染NIH3T3細胞來進行集落-形成試驗。與對照質粒(pcDNA3.1myc/His-LacZ)相比，pcDNA3.1myc/His誦GCUDl能在NIH3T3細胞中誘導明顯更多的集落(圖14)。通過三個獨立的實驗進一步證實了該結果。(15)通過指定用于減少GCUD1表達的反義S-塞核苷酸抑制胃癌細胞的生長為了檢測抑制GCUD1是否能導致胃癌細胞死亡，合成了多個被設計用于抑制GCUD1表達的反義S-寡核苷酸。用各個反義S-寡核苦酸轉染6天后，通過MTT試驗測定轉染細胞的生存力。在MKN-28細胞中，被反義S-寡核苦酸(GCUD1-AS5或-AS8)轉染的存活細胞顯著少于被對照S-寡核苷酸(GCUD1-S5或-S8)轉染的存活細胞(圖15)。通過三個獨立的實驗進一步證實該結果。用MKN-1細胞觀察到類似的結果。(16)制備抗-GCUDl抗體為了檢查GCUD1的表達并研究其功能，制備了抗GCUD1的抗血清。重組GCUD1蛋白提取和純化自表達GST-GCUD1融合蛋白的細菌細胞(圖16)。用重組蛋白質免疫三只兔。用抗-GCUD1血清而不是預免疫血清進行的免疫印跡顯示出47kD經FLAG-標記的GCUD1帶，這與用抗-FLAG抗體檢測到的大小幾乎相同(圖17)。〖17)推測衍生自GCUD1的候選肽表2(GCUD1)以高結合親和性的次序顯示出候選肽(SEQIDNO:155-194)。總共選擇和;險查了下述40個肽。表.2推測衍生自GCUD1的候選肽HLA-A*02019聚體HLA-A*020110聚體<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>(18M吏用候選肽刺激T細胞并建立CTL克隆按照"材料和方法"中所述的方法，使用這些衍生自GCUD1的候選肽培養淋巴細胞。擴展所獲得的顯示出可測細胞毒活性的淋巴細胞，并建立CTL克隆。使用有限稀釋法由上述CTL系增殖CTL克隆。與未經任何肽脈沖的耙相比，用GCUD1-196(KMDAEHPEL)(SEQIDNO:164)和GCUD1-272(FLTTASGVSV)(SEQIDNO:177)誘導的CTL克隆對經肽脈沖的耙顯示出較高的細胞毒活性。圖18顯示了這些CTL克隆的細胞毒活性。每個CTL克隆對經肽脈沖的靶顯示出很強的細胞毒浩性，而對未經任何肽脈沖的革巴未顯示出任何細胞毒活性。(19)針對內源性表達GCUD1以作為靶的腫瘤細胞系的細胞毒活性檢查針對推測肽產生的CTL克隆識別并殺死內源性表達GCUD1的肺瘤細胞的能力。圖19顯示出針對GCUD1-196(SEQIDNO:164)產生的CTL克隆23的結果。CTL克隆23對表達GCUD1和HLA-A*0201的SNU475顯示出強有力的細胞毒活性，然而對表達GCUD1但不表達HLA-A*0201的MKN45卻未顯示出細胞毒活性。(20)已建立的CTL的特異性進行未標記靶的抑制試驗以進一步證實GCUD1-196CTL克隆的特異性。將經"Cr標記的SNU47—5細胞用作經標記靶，—而將用GCUDl-196脈沖的未經"Cr標記的T2細胞用作未標記靶。當在試驗中以多個比例加入用GCUDl-196(SEQIDNO:164)脈沖的T2時，針對SNU475細胞的特異性細胞裂解^皮顯著抑制(圖20)。以E/T=20的比例將這些結果表示為特異性裂解的百分比。關于GCUDl-196(SEQIDNO:164)CTL克隆，為了檢查這些CTL克隆的特征，；險測了抗HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8的抗體抑制細胞毒活性的能力。當使用抗-HLA-I類抗體和抗-CD8抗體時，CTL克隆對SNU475細胞的細胞毒性受到顯著抑制(圖21),這表明CTL克隆以HLA-I類和CD8方式識別衍生自GCUD1的肽。(21)鑒定在人結腸癌中常凈皮上調的基因使用含有23040個基因的cDNA微陣列將11個結腸癌組織的表達分布圖與相應的結腸非癌粘膜組織相比較。根據此分析，多個基因在癌癥組織中的表達水平經常比相應的非癌組織中的高。其中，與相應的非癌粘膜相比，對應于UniGene蔟的EST(FU20315),Hs.l8457(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)、機構內部登錄號為B4469的基因在癌癥組織中以1.44至11.22的放大范圍被上調(圖22a)。也在18例胃癌中的6例，20例HCC中的12例，22例肺癌(腺癌)中的11例，2例睪丸精原細胞瘤中的2例和9例前列腺癌中的3例中被上調。為了闡明微陣列的結果，通過半定量RT-PCR檢查這些轉錄物在其它結腸癌樣品中的表達，以進一步證實18例腫瘤中的15例中FLJ20315表達的增加(圖22b)。f22)RNF43的表達和結構使用國立生物技術信息中心的BLAST程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),在公共數據庫中對F厶/2W/5序列進行額外的同源性檢索，鑒定出包括XM—097063，BF817142的EST,以及被定位于染色體帶17pter-pl3.1的基因組序列(GenBank登錄號為NT-010651)。結果，獲得5345個核苷酸長的裝配序列，其中含有2352個核苷酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:5)，其編碼783個氨基酸長的蛋白質(SEQIDNO:6)(GenBank登錄號AB081837)。將該基因稱為RNF43(環指蛋白43)。第一個ATG的側翼序列為(AGCATGC),這與真核生物中起始翻譯所用的共有序列一致，其上游具有框內終止密碼子。將該cDNA與基因組序列相比較，揭示出該基因由11個外顯子組成。使用以RNF43的PCR產物為探針的成人多-組織Northem-印跡進行的Northern-印跡分析未檢測到任何帶(數據未顯示)。然而，使用以相同PCR產物為探針的人胎組織Northern-印跡在胎肺和胎腎中檢測到5.2kb-轉錄物的表達(圖23a)。用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART,http:〃smart.embl-heidelberg.de)檢索蛋白質基元，揭示出推測的蛋白質含有環指基元(密碼子272-312)(圖23b)。(23)經myc-標記的RNF43蛋白的亞細胞定位為了研究RNF43蛋白的亞細胞定位，將表達經myc-標記的RNF43蛋白的質粒(pDNAmyc/His-RNF43)瞬時轉染至COS7細胞。使用細胞提取物和抗-myc抗體的Western印跡分析揭示出對應于經標記蛋白質的85.5-Kda帶(圖24a)。隨后用相同抗體對細胞進行免疫組化染色，結果表明蛋白質主要存在于細胞核中(圖24b)。在SW480人結腸癌細胞中觀察到類似的RNF43亞細"包定位。〖24)RNP43對細胞生長的作用通過用表達RKF43的質粒(pcDNA-RNF43)轉染NIH3T3細胞以進行集落-形成試驗。與對照細胞相比，被pcDNA-RNF43轉染的細胞產生顯著更多的集落(圖25a)。在RNF43的內源性表達很低的SW480細胞中也顯示出由RNF43導致的增加的集落形成活性(數據未顯示)。為了進一步研究該生長-促進作用，建立了穩定表達外源性RNF43的COS7細胞(COS7-RNF43)(圖25b)。在含有10%FBS的培養基中，COS7-RNF43細胞的生長速度顯著高于COS7-模擬細胞(圖25c)。(25):通過指定用于降低RNF43表達的反義S-寡核苷酸抑制結腸癌細胞生長為了檢測抑制RNF43表達是否能導致結腸癌細胞的生長阻滯和/或細胞死亡，合成了5對對應于RNF43的對照和反義S-寡核苷酸，并將它們轉染至LoVo結腸癌細胞，在被檢查的11個結腸癌細胞系中，LoVo細胞顯示出較高水平的RNF43表達。轉染12小時后，與對照S-寡核苷酸(RNF43-Sl)相比，5個反義S-寡核苦酸中的RNF43-AS1能顯著抑制RNF43表達(圖26a)。轉染6天后，被RNF43-AS1轉染的存活細胞數目顯著少于被RNF43-S1轉染的存活細胞數目，暗示著抑制RNF43表達能抑制轉染細胞的生長和/或存活(圖)。在三個獨立的實驗中獲得一致的結果。—的質粒—的構建及其對結腸癌細胞生長的作用最近已證實在哺乳動物細胞中，短的干擾RNA(siRNA)具有基因特異性的基因沉默作用，而不會誘導基因表達的全面改變，所述siRNA由具有19個互補核苦酸和3'末端互補的胸苷或尿苷二聚體的20至21聚體雙鏈RNA(dsRNA)組成。因此，本發明人構建了表達多種RNF43-siRNA的質粒，并檢查了它們對凡VFW表達的作用。在多種RNF43-siRNA中，psiHlBX-RNF16-4和psiHlBX-RNF1834能顯著抑制SNUC4細胞中的/WF43表達(圖27A)。為了檢測抑制iA^^3是否能導致結腸癌細胞的生長受抑制，用psiHlBX-RNF16-4，psiHlBX-RNF1834或模擬載體轉染SNUC4細胞。與反義S-寡核苷酸的數據一致，被psiHlBX-RNF16-4或psiHlBX-RNF1834轉染的存活細胞數目少于存活的對照細胞數目(圖27B,27C)。〖27)經Flag-標記的RNF43蛋白在具有經Flag-標記的外源性RNP43蛋白的COS7細胞的培養基中的分泌由于使用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART,http:〃smart.embl-heidelberg.de)檢索具有RNF43氨基酸序列的蛋白質基元推測出信號肽和環指結構域，因此檢查了RNF43蛋白的分泌情況。將表達經Flag-標記的RNF43(pFLAG-RNF43)或經Myc-標記的RNF43(pcDNA3.1-Myc/His-RNF43)的質粒或模擬載體轉染至COS7細胞，在添加有0.5%胎牛血清的培養基中培養細胞48小時。用抗-Flag抗體或抗-Myc抗體進行Western印跡分析，分別在含有被pFLAG-RNF43或pcDNA3.1-Myc/His-RNF43轉染的細胞的培養基，而不是含有被模擬載體轉染的細胞的培養基中檢測出分泌的經Flag-標記的RNF43或經Myc-標記的蛋白質(圖28A和28B)。(28)被pFLAG-RNF43轉染的細胞的培養基對NIH3T3細胞的作用由于RNF43的外源性表達對NIH3T3細胞有生長促進作用，因此，檢查了分泌的經Flag-標記的RNF43是否也對NIH3T3細胞有增殖作用。不更換培養基，或用被模擬載體轉染的細胞的條件培養基，或用被pFlag-RNF43轉染的細胞的條件培養基培養NIH3T3細胞。正如所期望的那樣，與在條件培養基中培養的未經處理的細胞或被模擬載體轉染的細胞相比，在條件培養基中培養的被pFlag-RNF43或pcDNA3.1-Myc/His-RNF43轉染的細胞顯示出顯著較高的生長速度(圖29A和29B)。這些數據表明RNF4370可以自泌的方式發揮其生長促進作用。(29)制備重組氨基-和羧基-末端RNF43蛋白為了產生抗RNF43的特異性抗體，構建了表達經Nus-標記的RNF43蛋白的質粒(圖30A)。將質粒轉化至大腸桿菌BL21trxB(DE3)pLysS細胞，通過SDS-PAGE觀察到細菌提取物中具有預期大小的重組蛋白質的產生(圖30B和30C)。(30)通過酵母雙雜合篩選系統鑒定RNF43-相互作用蛋白為了闡明RNF43的致癌機理，使用酵母雙雜合篩選系統搜索RNTF43-相互作用蛋向。在鑒定出的陽性克隆中，通過用pAS2.1-RNF43和pACT2-N0TCH2(圖31B),或pAS2.1-RNF43和pACT2-STRIN(圖32B)同時轉化酵母細胞使NOTCH2或STRIN與RNF43相互作用。圖31A和圖32A分別顯示了NOTCH2和STRIN中負責相互作用的區域。Ol)推測衍生自RMF43的HLA-A24結合肽<吏用結合予頁測壽欠"f牛(http:〃bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker—comboform)掃描RNF43的氨基酸序列以搜索長度為9或10個氨基酸的與HLA-A24結合的肽。表3以高結合親和性的次序顯示出推測的肽(SEQIDNO:71-90)。總共選擇和檢查了下述20個肽。表3推測的與HLA-A24結合的RNF43多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在表中，起始位置表示自RNF43N-末端起的氨基酸位置。(32)使用推測的肽刺激T細胞根據"材料和方法"中所述的方法產生針對這些衍生自RNF43的肽的CTL。擴展所獲得的顯示出可測細胞毒活性的CTL,并建立CTL系。表4顯示了通過9聚體-肽(SEQIDNO:71-80)刺激所誘導的CTL系的細胞毒活性。表4CTL系(9聚體)的細月^性起始位置AA.序列士合,口口親和性20x2已建立的P印(+)P印(-)P印(+)P印(-)CTL1隆RNF43-331SY鄰PGRRL3肌02%1%0%0%RNF43'350HYHLPAAYL200.026%17%5%4%RNF43-639LFNLQKSSL30.042%33%7%5%RNF43-24GFGRTGLVL20.08%9%1%2%RNF43-247RYQASCRQA15.071%82%28%腦RNF43-397RAPGEQQEL14441%32%15%15%RNF43-114RAPRPCI^L12.023%26%6%9%RNF43-368RPPRPGPFL12.01%0%0%0%RNF43-45KAVI函PL12.0NERNF43-721NSQPVWLCL10.068%0%26%0%13NE:未建立CTL系用RNF43-350(HYHLPAAYL)(SEQIDNO:72),RNF43-639(LFNLQKSSL)(SEQIDNO:73)和RNF43-721(NSQPVWLCL)(SEQIDNO:80)刺激的CTL系對經肽脈沖的靶的細胞毒活性高于對未經任何肽脈沖的靶的細胞毒活性。由這些CTL開始，用RNF43-639建立了一個CTL克隆，用RNF43-721建立了13個CTL克隆。用RNF43-721刺激的CTL系對經肽脈沖的扭顯示出強有力的細胞毒活性，而對未經任何肽脈沖的靶未顯示出任何顯著的細胞毒活性(圖33)。表5顯示了通過4僉查用10聚體-肽(SEQIDNO:81-90)刺激的CTL系的細胞毒活性所獲得的結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>一步證實RNF43-721CTL克隆的特異性。將經"Cr標記的HT29細胞用作經標記靶，而將用RNF43-721脈沖的未經"Cr標記的TISI細胞用作未標記靶。當在試^r中以多個比例加入用RNF43-721脈沖的TISI時，針對HT29細胞的特異性細胞裂解被顯著抑制(圖36)。以E/T=20的比例將這些結果表示為特異性裂解的百分比。為了檢查針對RNF43肽產生的CTL克隆的特征，檢測了抗HLA-I類，HLA-II類，CD3,CD4和CD8的抗體抑制CTL克隆的細胞毒活性的能力。當使用抗-HLA-I類，CD3和CD8的抗體時，CTL克隆對WiDR細胞靶的細胞毒性受到顯著抑制(圖37)。該結果表明CTL克隆經由HLA-I類，CD3和CD8識別衍生自RNF43的肽。〖36)RNF43-721肽的同源性分析針對RNF43-721建立的CTL克隆顯示出很強的細胞毒活性。該結果表示RNF43-721的序列與其它已知可致敏人免疫系統的分子所衍生的肽同源。為了排除這種可能性，使用BLAST(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進行RNF43-721的同源性分析。在BLAST所列的分子中未發現與RNF43-721完全匹配或高度同源的序列(表6)。表6RNF43-721的同源性分析(BLASThttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)鑒定(9/9)0鑒定(8/9)0鑒定(7/9)0鑒定(6/9)2這些結果表明RKF43-721的序列是獨特的，用RNF43-721建立的CTL克隆對其它分子產生免疫應答的可能性很小。(37)修飾RNF43-721以改善表位呈遞的效力為了改善肽呈遞的效力，在錨位點上進行氨基酸改變以修飾RNF43-721肽。該修飾有望能改善肽與HLAI類分子的結合親和性。表7表明將第2位氨基酸(SEQIDNO:91和92)改變后，RNF43-721與HLA-A24分子的結合親和性較好。表7RNF43-721天然肽的修飾肽的預測結合能力序列NSQPVWLCLN踐PVWLCLNIQPVWLCL分值排位10.081050.403504.001*在HLA-A24限制性的9聚體肽中(38)推測衍生自RNF43的候選肽表8按高結合親和性次序顯示出候選肽(SEQIDNO:87和93-111)。表8RNF43:預測表位肽(HLA-AW201)編號起始序列分值編號起始序列分值位置位置160KLNLTLEGV274.31181KLMQSHPLYL1521.52QLAALWPWL199.712357YLLGPSRSAV1183.7382LMQSHPLYL144.213202LMTVVGTIFV469.643581XGPSRSAV118.2142卯CLHEFHRNCV285.1511ALWPWLLMA94.815500SLSSDFDPLV264.2615WLLMATLQA84.5168QLAAIWPWLL跳21711ALWPWLLMAT142.2"7200W謹TVVGT40.118了LQLAALWPWL127.38171KLMEFVYKN34.519726WLCLTPRQPL98.2962NLTLEGVFA27.320302WLHQHRTCPL98.210156GLTWPVVLI23.9總共選擇和檢查了下迷20個肽。(39)使用候選肽刺激T細胞按照"材料和方法"中所述的方法，使用這些衍生自RNF43的候選肽培養淋巴細胞。擴展所獲得的顯示出可測細胞毒活性的淋巴細胞,并建立CTL系。表9顯示出使用9聚體-肽(SEQIDNO:93-102)刺激誘導的CTL系的細胞毒活性。表9CTL系(HLA-A^2019聚體)的細月包毒性_起始AA結合細胞毒性(％)_位置序列親和性x20x2Pep(+)Pep(-)Pep(+)Pep(-)RNF43-60KLNLTLEGV274.3-2,10.2-1.60.0RNF43-8QLAALWPWL199.73.50.00.01.0RNF43-82I^QSHPLYL44.2.71.20.0-0.4RNF43-358LLGPSRSAV118.2-0.4-0.70.0-0.8RNF43-11ALWPWLLMA94.890.21.545,41.3RNF43-15WLLMATLQA84.5-0.20.0-0.4-0.9RNF43-200WILMTVVGT40.1未合成RNF43-171KLMEFVYKN34.52.60.0U-0.5RNF43-62NLTLEGVFA27.3未合成RNF43-156GLTWPVVLI23.9-0.40.7-0.5-0.3NE:未建立CTL系用RNF43-ll-9(ALWPWLLMA)(SEQIDNO:97)誘導的CTL系對經肽脈沖的耙的細胞毒活性高于對未經任何肽脈沖的草巴的細胞毒活性。由這些CTL開始，用RNF43-ll-9建立了4個CTL克隆。用RNF43-ll-9刺激的CTL系對經肽脈沖的靶顯示出強有力的細胞毒活性，而對未經任何肽脈沖的靶未顯示出任何顯著的細胞毒活性(圖38A)。表IO顯示了通過檢查用IO聚體-肽(SEQIDNO:87和103-111)誘導的CTL系的細胞毒活性所獲得的結果。表10CTL系(HLA-AW201IO聚體)的細胞毒性起始位置AA序列結合親和性細胞毒性(％):20p印(+)p印(-)p印(+)p印(-)RNF43-81RNF43-357RNF43-202RNF43-2卯RNF43-500RNF43-8RNF43-11KLMQSHPLYL1521.5YLLGPSRSAV1183.7LMTVVGTIFV469.6CLHEFHRNCV285.1SLSSDFDPLV264.2QLAA酵WLL160.2ALWPWLLMAT142.218.027.66.38.318.215.43.73.0未合成9.69.72.73.'NE6.79.0U1.39.527.140.54.3RNF43-7LQLAALWPWL127.3RNF43-726WLCLTPRQPL98.2RNF43-302WLHQHRTCPL98.27.4NENE6.11.52.2NE:未建立CTL系用RNF43-ll-l6^ALWPWLLMAT)(SEQIDNO:108)i秀導的CTL系對經肽脈沖的靶的細胞毒活性高于對未經任何肽脈沖的靶的細胞毒活性(圖38B)。(40)建立CTL克隆使用有限稀釋法由上述CTL系增殖CTL克隆。建立了4個針對RNP43-ll-9的CTL克隆(見上文的表9)。圖39A和39B顯示了RNF43肽-衍生的CTL克隆的細胞毒活性。每個CTL克隆對經肽脈沖的靶具有很強的細胞毒活性，而對未經任何肽脈沖的靶未顯示出任何細胞毒活性。(41)針對內源性表達RNF43以作為靶的結腸癌細胞系的細胞毒活性檢查針對推測肽產生的CTL克隆識別并殺死內源性表達RNF43的腫瘤細胞的能力。圖40A和40B顯示出針對RKF43衍生肽產生的CTL克隆的結果。該CTL克隆對表達RNF43和HLA-A*0201的DLD-1顯示出強有力的細胞毒活性，但對表達RNF43但不表達HLA-A*0201的HT29未顯示出任何細胞毒活性。(42)CTL克隆的特異性進行未標記靶的抑制試驗以進一步證實RNF43-5-ll(9聚體)CTL克隆的特異性。將經"Cr標記的HCT116細胞用作經標記耙，而將用RKF43-5116細胞靶的特異性細胞裂解被顯著抑制(圖41)。工業實用性與非癌胃組織相比，新的人基因COD/^7和GCt/D/在胃癌中的表達顯著提高。另一方面，與非癌粘膜組織相比，新的人基因RNF43在結腸癌細胞中的表達顯著提高。因此，這些基因可用作癌癥的"^斷標記，由它們編碼的蛋白質可用于癌癥診斷試驗。本發明人還證實新蛋'白質CXADRL1,GCUD1或RNF43的表達能促進細胞生長，而通過與CX4D^L7，GC77A^戈iWFW基因相對應的反義寡核苷酸或小的干擾RNA可抑制細胞生長。這些發現暗示CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白中的每一種都能刺激致癌活性。因此，這些新的癌癥蛋白質中的每一種都是對開發抗癌藥物有用的靶。例如，能阻斷CXADRLl,GCUD1或RNF43表達或抑制其活性的藥劑具有作為抗-癌藥劑，特別是治療胃癌和結腸癌的抗-癌藥劑的治療用途。所述藥劑的例子包括反義寡核苷酸、小的干擾RNA和能識別CXADRL1,GCUD1或RNF43的抗體。另外，本發明人還證實了CXADRL1能與AIP1相互作用。CXADRL1與AIP1的結合有望調節CXADRL1的細胞增殖活性。因此，能抑制由CXADRL1與AIP1組成的復合物形成的藥劑可用于治療和預防癌癥，尤其是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。或者，本發明人還證實了RNF43能與N0TCH2或STRIN相互作用。RNF43與NOTCH2或STRIN的結合有望調節RNF43的細胞增殖活性。因此，能抑制由RNF43與NOTCH2或STRIN組成的復合物形成的藥劑可用于治療和預防癌癥，尤其是結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。盡管根據本發明的具體實施方案詳細描述了本發明，但本發明的多種變化和修飾對于本領域技術人員而言是顯而易見的，并不背離本發明的精神和范圍。序列表<110〉腫瘤療法科學股份有限公司(0NC0THERAPY國立大學法人東京大學(THEUNIVERSITYSCIENCE,INC.)OFTOKYO)<120>與人結腸癌相關的基因和多肽<130>0NC-A0203Y2P<150〉<151>US60/386,9852002-06-06<150><151>US60/415,2092002-09-30<150><151>US60/451,0132003-02-28<160>194<170>PatentInversion3.1<210><211〉<212><213>13423DNA人(Homosapiens)<220><221><222><223〉CDS(238)..(1533)<400〉1gctggcgagcccggaacgcctctggtcacagctcagcgtccgcggagccgggcggcgctg60gagctgcacttggctcgtctgtgggtctgacagtcccagctctgcgcggggaacagcggc120ccggagctgggtgtgggaggaccaggctgccccaagagcgcggagactcacgcccgctcc180tCtCCtgUgCg3CCggg3gCCgggUgg3ggC3ggCgCgctccctgcggccccggg237atgacttctcagcgtteccctctggcgcctttgctgetcetctctc.tg285MetThrSerGinArgSerProLeuXlaProLeuLeuLeuLeuSerLeu151015cacggtgttgcagcatecctggaagtgteagagagecctgggagtate333HisG!yValAlaAlaSerLeuGluValSerGluSerProGlySerlie202530caggtggcceggggtcagccagcagtcctgccctgcactUcactacc381GinValAlaArgGlyGinProAlaValLeuProCysThrPheThrThr354045agegetgccetca"aacetcaatgtcatttggatggtcactcctetc429SerAlaAlaLeulieAsnLeuAsnVallieTrpMetValThrProLeu505560tecaatgccaaccaacctgaacaggtcatectgtatcagggtggacag477SerAsnAlaAsnGinProGluGinVallieLeuTyrGinGlyGlyGin65707580atgtttgatggtgccccceggUccacggtagggUggatttacaggc525MetPheAspGlyAlaProArgPheHisGlyArgValGlyPheThrGly859095accatgccagetaccaatgtctctateUcattaataacactcagUa573ThrMetProAlaThrAsnValSerliePhelieAsnAsnThrGinLeu100105110<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>ProArgProProHis400actcattectacaccateagecacgcaacactgThrHisSerTyrThrlieSerHisXlaThrLeu405410gaacgaattggtgcaGluArglieGlyAla4151485gUcctgtcatggtaccagcccagagtegggccValProValMetValProAlaGinSerArgAla420425gggtecttggUtagGlySerLeuVal4301533gacatgaggaaatgttgtgttcagaaatgaataaatggaatgccctcatagggggag1593ggtggggtggggagtgctgggaaagaaacacttcctutataaaatgeae1653a汪汪gaagaaggcagtgctgttacttggecaCU柳tgtgUaaatgg汪ctgaa"gctc1713catcatgaagacttgcUccccaccaaa^tgtcctgggauctgctggatctcaaagat1773gtgccaagccaaggaaaaagatacaagagcagaatagtacUaaaatccaaactgccgcc1833tgttcUcatgectaacttaagagattaaagtgccag"g1893gagtttaaatattgaaatUttttaaaaggtaggtgtcttacaagcaacc1953ctgtgaUtgttccgtctctccca"tccctcgttaUUgagggcttMtggtataaat2013ggtcccaacagggctgactcttctatcataUatcaaaactttttacatg2073agcaaaattcagtaagaaataaagga^iacgtctttgagaagccccttcat2133atttatttatttatctcttcaatttcatatgtggaatattgctatattga2193cagattcttgcctgtctgtgtUUcUgg"ctgtUcaggtccatggcaattactgU2253UttttUcctggaaaaataUUUUtaaaaggcttutttutmt2313gaggcattgggcUagaaagaaaagactgttgUtaaUccttgttcaatggttgUttt2373tagaggtccatcatatcatgaccgagctaggttgtgtgggcaggaaggta2433gggcuaggggttgUgccttgctgggcagcctctcagagcaaggttgttcagatctccc2493UgctattacsgtaggmctatUatgagggcagc汪cctg"gcctUtgtdctgaggt2553atgtaactttctccttatttgacaagUgacttgtcagggagggcagacg2613UtUUgttctgtUcgtttttcaaaataatgcUtUgcaaaagaggtaagactgaga2673ct,ggtgttatcttctggtgtgctcctggaagtgtcuccctacatttgtgtcagctc2733鄉gttgC3gtgUgcccagatgeatUUcatcactgU33g卿tUCttttgtggtt2793acUcctggcttggctggccUgcggUcaccagatuatttacaaactcccccacttta2853ttttgtgctatgtagatctggecatacttgcattagtgactgtcttgecttaaccacact2913UagcaacccacaaatUcttctc，UtgtttccUgattacUatgatactcatccc2973atgtctcaataagagtgtcttttctttctggatgtgttctctUctccctctUccacca3033tactttttgctctcttctcctgcaagcgtagtcttcacagggagtggcttcctgacattt3093UUcagttatggaaaccaacagctgctgcaaacactgttUtccaagaa3153ggctacactcagaacctaaccattgccaaccatttcagtaUgaUaaaagctgaattta3213ctttagcattacttaUtttttttccatttgatggttcttactttgUaaaatUaaata3273aatgaatgtctatactUUataaagaasagtgaaaataccatgacactgaasag3tg3t3333gctatcagatgctgtttagaaagcatttatcttgcatUcUtattctttctaattatct3393aaaattcaataaaattttattcatataaaa3423<210>2<211>431<212>PRT<213>人(Homo<400>2MetThrSerHisGlyValGinValAla35SerAlaAla50SerAsnAla65MetPheAspThrMetProSerAspThr115GlyGlyArg130SerAlaPro145VallieLeuLeuTrpGluGinAspGin195SerSerGly210ThrCysLeu225GlyLeulieCyslieAlaLysGluGlu275LeuProProGinAla20ArgLeuAsnGlyAla100GlyAsnHisLeuLys180ValLeuLeuAlaLeu260Glu乙yssapiens)SerProSerGinArg5AlaGlylieGinAla85ThrThrlieCysCys165LeuGinTyrAspGly245lieGluCysLeuProAsnPro70ProAsnTyrGlyGin150SerAspGlyGinLeu230AlaLeuGluSerLeu55GluArgValGinVal135lieSerAsnThrCys215LeuAlaPro乙euLeuLeuLeuSerLeu1015GluValSerGluSerProGlySerlie2530AlaValLeuProCysThrPheThrThr4045AsnVallieTrpMetValThrProLeu60GinVallieLeuTyrGinGlyGlyGin7580PheHisGlyArgValGlyPheThrGly9095SerliePhelieAsnAsnThrGinLeu105110CysIxuValAsnAsnLeuProAsplie120125ThrGlyLeuThrValLeuValProPro140GinGlySerGinAsplieGlySerAsp155160GluGluGlylieProArgProThrTyr170175ThrLeuLysLeuProProThrAlaThr185190VglThrlieArgAsnlieSerAlaLeu2602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400>158LeuLeuGlyMetAspLeuValArgLeu15<210>159<211〉9<212〉PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>159PheliePheValAspAspValLysLeu15<210〉160<211>9<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>160ValCyslieAspSerGluPhePheLeu15<210〉161<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>161LysProPheliePheValAspAspVal15<210>162<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉162lieValAspArgAspGluAlaTrpVal15123<210><211〉<212〉<213>1639PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>163ThrLeuArgAspLysAlaSerGlyVal15<210><211><212><213>1649PRT人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400〉164LysMetAspAlaGluHisProGluLeu15<210><211><212><213>1659PRT人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>165AlaLeuAspVallieValSerIxuLeu15<210〉<211〉<212><213>1669PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>166TyrAlaGinSerGinGlyTrpTrpThr15<210><211><212><213〉1679PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>167LysLeuArgSerThrMetLeuGluLeu15<210>168<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>168TyrLeulieValAspArgAspGluAla15<210><211><212><213>1699PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>169AlaAlaProProSerTyrCysPheVal15<210><211><212〉<213>1709PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400〉170GlyMetAspLeuValArgLeuGlyLeu15<210><211〉<212><213>1719PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>171LysValThrGluGlyValArgCyslie15<210><211><212><213〉1729PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>172CyslieAspSerGluPhePheLeuThr15<210〉173<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>173ThrValGinThrMetMetAsnThrLeu15<210>174<211〉9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉174GluMetGlyAlaAsnGluHisGlyVal15<210>175<211〉10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉175PheliePheValAspAspValLysLeuVal1510<210〉176<211〉10<212〉PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>176LeulieValAspArgAspGluAlaTrpVal1510<210>177<211〉10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>177PheLeuThrThrAlaSerGlyValSerVal1510<210〉178<211>10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉178ThrMetLeuGluLeuGluLysGinGlyLeu10<210><211><212><213>17910PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>179AlaLeuLeuGlyMetAspLeuValArgLeu1510<210><211〉<212><213>18010PRT人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400〉180AlalieMetlieSerArgProAlaTrpLeu1510<210><211><212><213>18110PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>181GlyValCyslieAspSerGluPhePheLeu1510<210>182<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400>182LysLeuValProLysThr'15<210>183<211>10<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>183PheAsnPheSerGluVal15<210>1841010127<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉184TyrlieSerlieAspGinValProArgThr1510<210>185<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>185GlyGluGlyGluPheAsnPheSerGluVal1510<210〉186<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400〉186TrpAlaAlaGluLysValThrGluGlyVal1510<210>187<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>187ValLeuProGinAsnArgSerSerProCys1510<210>188<211〉10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>188AlaAlaAlaProProSerTyrCysPheVal<210><211><212><213>18910PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>189ThrMetMetAsnThrLeuArgAspLysAla1510<210>190<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>190GluValGlyAspLeuPheTyrAspCysVal1510<210>191<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>191AlaGluMetGlyAlaAsnGluHisGlyVal1510<210>192<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>192GlyLeuValValPheGlyLysAsnSerAla1510<210>193<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>193GinLeuSerLeuThrThrLysMetAspAla1510<210>194<211>10<212>PRT<213〉人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>194ArgSerliePheLysProPheliePheVal1510權利要求1.選自下列的基本上純的多肽(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO2，4或6；(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO2，4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO2，4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由SEQIDNO2，4或6中任一氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。2.分離的多核苷酸，其編碼權利要求l的多肽。3.載體，其含有權利要求2的多核苷酸。4.宿主細胞，其攜有權利要求2的多核苷酸或權利要求3的載體。5.產生權利要求l的多肽的方法，所述方法包括下述步驟(a)培養權利要求4的宿主細胞；(b)使宿主細胞表達所述多肽；和(c)收集所表達的多肽。6.抗體，其與權利要求l的多肽結合。7.多核苷酸，它與權利要求2的多核苷酸或其互補鏈互補，并且含有至少15個核苷酸。8.反義多核苷酸或小的干擾RNA,其針對權利要求2的多核苷酸。9.權利要求8的反義多核苷酸，其選自含有核苷酸序列SEQIDNO:23:25,27,29或31的核香酸。10.權利要求8的小的干擾RNA，其有義鏈選自含有核苷酸序列SEQIDNO:112，113和114的核苷酸。11.診斷細胞增殖性疾病的方法，所述方法包括下述步驟(a)檢測樣本的生物樣品中編碼氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6的基因的表達水平；和(b)將對表達水平的評價與疾病相關聯。12.權利要求ll的方法，其用選自下列的任一種方法檢測表達水平(a)檢測編碼氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6的mRNA;(b)檢測含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6的蛋白質；和(c)檢測含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6的蛋白質的生物活性。13.篩選治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)使受試化合物與選自下列的多肽接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6;(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測所述多肽與受試化合物之間的結合活性；和(c)選擇與所述多肽結合的化合物。14.篩選治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)使候選化合物與表達一或多種由核香酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸的細胞接觸；和(b)選擇與缺乏受試化合物時檢測到的表達水平相比，能降低一或多種由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苦酸的表達水平的化合物。15.篩選治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)使受試化合物與選自下列的多肽接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(2)多肽，其含有氨基S臾序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選擇與缺乏受試化合物時檢測到的生物活性相比，能抑制所述多肽生物活性的化合物。16.權利要求15的方法，其中生物活性是細胞-增殖活性。17.篩選治療細J包增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)在受試化合物的存在下，使選自下列的多肽與AIP1接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2;(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的蛋白質等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:l組成的多核香酸雜交的多核芬酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的多肽等同的生物活性；(b)沖企測所述多肽與AIPl之間的結合；和(c)選擇能抑制所述多肽與AIP1之間的結合的受試化合物。18.篩選治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)在受試化合物存在的條件下，使選自下列的多肽與NOTCH2或ST麗接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:6;(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:6組成的蛋白質等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:6組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測多肽與NOTCH2或STRIN之間的結合；和(c)選擇能抑制多肽與NOTCH2或STRIN之間的結合的受試化合物。19.篩選治療細胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟a)使候選化合物與已導入載體的細胞接觸，所述載體含有一或多種標記基因的轉錄調節區和在轉錄調節區控制之下表達的報道基因，其中一或多種標記基因含有選自SEQIDNO:1,3或5任一的核苷酸序列，b)測定所述報道基因的活性；和c)選擇與對照相比能降低所述報道基因的表達水平的化合物。20.權利要求11至19中任一項的方法，其中細胞-增殖性疾病是癌癥。21.治療細胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針對編碼選自下列之多肽的多核苷酸的反義多核苦酸或小干擾RNA作為活性成分并含有可藥用載體(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苦酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。22.治療細胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的抗選自下列之多肽的抗體作為活性成分并含有可藥用載體(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。23.治療細胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的通過權利要求13至19任一方法選擇的化合物作為活性成分并含有可藥用載體。24.權利要求21至23之一的組合物，其中細胞增殖性疾病是癌癥。25.治療細胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的針對編碼選自下列之多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。26.治療細胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的抗選自下列之多肽的抗體的步驟(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2^或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。27.治療細胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的通過權利要求13至19中任一項的方法選擇的化合物的步驟。28.權利要求25至27中任一項的組合物，其中細胞增殖性疾病是癌癥。29.治療或預防癌癥的方法，所述方法包括施用藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核普酸的步驟(a)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，所述多肽由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苦酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的多肽等同的生物活性。30.權利要求29的治療或預防癌癥的方法，其中所述多肽選自含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97，108,124和164的多肽。31.誘導抗腫瘤免疫力的方法，所述方法包括，使選自(a)-(c)的多肽與抗原呈遞細胞接觸，或將編碼所述多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的載體導入抗原呈遞細胞的步驟(a)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNQ:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苦酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。32.權利要求31的誘導抗腫瘤免疫力的方法，其中所述多肽選自含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97,108,124和164的多肽。33.權利要求31的誘導抗腫瘤免疫力的方法，其中所述方法還包括給受試者施用抗原呈遞細胞的步驟。34.治療或預防癌癥的藥物組合物，所述組合物含有藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸作為活性成分并含有可藥用載體(a)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6;(b)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個或多個氨基酸^^取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，其由能在嚴緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的多肽等同的生物活性。35.權利要求33的藥物組合物，其含有藥物有效量的含有選自氨基酸序列SEQIDNO:80,97，108,124和164的多肽。36.權利要求34的藥物組合物，其中多核普酸被摻入表達載體。全文摘要本申請提供了新的人基因RNF43，該基因在結腸癌中的表達顯著提高，本申請還提供了新的人基因CXADRL1和GCUD1，與相應的非-癌組織相比，所述基因在胃癌中的表達顯著提高。所述基因和由其編碼的多肽可用于例如診斷細胞增殖性疾病，并用作開發針對所述疾病的藥物的靶分子。文檔編號C12N15/12GK101613405SQ20091016516公開日2009年12月30日申請日期2003年6月3日優先權日2002年6月6日發明者中村佑輔,古川洋一,田原秀晃,角田卓也申請人:腫瘤療法科學股份有限公司