專利名稱：：診斷沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體感染的熒光pcr方法
技術領域：
：本發明是一種在臨床樣品中同時檢測沙眼衣原體(CT)、淋球菌(NG)及解脲支原體(UU)感染的熒光聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法。屬于體外核酸診斷領域。
背景技術：
：性傳播疾病(STD)是一組全球性傳染病，主要通過性接觸傳播，部分STD則可通過非性接觸傳播，比如通過共用針頭、哺乳甚至接觸傳播。目前STD在我國的發病率呈不斷上升的趨勢，由淋球菌(/fei^ei^ag朋0r2^0eae，NG)、沙眼衣原體(aJa77yo7atracAo/za"&CT)和解脲支原體(te^s/^gs邁aur朋/,"c咖，UU)三種病原體引起的泌尿生殖道感染(淋病和非淋球菌性尿道炎)已成為醫院婦科、皮膚性病科、泌尿生殖科的常見疾病，為我國重點防治的對象。而由于CT、NG和UU之間存在混合感染，故對泌尿生殖系統感染的病人最好能同時檢測這三種病原體，以利于診斷和治療。因此，開發能準確、迅速、簡便及廉價而又能同時檢測這3種病原體的方法有著顯著的臨床意義。熒光PCR檢測技術融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，是目前臨床檢驗中認同程度很高的一種檢測技術，已廣泛應用于科學研究和臨床。但多重熒光PCR技術由于其技術難度在臨床上的應用則方興未艾。本項目開發的STDCT/NG/UU三聯核酸檢測試劑盒，采用多重熒光PCR技術，能在同一PCR反應管中同時檢測并鑒定CT、NG和UU。該產品對樣本需要量少、成本低、操作簡便、檢驗效率高，是目前國內外檢測CT、NG和UU的唯一多重熒光PCR核酸檢測試劑，不僅適合各種研究機構實驗室研究和醫院臨床診斷使用，而且也可為流行病學調査、人群健康普査及檢驗檢疫、STD病患者的早期治療及控制等方面提供快速準確的檢驗參考依據，具有極大的社會和經濟意義。
發明內容本發明特別涉及一種利用多重熒光PCR技術在一個PCR反應管中快速、平行地同時檢測CT/NG/UU三種基因型的診斷方法。一般PCR僅采用一對引物,通過PCR擴增產生一個核酸片段。本發明則采用多重PCR法(MultiplexPCR，多重核酸擴增法)，即在同一PCR反應體系里加上二對以上的引物，各對引物對各自特異的靶序列同時擴±曾的PCR反應(PhillipS.Bernard,Real—timePCRTechnologyforCancerDiagnostics.ClinicalChemistry.2002;48:1178-1185.)。其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同。本發明的反應3體系中包含3條TaqManMGB探針(TaqManMGB探針相對于普通TaqMan探針可以設計得更短，不但有有效地降低了合成成本，也使得設計的成功率大為提高。此外，TaqManMGB探針提高配對與非配對序列間Tm值的差異，有利于進行更多重的PCR)和3條上游引物，3條下游引物，分別針對CT/NG/UU的DNA耙序列。能在同一反應管內同時檢出CT/NG/UU三種病原體，可大大節省時間，降低成本，為臨床提供更多更準確的診斷信息，更貼近臨床檢測需求。由于需要同吋擴增3種不同的DNA靶序列，體系中需要添加9條引物和探針，系統的復雜性(由此導致大量引物二聚體的產生)將大大降低PCR的效率，因而需要在保證特異性的前提下盡可能降低系統的復雜程度。具體方法如下使用軟件PrimerExpress3.0，針對CT/NG/加的保守區域(NG引物設計在16sr柳A基因上；CT引物設計在內源性質粒序列上；UU引物設計在Urease基因上)。具體實施方法1.引物和探針設計(見核苷酸或氨基酸序列表與表l)與合成引物和探針均委托專業公司合成，其中引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。探針5'端標記報告基團，3'端結合淬滅基團。表1.核苷酸或氨基酸序列表中對應擴增產物之靶序列基因庫編號和位置<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>2.質粒參考品的制備使用特異性引物擴增靶序列，將經過純化的PCR產物連接至pGEM-T載體十.(PromegapGEM-Tvectorsystem連接試劑盒)，然后轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，通過藍白斑篩選，分別構建CT/NG/UU三種重組質粒DNA作為靈敏度參考品，構建的重組質粒經雙向DNA測序鑒定。3.樣本釆集男性男性尿道炎急性期患者以常規消毒棉簽取膿性分泌物，非急性期以棉簽輕輕插入尿道24cm深處，轉動取出。男性取尿道分泌物前可12小時禁尿，以晨間首次排尿前取樣陽性率高。有前列腺癥狀者可取前列腺按摩液。精液標本同普通取樣。女性成年女性患者先用無菌試紙擦去宮頸口分泌物，再用另一試紙或消毒棉桿插入宮頸內l-2cin處停留約數秒后輕輕旋轉取出分泌物。嬰幼女取外陰膿性分泌物。患結膜炎的新生兒取結膜分泌物。體液和其他分泌物體液標本包括胸水、腹水、腦脊液、尿液等，可直接離心或加生理鹽水后離心取沉淀物提取核酸。咽部感染者，從鼻咽部或扁桃腺窩內取材。播散性淋病可取血液、關節液或心包液等。此類標本由臨床醫生按照需要采集。將從患者不同部位取樣后的棉拭子等放入含1mL無菌生理鹽水的無菌離心管內震蕩洗滌片刻，在壁上擠干后丟棄棉拭子。蓋緊離心管后，密閉送檢。或者冰箱保存備，在4"C保存不超過24小時，用-2(TC保存不超過6個月或-7(TC長期保存。運輸采用加冰密封運輸。如果是水樣標本則直接密閉送檢或保存。4.標本處理及DNA提取將置于離心管中的液體標本或經生理鹽水處理過的標本，12000rpm/min離心10min。盡可能吸去上清后，沉淀加核酸提取液50uL，充分振蕩混勻，快速離心后100度干浴或沸水浴10min。12000rpm/min離心2min，取上清液2uL加入PCR反應管進行PCR反應。如果不立刻進行PCR反應，則將核酸提取液處理過的標本液置于-2(TC保存，下次PCR反應之前應振蕩離心處理。5.對照品選擇使用人基因組DNA(30ug/ml)為陰性對照；CT/NG/UU混合重組質粒(各2.OX105copies/u1)為強陽性對照；CT/NG/UU混合重組質粒(各2.0X103copies/u1)為臨界陽性對照。6.PCR反應組成按下表(表2)配制PCR反應液并加入DNA模板(每次試驗必須包含陰性、臨界陽性及強陽性對照)。配制配制完畢稍作混勻并離心后上機反應。表2.PCR反應組成<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>7.反應程序設定設置收集FAM/VIC/ROX熒光信號的熒光檢測通道，將反應管放入熒光PCR儀開始擴增，反應程序如下(以ABI7000為例):表3.PCR程序設定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>8.結果判斷對ABI7000，基線范圍為6-15循環或由軟件自動選擇(Autobaseline),設定閾值(threshold)使之超過無規則擴增曲線的最高值。9.質控標準(表4)表4.質控品標準檢測結果(以ABI7000為例)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>說明l-3項中有一項不符，則本次實驗無效10.結果報告(表5)表5.報告樣本檢測結果(以ABI7000為例)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>11.本方法主要適用于(1)檢測CT/NG/UU等導致的泌尿生殖道感染的病原體(2)泌尿生殖道感染患者的隨訪。檢測結果應與其它診斷學方法獲得的臨床信息及適當的身體檢查結合使用。診斷沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體感染的熒光PCR方法.ST25SEQUENCELISTING<110>港龍生物科技有限公司〈120〉診斷沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體感染的熒光PCR方法<130>1<160〉9<170〉Patentlnversion3.20>11〉182〉■3〉Artificial0〉3〉CT探針<400>1aaagatatgga,caaatcg18<210〉2<211〉23〈212〉DNA<213〉Artificial<220〉<223〉NG探針<400>2cgggtctgagaggatgatccgcc23<210〉3<211〉19<212〉DNA<213〉Artificial<220〉<223〉UU探針<400〉3agagaagcaaaagtaatca19<210>4〈211〉24<212〉DNA<213〉Artificial<220〉〈223〉CT正向引物<400>4gttgttaacaggatagcacgctcg24II11111-1-22222222<<<<<<診斷沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體感染的熒光PCR方法.ST25〈210〉5〈211〉23〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉CT反向引物〈400〉5gccttccctttatacgctcaage23〈210〉6〈211〉19〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉<223>NG正向引物〈400〉6cttctcgggtggcgagtgg19〈210〉7<211〉23〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉NG反向引物〈400〉7ccagtaattcegattaaegetcg23〈210〉8〈211〉24<212〉DNA〈213>Artificial〈220〉<223〉UU正向引物〈400〉8ctgtcgctttaattactgaccacg24〈210〉9〈211〉25〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220>〈223〉UU反向引物8診斷沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體感染的熒光PCR方法.ST25〈400〉9ctttacgttctttgtcttcgtttcc2權利要求1.一種診斷沙眼衣原體(CT)、淋球菌(NG)及解脲支原體(UU)感染的熒光PCR方法，包括以下部分(1)與CT/NG/UUDNA互補的寡核苷酸序列用于PCR擴增臨床樣品中獲得DNA的引物；在這里，引物序列包含(a)一個能與CT基因對應的靶序列上游第一個位點雜交的正向引物；(b)一個能與CT基因對應的靶序列下游第二個位點雜交的反向引物；(c)一個能與NG基因對應的靶序列上游第一個位點雜交的正向引物；(d)一個能與NG基因對應的靶序列下游第二個位點雜交的反向引物；(e)一個能與UU基因對應的靶序列上游第一個位點雜交的正向引物；(f)一個能與UU基因對應的靶序列下游第二個位點雜交的反向引物；(g)正向引物和反向引物不限于本說明書序列表明的序列。(2)用于檢測CT/NG/UU的熒光標記一個或多個寡核苷酸序列探針，該探針能與位于靶序列中上述第一和第二個位點雜交之間的序列雜交。探針序列可以是SEQIDNo.1-3的序列或其互補序列。還可包括由所列序列或其互補序列衍生出來的差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列。(3)對取得的樣品進行了PCR擴增，其特征在于包括一對或多對引物及探針，以CT、NG或UUDNA作為模板，一個反應體系中擴增一個或多個DNA目標靶序列片段。通過檢測PCR反應體系中一個或多個不同熒光信號的變化，確定樣品中是否感染CT、NG、UU或混合感染，以及其含量。2.根據權利要求1所述的熒光檢測，其特征在于所述用于多重檢測的熒光探針為TaqMan或MolecularBacon探針，標記探針5'端的為一種熒光報告基團(包括但不限于以下幾種FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreen、CALRed、Red640、TexasRed),3'端為一種熒光淬滅基團(包括但不限T以下幾種TAMRA、DABCYL、ECLIPSE、NFQ)，探針的3'端可以是帶有DNA小溝復合物(MGB，MinorGrooveBinder)修飾。3.根據權利2要求所述的反應體系中，可使用一個或多個熒光探針，所標記的熒光報告基團可以為一種或多種。全文摘要本發明涉及一種用于診斷沙眼衣原體(CT)、淋球菌(NG)及解脲支原體(UU)感染的熒光PCR(聚合酶鏈式反應)檢測方法，屬于體外核酸診斷領域。本發明包括一個以熒光PCR技術為基礎的多重聚合酶鏈式反應(PCR)體系，包含針對CT/NG/UU的正、反向引物和熒光探針，在適合的PCR條件下可在一個反應管中同時檢測CT/NG/UU等3種病原體的DNA。本發明可以簡便快速地在臨床樣品中診斷診斷CT/NG/UU感染，靈敏度高，特異性強，對相關的泌尿生殖道感染的早期防治、阻斷傳染源、減少相關病原體的感染均有重要的臨床價值。文檔編號C12Q1/68GK101613763SQ20091016497公開日2009年12月30日申請日期2009年7月30日優先權日2009年7月30日發明者傅華陽,曾志雄,楊夢甦申請人:港龍生物科技有限公司