專利名稱：：兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法
技術領域：
：本發明屬于發酵工程
技術領域：
，具體涉及一種兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法。
背景技術：
：聚羥基烷酸酯具有生物可降解性、生物可再生性、生物相容性以及降解產物無毒性等優良特性，使得它可以被用作藥物緩釋載體、外科手術縫合線、人工血管、人工膀胱、人工心瓣膜等材質及其相關的應用。但所用的聚羥基烷酸酯大多都是聚羥基丁酸或羥基丁酸與羥基戊酸的共聚物，其中都不含有像苯基這樣的功能團。近來，臨床醫學研究表明含苯基功能團的有機物苯乙酸和苯丁酸等具有抗腫瘤、鎮痛和化學預防治療等功能。如果將苯基功能團引入生物高分子聚合材料一一聚羥基烷酸酯中，合成出具有優良物理化學和機械性能的聚羥基苯烷酸酯，利用它在降解過程中緩慢釋放出含苯基功能團的有機酸如苯乙酸、苯丁酸等的特點，從而使生物可降解醫用材料聚羥基烷酸酯在使用過程中具有抗腫瘤、鎮痛等新的醫學作用，可為擴大該類生物高分子材料在醫學方面的應用奠定良好的基礎。目前，關于利用發酵法合成聚羥基丁酸酯(PHB)的濃度可達到每升140克，合成的羥基丁酸和羥基戊酸共聚物的濃度能達到每升5090克左右，國內已經實現了規模化大生產。但是利用微生物以含苯有機物(如苯戊酸、苯乳酸等)為碳源合成含有苯基功能團的聚羥基烷酸酯時，由于通常微生物代謝含苯有機物的速率較低，而且有機物碳源對細胞生長有明顯抑制作用等原因，使得最終得到的細胞濃度(小于每升2克)和產物濃度(小于每升1克)都很低，失去了工業化大生產的前景。
發明內容本發明針對現有技術的上述不足，提供一種微生物代謝含苯有機物的速率較高，而且有機物碳源對細胞生長抑制作用小，從而使得最終得到的細胞濃度和產物濃度都較高的兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法。為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，分兩階段完成，第一階段首先在發酵培養基中加入不大于0.3g/L的含苯有機物和520g/L的糖作為碳源，然后接入惡臭假單胞菌種子液于發酵培養基中后在發酵罐中進行發酵培養，以lvvm的流量將無菌空氣連續通入攪拌釜式發酵罐內，控制發酵罐的攪拌轉速為150800轉/分鐘，發酵溫度30±21:，溶解氧濃度高于20%(通過調節攪拌轉速使溶解氧濃度高于20%，以同溫同壓下空氣中的氧在發酵液中的飽和溶解度值為100%為參照)；并利用氨水調節pH為7.0±0.3(如果不用氨水而用氫氧化鈉溶液來調節pH值時，在發酵過程中需要補給一定量的氮源如硫酸銨，以保證發酵過程中微生物對氮的需求量)；發酵過程中利用在線信號(如溶氧濃度、pH、在線糖濃度分析儀等)判斷發酵過程中碳源(糖和苯戊酸等)的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源；(2)第二階段當微生物細胞吸光密度達到30(600nm波長下的測量值)后，利用不含氮的堿性溶液來調節PH值，并停止補加氨水和其它含氮物質，使發酵液中的氮含量逐漸降低至O.001mol/L，造成發酵液中氮源供給不足實現氮限制；同時，適當降低發酵罐的攪拌轉速使發酵液中溶解氧濃度低于10%，使氧的供給速率小于細胞正常生長代謝所需值形成氧限制，從而同時實施氮限制和氧限制，并隨時監控溶解氧濃度和PH值的變化，當二者的值同時迅速上升時，流加碳源，微生物就會將發酵液中的碳源通過微生物代謝合成轉化為聚羥基苯烷酸酯。上述兩個階段的發酵溫度和pH值都控制一樣。總發酵培養時間在表4中給出了，至于第一階段的發酵時間沒有明確給出，但要求微生物細胞吸光密度達到30后進入第二階段，給出總發酵培養時間就可以了。上述的發酵培養基組成和配比及微量元素溶液的組成見表1。上述所述的含苯有機物為苯戊酸、苯乳酸。上述所述的糖為葡萄糖、蔗糖等。本發明的優點和有益效果如下1.第一階段，在發酵過程中補給充足的各種微生物生長代謝所需要的營養物，并使發酵液中苯戊酸的濃度維持在很低值(小于等于0.3g/L)，這樣微生物可以充分生長，提高細胞濃度；同時低濃度的苯戊酸為微生物提供了一個適應含苯戊酸發酵液的環境，以免第二階段流加苯戊酸時導致微生物生長代謝速率大幅度減緩。在第二階段，同時實施了氮限制和氧限制，可以更好地促進微生物將碳源轉化為聚羥基苯烷酸酯。采用這一技術工藝，可以實現高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的目的，最終發酵液中干細胞濃度可以達到35.3g/L，產物聚羥基苯烷酸酯的濃度達到12.3g/L，而且聚羥基苯烷酸酯的組成會隨著第一階段和第二階段補給碳源的配比的不同而不同。2.本發明通過兩階段流加式補料策略，有效地克服含苯有機物對細胞代謝生長的抑制作用，實現高密度發酵，通過增加細胞密度，提高了含苯有機物的消耗速率，從而提高了聚羥基苯烷酸酯的生產率。具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明不僅僅局限于以下實施例以惡臭假單胞菌PseudomonasputidaKT2442(源于韓國科學技術院生物化學工程實驗室)的分段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯為例，說明本發明的具體實施方式。實施例1以表3中所述的兩步分批流加補料發酵方案中的補料方案1實施，具體過程如下(1)第一階段配制1.4L基本發酵培養基(其組成見表1)，接入100mL惡臭假單胞菌的種子液(液體種子發酵培養基中蔗糖濃度為5g/L，其它成分的濃度與基本發酵培養基的相同，見表l，惡臭假單胞菌的種子液按照常規技術制備)于5L發酵罐(發酵罐Model:KF-5，KOBIOTECHCO.，LTD韓國生物技術有限公司，型號KF-5)中，在30。C、初始攪拌轉速220轉/分鐘下開始發酵培養，再以lvvm的流量通入無菌空氣，盡量保持溶氧濃度高于20%;用36%氨水調節pH為7.O，氨水可以同時當做氮源使用，在線監測發酵罐中pH和溶解氧濃度的變化，當二者同時迅速上升時，說明培養基中碳源耗盡，需要流加碳源即加入補料I(其組成見表2即蔗糖)，使發酵罐中蔗糖濃度保持在15g/L之下。(2)定期從發酵罐內取出發酵液，用分光光度計測量細胞吸光密度值(0D)，當細胞吸光密度值到達30后，發酵進入第二階段，此時采用2mol/LNaOH調控pH為7.O，開始實施氮限制；同時通過調節攪拌轉速，使發酵罐內溶解氧濃度降低到10%以下，實施氧限制，同樣通過在線監測發酵罐中pH和溶解氧濃度的變化，當二者的值同時迅速上升時，流加碳源即加入補料II(其組成見表2即苯戊酸)適量，以保持罐體內蔗糖濃度低于5g/L，苯戊酸濃度低于1.0g/L;每隔一定時間取發酵液，離心后測上清液中銨鹽離子濃度，由測量值判斷，適時加入一定量的補料ni(其組成見表2即(NH4)2S04，MgS04〃H20，KH2P04)，以保持發酵液中(NH山S04濃度低于0.05g/L。實施例2以表3中所述的兩步分批補料發酵方案中的補料方案2實施，即第一階段流加補料I+II，第二階段流加補料1I+III，發酵培養時間50h，其他過程同例1。實施例3以表3中所述的兩步分批補料發酵方案中的補料方案3實施，即第一階段流加補料I，第二階段流加補料I+II+III，發酵培養時間37h，其他過程同例1。實施例4以表3中所述的兩步分批補料發酵方案中的補料方案4實施，即第一階段流加補料I+II，第二階段流加補料I+II+III，發酵培養時間50h，其他過程同例1。利用上述發酵方法，采取如表3所示的補料策略，發酵終了時細胞濃度、產物聚羥基苯烷酸酯的濃度及其組成(通過氣相色譜分析確定其組成)的變化見表4。表1發酵培養基及微量元素溶液的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2流加發酵過程中補加料液的組成種類組成/濃度(g/L)I蔗糖/600II苯戊酸/200III(NH4)2S04/5.92，MgS04'7H20/75，KH2P04/75表3兩步分批補料發酵方案補料方案編號補料策略第一步第二步1補料I補料n+m2補料i+n補料n+in補料i補料i+ii+m4補料i+n補料i+ii+iii表4不同補料控制方案對聚羥基苯烷酸酯單體組成的影響實施例發酵方案培養時間DCWPHA濃皮PHA含量PHA組成(％)(h)(g/L)(g/L)(%DCW)HB朋xHOHDHMHPV3525.037.73430.872030.575ND1.5225034.0912.25836.257110.572.5363,3726.898.95633.31210.90.176ND2445035.2712.29434.8686.30.769511上述表4中各個組分含義PHA:聚羥基苯烷酸酯(即產物)；HB:羥基丁酸；HHx:羥基己酸；H0:羥基辛酸；HD:羥基癸酸；HM:羥基豆蔻酸；HPV:羥基苯戊酸；ND:未檢測到；DCW:干細胞濃度。從表4可以看出，最終細胞濃度在2535.3g/L之間，產物濃度在7.712.3g/6L之間變化。產物聚羥基苯烷酸酯共聚物主要含有C4(即HB)、C6(即HHx)、C8(即HO)、CIO(即HD)、C14(即HM)和苯戊酸單體，其中CIO的含量最高。按照聚羥基苯烷酸酯濃度由高到低的順序排列時，依次為補料方案4、2、3、1，即方案4中得到的聚羥基苯烷酸酯濃度最大。因為聚羥基苯烷酸酯濃度與細胞濃度有相關性，在細胞內聚羥基苯烷酸酯含量一定時，當細胞密度增高，單位體積發酵液中聚羥基苯烷酸酯濃度也會隨之增加。由于方案4得到的細胞濃度值為本實驗中最大，即使方案2得到的每克細胞中聚羥基苯烷酸酯含量高于方案4，最終方案4得到的聚羥基苯烷酸酯濃度仍然為最高，這就是高密度發酵的優勢。分析各個方案得到的產物中聚羥基苯烷酸酯單體組成及比例時可以發現，當培養基中存在苯戊酸時，所有得到的聚羥基苯烷酸酯單體中都含有苯戊酸(HPV)單體結構，并且隨著培養基中苯戊酸含量的增加，最終得到的產物中HPV單體比例也會隨之增加。權利要求一種兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，其特征在于制備方法如下(1)第一階段首先在發酵培養基中加入不大于0.3g/L的含苯有機物和5～20g/L的糖作為碳源，然后接入惡臭假單胞菌種子液于發酵培養基中并在發酵罐中進行發酵培養，控制發酵罐的攪拌轉速為150～800轉/分鐘，以1vvm的流量將無菌空氣連續通入發酵罐內，并保持溶解氧濃度高于20％，發酵溫度為30±2℃，并利用氨水調節pH為7.0±0.3；隨時監控發酵過程中碳源的消耗量、溶解氧濃度和pH值的變化，當溶解氧濃度和pH值同時迅速上升時流加碳源，以保證微生物生長代謝所需；(2)第二階段當微生物細胞吸光密度達到30后，利用不含氮的堿性溶液來調節pH值，并停止補加氨水和其它含氮物質，使發酵液中的氮含量逐漸降低至0.001mol/L，造成發酵液中氮源供給不足實現氮限制；同時，適當降低發酵罐的攪拌轉速使發酵液中溶解氧濃度低于10％，使氧的供給速率小于細胞正常生長代謝所需值形成氧限制，從而同時實施氮限制和氧限制，并隨時監控溶解氧濃度和pH值的變化，當二者的值同時迅速上升時，流加碳源，微生物就會將發酵液中的碳源通過微生物代謝合成轉化為聚羥基苯烷酸酯。2.根據權利要求l所述的兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，其特征在于所述的發酵培養基組成和配比為每升發酵培養基中含蔗糖15g，KH2P043g，(NH4)2S04lg，MgS047H201.2g，檸檬酸1.7g，苯戊酸0.lg，微量元素溶液10ml。3.根據權利要求2所述的兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，其特征在于所述的微量元素溶液組成和配比為每升微量元素溶液中含FeS047H2010g，CaCl22g，ZnS047H202.25g，MnS044H200.35g，CuS045H201.2g，H萬0.25g，Na2Mo042H200.12g，35%HC110ml。4.根據權利要求1所述的兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，其特征在于上述的含苯有機物為苯戊酸或苯乳酸。5.根據權利要求1所述的兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，其特征在于上述的糖為葡萄糖或蔗糖。全文摘要本發明公開一種兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，方法如下(1)第一階段在發酵培養基中加入含苯有機物，然后接入惡臭假單胞菌種子液進行發酵培養，控制發酵罐轉速150～800轉/分鐘，發酵溫度30±2℃，pH7.0±0.3，當溶解氧濃度和pH值同時迅速上升時流加碳源；(2)第二階段當微生物細胞吸光密度達到30后，調節pH值，同時實施氮限制和氧限制，當溶解氧濃度和pH值同時迅速上升時，流加碳源，微生物就會將發酵液中的碳源通過代謝合成轉化為聚羥基苯烷酸酯。本發明具有微生物代謝含苯有機物的速率較高，有機物碳源對細胞生長抑制作用小，從而使得最終得到的細胞濃度和產物濃度都較高的優點。文檔編號C12R1/40GK101717798SQ20091015570公開日2010年6月2日申請日期2009年12月15日優先權日2009年12月15日發明者任紅,姜岷,尚龍安,張艷輝,田頻源,陳效寧申請人:浙江大學寧波理工學院