專利名稱：一種基于納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法
技術領域：
本發明屬于光子學、材料化學及生物醫學工程交叉技術領域，具體涉及一種基于
納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法。
背景技術：
生物光子學、納米光子學是近些年新興的交叉領域學科，將光學方法中無損、快 速、實時探測的優勢應用于生命科學及醫學領域，同時結合納米材料技術，降低器件的體積 及成本，從而實現十分微量的生物分子傳感探測。將具有特殊光學特性的納米金棒材料應 用于微流控芯片中，并采用熒光猝滅的方法通過激光掃描光學探測手段進行對DNA/RNA的 探測技術為制作出低成本、高效率、快速實時的生物基因分析芯片提供了可能。
傳統的基因芯片常采用將同位素標記或熒光標記探針固定在芯片中的方法，通過 放射影像或熒光強度探測判斷核酸序列。這些方法對基因探針制作要求比較高，其芯片制 作成本也較高，探針固定難度較大，結構復雜。采用納米材料熒光猝滅方法制作的傳感芯 片，利用納米材料方便了核酸的固定，并且熒光猝滅效應其敏感度更高。納米材料同微流芯 片的結合更減少了樣品及探針的用量，降低成本，簡化器件結構。
發明內容
本發明的目的就是針對現有技術不足，利用納米金棒材料快捷方便連接核酸的能 力及其高效的熒光猝滅效應，提出了一種探測DNA雜交的方法。
本發明的方法包括以下步驟 步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 90 110)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應1 2小時，靜置10 12個 小時完成反應。將反應后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個微流 通道并靜置1 2個小時。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用 而固定在玻璃基底制成的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定 的納米金棒。 步驟(2)、待測DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經過任 何標記修飾的待測DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強正電性，待測DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應0. 5 1. 5個小時。當納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分 子序列與該通道中流過的對應寡核苷酸序列互補時，寡核苷酸將與此序列發生雜交，從而 使連接寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列 與該通道中流過的對應寡核苷酸序列沒有互補時，雜交過程不發生，熒光染劑仍可發出明 顯的熒光信號。 步驟(4)、將完成反應的微流通道芯片置于激光掃描探測樣品臺，開啟半導體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號強度，予以 記錄，從而完成對DNA/RNA序列片段的傳感偵測。 本發明方法采用納米金棒材料作為熒光猝滅劑，利用其十分高效的熒光猝滅作 用，同時由于水溶液合成納米金棒方法簡單方便，其材料表面的強正電性有助于核酸的快 速連接；納米金棒其納米結構使得傳感探測過程微量化，大大地降低了成本同時提高了探 測的敏感度，十分適用于微流控芯片這種結構微型化探測微量分子的器件。結合納米材料 技術在微流控芯片中的應用，采用激光掃描探測熒光猝滅這種新型的光學手段進行核酸的 傳感偵測，有著極大的技術發展應用空間和廣闊的市場前景。
圖1為熒光猝滅原理示意圖；
圖2為光學探測裝置結構示意圖。
具體實施例方式
實施例中實現本發明方法所采用的裝置1、多通道微流控芯片。以標準載玻片玻 璃為基底，刻蝕10條50微米寬、50微米深的通道槽，每個通道間距1毫米，隨后采用玻璃 鍵合的方法密封通道，每條通道有樣品池、緩沖液池及廢液池三個開孔，微流通道經過預處 理后由壓電微閥控制其液流方向及速度。2、激光掃描及熒光探測顯微光學裝置。裝置采用 470納米半導體激光器，激發光功率為5微瓦，水平方向橫向和縱向的掃描裝置是由兩塊振 鏡控制完成的，振鏡的掃描速度和幅度由軟件控制。激發光通過在一片二色鏡反射，由10 倍物鏡聚焦在樣品上，樣品發出的熒光通過物鏡采集，透射過二色鏡并通過熒光波長帶通 濾波片，在CCD接收記錄熒光信號，CCD上不同位置的光點明暗強度對應不同掃描微流通道 中的熒光劑熒光強度。
實施例(一) —種基于納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法包括如下步驟
步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 90)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應1小時，靜置10個小時完成反應。將 反應后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個微流通道并靜置1個小 時。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃基底制成 的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定的納米金棒。
步驟(2)、待測DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經過任 何標記修飾的待測DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強正電性，待測DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應0. 5個小時。當納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列 與該通道中流過的對應寡核苷酸序列互補時，寡核苷酸將與此序列發生雜交，從而使連接 寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒 光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列與該 通道中流過的對應寡核苷酸序列沒有互補時，雜交過程不發生，熒光染劑仍可發出明顯的 熒光信號。 步驟(4)、將完成反應的微流通道芯片置于激光掃描探測樣品臺，開啟半導體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號強度，予以 記錄，從而完成對DNA/RNA序列片段的傳感偵測。
實施例(二 ) —種基于納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法包括如下步驟
步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 100)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應1.5小時，靜置11個小時完成反 應。將反應后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個微流通道并靜置 1.5個小時。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃 基底制成的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定的納米金棒。
步驟(2)、待測DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經過任 何標記修飾的待測DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強正電性，待測DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應1個小時。當納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列與 該通道中流過的對應寡核苷酸序列互補時，寡核苷酸將與此序列發生雜交，從而使連接寡 核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒光 染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列與該通 道中流過的對應寡核苷酸序列沒有互補時，雜交過程不發生，熒光染劑仍可發出明顯的熒 光信號。 步驟(4)、將完成反應的微流通道芯片置于激光掃描探測樣品臺，開啟半導體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號強度，予以 記錄，從而完成對DNA/RNA序列片段的傳感偵測。
實施例(三) —種基于納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法包括如下步驟
步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 110)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應2小時，靜置12個小時完成反應。 將反應后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個微流通道并靜置2個 小時。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃基底制 成的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定的納米金棒。
步驟(2)、待測DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經過任 何標記修飾的待測DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強正電性，待測DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應1. 5個小時。當納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列 與該通道中流過的對應寡核苷酸序列互補時，寡核苷酸將與此序列發生雜交，從而使連接 寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒 光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列與該 通道中流過的對應寡核苷酸序列沒有互補時，雜交過程不發生，熒光染劑仍可發出明顯的 熒光信號。 步驟(4)、將完成反應的微流通道芯片置于激光掃描探測樣品臺，開啟半導體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號強度，予以 記錄，從而完成對DNA/RNA序列片段的傳感偵測。
以下對本發明內容作進一步說明。 如圖1所示，基于納米金棒熒光猝滅效應的DNA傳感的原理結構是將納米金棒8 表面修飾牛血清蛋白7，利用牛血清蛋白7的物理粘附能力將納米金棒8固定于微流芯片 通道2中。未知待測核酸分子4注入微流通道，由于納米金棒表面強正電性，待測核酸分子 4吸附于納米金棒8表面。連接有熒光染劑6的A序列的寡核苷酸3和B序列的寡核苷酸 5(A與B為兩種不同序列的寡核苷酸)隨同緩沖液一起分別注入不同通道的微流管。雜交 反應發生后，寡核苷酸3與待測DNA單鏈或RNA分子中某片段因序列互補而雜交，導致熒光 染劑6與納米金棒8空間距離很近，在激發光1的激勵下，熒光染劑6發出的熒光被猝滅； 寡核苷酸5與待測DNA單鏈或RNA分子中沒有互補序列片段，不能發生雜交，因而熒光染劑 6距離納米金棒8的空間距離比較遠，在激發光1的激勵下，熒光染劑6發出明顯的熒光信 號9。 如圖2所示，半導體激光光源發出470納米5微瓦的激光光束，經過二色鏡，發射 后通過橫向振鏡10進行橫向掃描，橫向振鏡10每掃描擺動一下光束聚焦點由一條微流通 道移到相鄰的另一條微流通道，實現不同微流通道的快速掃描；縱向振鏡11實現縱向掃 描，在橫向振鏡10完成一次完整橫向掃描后，縱向振鏡11擺動一次，實現同條微流通道中 不同位置的掃描探測，起多次測量保證準確度、降低誤差的作用。激勵光束經過兩個振鏡后
通過io倍的顯微物鏡聚焦在微流芯片的微流通道上，微流通道中產生的熒光同樣由顯微物鏡收集，激勵光與產生熒光為同一光路，熒光信號透射過二色鏡后，經由帶通濾波片，最 后在CCD上進行接收記錄。 微流芯片上的微流通道管有三處開孔，分別為樣品池，緩沖液池及廢液池。
權利要求
一種基于納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒，具體方法是將制作好的納米金棒溶液以摩爾比例1∶90～110同牛血清蛋白混合攪拌反應1～2小時，靜置10～12個小時完成反應；將反應后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個微流通道并靜置1～2個小時；隨后用清水沖洗微流通道一次；步驟(2)、待測DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接，具體方法是將未經過任何標記修飾的待測DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通道；合成的納米金棒表面包覆物具有強正電性，待測DNA單鏈或RNA分子可以快速地連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性；隨后用清水沖洗微流通道一次；步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池，DNA雜交緩沖液加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩沖液混合流入微流通道，反應0.5～1.5個小時；當納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列與該通道中流過的對應寡核苷酸序列互補時，寡核苷酸將與此序列發生雜交，從而使連接寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測DNA單鏈或RNA分子序列與該通道中流過的對應寡核苷酸序列沒有互補時，雜交過程不發生，熒光染劑仍可發出明顯的熒光信號；步驟(4)、將完成反應的微流通道芯片置于激光掃描探測樣品臺，開啟半導體激光光源，控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號強度，予以記錄，從而完成對DNA/RNA序列片段的傳感偵測。
全文摘要
本發明涉及一種基于納米金棒熒光猝滅效應的微流芯片核酸傳感方法。傳統方法對探針要求高，制作成本高。本發明首先將納米金棒固定在微流通道中，其次將待測核酸分子溶液加入微流通道樣品池中使其緩慢通過微流通道，然后將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池，DNA雜交緩沖液加入緩沖液池，讓連接有寡核苷酸序列的熒光染劑和DNA雜交緩沖液混合流入微流通道，反應0.5～1.5個小時。最后將微流通道芯片置于激光掃描探測樣品臺，掃描的各微流通道中熒光信號強度，完成對DNA/RNA序列片段的傳感偵測。本發明方法降低了成本同時提高了探測的敏感度，適用于微流控芯片這種結構微型化探測微量分子的器件。
文檔編號C12Q1/68GK101709327SQ20091015512
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月2日 優先權日2009年12月2日
發明者何賽靈, 李心, 錢駿 申請人:浙江大學