專利名稱：一種新型堿性脂肪酶的制備方法
技術領域：
本發明是關于一種新型堿性脂肪酶的制備方法，屬于生物酶工程領域。
背景技術：
脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是一類分解和合成脂肪的酶，脂肪酶廣泛存在于 許多動植物及微生物中，它不僅可以催化酯水解反應還可以催化酯合成反應和轉酯反應。 脂肪酶廣泛存在于許多動植物及微生物中，主要應用于食品加工及食品風味改良、油脂工 業、皮革絹紡原料脫脂、洗滌工業等方面，是一種應用廣泛的工業用酶。自20世紀80年代以來，堿性脂肪酶因水解脂肪具有高效、反應條件溫和、無毒 等優點，引起了國內外學者的廣泛興趣。國外研究的堿性脂肪酶產生菌主要有假單胞菌、 芽孢桿菌、無色桿菌、不動桿菌、毛霉、圓弧青霉、假絲酵母等。目前，外國學者已經搞清了 Pseudomonas fIuoreseens和Penicilllum camembeilii等菌株的堿性脂肪酶的結構和作 用位置的特異性。成功克隆到類產堿假單胞菌I^seu-domonas pseudocdeligemes)、司徒芘 丘假單胞菌(Pseudomonas stutzer)、醋酸 丐不云力桿菌(Aeinetobatex ealeoaeef ieus)等 菌株的堿性脂肪酶基因，并將高產菌株如米赫毛霉(Mueormiehe)等菌株的堿性脂肪酶基 因克隆到適合發酵的菌株中，大大提高了脂肪酶產量，如今堿性脂肪酶已大量應用于工業 化生產。我國于20世紀60年代才開始微生物脂肪酶的研究，起步較晚，與國外脂肪酶的研 究存在一定的差距。研究主要集中在脂肪酶的結構鑒定、菌種篩選、酶工程及基因克隆等方 面。由于堿性脂肪酶結構及性質的多樣性、酶的不穩定性、底物的水不溶性、提純困難等因 素導致堿性脂肪酶的研究進展比較慢，而且國內研究的產堿性脂肪酶菌株的種類較少，主 要有醋酸鈣不動桿菌、類產堿假單胞菌、白地霉、青霉等。由于應用的需要，菌種及酶種的選 擇也不斷擴大，盡量獲得產酶能力高、容易培養管理、產酶性能穩定、不產有害物質、安全可 靠的菌株，以及能耐酸、耐堿、耐高溫的特殊酶種。因此篩選具有新特性、高活力的堿性脂肪 酶生產菌株對于堿性脂肪酶的深入研究和廣泛應用有重要意義。本發明是從含油的土壤 中分離得到堿性脂肪酶菌株，經過初篩和復篩和紫外誘變，獲得了一株高產脂肪酶菌株，經 過種子培養后轉入發酵培養基培養，發酵得到堿性脂肪酶液，酶液經過硫酸銨鹽析、疏水層 析、陰離子交換層析，得到純度和酶活高的堿性脂肪酶。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種堿性脂肪酶的制備方法。本發明所說的堿性脂肪酶的制備方法，是從含油的土壤中分離得到堿性脂肪酶菌 株，經過初篩和復篩和誘變，獲得了一株高產脂肪酶菌株，經過種子培養后轉入發酵培養基 培養，發酵得到堿性脂肪酶液，酶液經過硫酸銨鹽析、疏水層析、陰離子交換層析，最后經凝 膠過濾得到純度和酶活高的堿性脂肪酶。本發明的技術解決方案如下
(1)產酶菌株的來源、初篩和復篩將采自含油土壤中的樣品加入富集培養基中，振蕩培養，然后后取少量培養液加 入新鮮培養基中繼續培養，如此重復3次后，進行平板分離.將富集培養液用無菌水梯度稀釋至10_3，取稀釋液0. Iml于分離平板中，用涂布器 連涂三塊板，并標記。將涂布好的平板，在培養箱倒置培養。挑選出較大藍色圈的單菌落， 進行編號，接種于斜面培養基。從分離后的斜面上分別接菌于初篩發酵培養基，搖床中培養，測酶活。再將初篩得 到的優良菌株接于復篩培養基的搖瓶中，發酵培養，測酶活。(2)誘變取復篩得到的稀釋分散菌液置于無菌培養基中，用紫外燈誘變處理，然后將菌液 涂布于平板培養，挑選透明圈大的單菌落進行培養，獲得了一株高產脂肪酶菌株。(3)堿性脂肪酶的生成將誘變得到的高產酶菌株接入平板培養基，得到出發菌株，再將出發菌株接入種 子培養基，發酵培養得到的種子菌株轉入發酵培養基，發酵培養，得到堿性脂肪酶粗酶液。(4)堿性脂肪酶的分離純化離心上清液加硫酸銨，靜置，離心收集蛋白質沉淀，將溶于少量水中，用Tris-HCl 緩沖液透析過夜。然后將透析液上樣到已預平衡的苯基-S印har0SeCL-4B層析柱 (Dl. IcmX 30cm)上，用同一緩沖液洗滌，再用含乙醇和甘油的Tris-HCL緩沖液進行洗脫， 收集活性組分。將收集的活性組分在透析袋中濃縮后，用甘氨酸緩沖液透析，上樣到已預平 衡的DEAE Sepharose fast flow層析柱(Dl. IcmX 20cm)上，以含NaCl的同一緩沖液進行 梯度洗脫。將經DEAE Sepharosefast flow柱層析得到的高純度脂肪酶冷凍干燥后，即得 到堿性脂肪酶。本發明采用從含油土壤中篩選得到的產堿性脂肪酶菌株經過紫外線誘變，獲得了 高產酶菌株，再經發酵培養得到粗堿性脂肪酶液。粗酶液經過硫酸銨鹽析、疏水層析、陰離 子交換層析，最后經凝膠過濾得到純度和酶活高的堿性脂肪酶。該發明從土壤中獲得了一 種新型的產堿性脂肪酶菌株，經過發酵培養獲得了高純度和酶活的堿性脂肪酶，為堿性脂 肪酶的進一步研究和開發生產提供了新的途徑。
權利要求
1.一種堿性脂肪酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)產酶菌株的來源、初篩和復篩將采自含油土壤中的樣品加入富集培養基中，振蕩培養，然后后取少量培養液加入新 鮮培養基中繼續培養，如此重復3次后，進行平板分離.將富集培養液用無菌水梯度稀釋至10_3，取稀釋液0. Iml于分離平板中，用涂布器連涂 三塊板，并標記。將涂布好的平板，在培養箱倒置培養。挑選出較大藍色圈的單菌落，進行 編號，接種于斜面培養基。從分離后的斜面上分別接菌于初篩發酵培養基，搖床中培養，測酶活。再將初篩得到的 優良菌株接于復篩培養基的搖瓶中，發酵培養，測酶活。(2)誘變取復篩得到的稀釋分散菌液置于無菌培養基中，用紫外燈誘變處理，然后將菌液涂布 于平板培養，挑選透明圈大的單菌落進行培養，獲得了一株高產脂肪酶菌株。(3)堿性脂肪酶的生成將誘變得到的高產酶菌株接入平板培養基，得到出發菌株，再將出發菌株接入種子培 養基，發酵培養得到的種子菌株轉入發酵培養基，發酵培養，得到堿性脂肪酶粗酶液。(4)堿性脂肪酶的分離純化離心上清液加硫酸銨，靜置，離心收集蛋白質沉淀，將溶于少量水中，用Tris-HCl 緩沖液透析過夜。然后將透析液上樣到已預平衡的苯基-S印har0SeCL-4B層析柱(D1.IcmX 30cm)上，用同一緩沖液洗滌，再用含乙醇和甘油的Tris-HCL緩沖液進行洗脫，收 集活性組分。將收集的活性組分在透析袋中濃縮后，用甘氨酸緩沖液透析，上樣到已預平衡 的DEAE Sepharose fast flow層析柱(Dl. IcmX 20cm)上，以含NaCl的同一緩沖液進行梯 度洗脫。將經DEAE Sepharosefast flow柱層析得到的高純度脂肪酶冷凍干燥后，即得到 堿性脂肪酶。
2.根據權利(1)中所述的產酶菌株的來源、初篩和復篩，其特征在于富集培養基酵 母膏 0. 02%, Na2HPO4 0. 35%, KH2PO4 0. 15%, MgSO4. 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%，橄欖油 1.0% ；震蕩培養條件為^°C，180r/min，培養時間為3d ；平板篩選培養基牛肉膏0. 5%, 蛋白胨 1.0%，NaCl 0. 5%，葡萄糖 0. 3%，瓊脂粉 1. 5%，Tween80 0.5%. PVA 1.0%，橄 欖油2. 5% ；平板培養溫度為25°C，時間3d ；斜面培養基酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L， NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7. 5 ；初篩和復篩的發酵培養條件均為^°C，180r/min培養36h ； 篩選培養基蛋白胨 40g/L，蔗糖 20g/L，K2HP04 lg/L，MgS04. 7Hz0 0. 5g/L，大豆油 5g/L，pH 9 · 5 ο
3.根據權利O)中所述的誘變，其特征在于30W的紫外燈在距離15-30cm處照射 4-6min。
4.根據權利(3)中所述的堿性脂肪酶的生成，其特征在于種子培養基為葡萄糖2.0%, (NH4)2SO4 0. 5%, KH2PO4 0.1%, MgSO4. 7Η20 0. 05%，蛋白胨 2. 5%，橄欖油 1. 0% ； 種子培養條件為 V培養16-1 ；發酵培養基蛋白胨2. 0 %，可溶性淀粉3. 0 %，橄欖 油 1.0%, (NH4)2SO4 0. 1%, MgSO4. 7H20 0. 075%, K2HPO4 0. 1% ；發酵培養條件為初始 pH 9. 0 9. 5，30°C培養 48h。
5.根據權利(4)中所述的堿性脂肪酶的分離純化，其特征在于硫酸銨以70%飽和度沉淀4h，以含0. 5mol/L硫酸銨的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(PH7. 5)透析；在苯 基-S^harose CL-4B層析后，用含3 %乙醇和5 %甘油的20mmol/L iTris-HCL緩沖液 (PH7. 5)進行洗脫；再用50mmol/L甘氨酸緩沖液(pH 8. 6)透析24h ；在DEAEkpharose fast flow層析柱上，以含NaCl的緩沖液進行洗脫。
全文摘要
本發明公開了一種堿性脂肪酶的制備方法。是從含油的土壤中分離得到堿性脂肪酶菌株，經過初篩和復篩和紫外誘變，獲得了一株高產脂肪酶菌株，經過種子培養后轉入發酵培養基培養，發酵得到堿性脂肪酶液，酶液經過硫酸銨鹽析、疏水層析、陰離子交換層析后干燥得到純度和酶活高的堿性脂肪酶，為堿性脂肪酶的進一步研究和開發生產提供了新的途徑。
文檔編號C12N15/01GK102071176SQ200910154648
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月23日 優先權日2009年11月23日
發明者吳菁 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司