多核酸檢測方法

專利名稱：多核酸檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用固定有核酸探針的用于檢測核酸樣品的設備檢測 核酸樣品的方法，尤其涉及 一 次檢測多個核酸樣品的方法。
背景技術：
近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，鑒定了多個疾病基因，這使通過 基因診斷確定疾病成為可能。另外也實現(xiàn)了基于基因診斷結果給各患者 提供最適治療的個性化醫(yī)療。
隨著基因診斷的有效性增加，臨床現(xiàn)場中操作的樣品數(shù)激增，因此 對同時檢查大量核酸樣品的檢查陣列和檢查方法有了強烈需求，且有些 已實現(xiàn)(特開2005-345243 )。
但當同時檢查大量核酸樣品時發(fā)生被檢物錯用和污染的問題?；?診斷多為病發(fā)前診斷，根據(jù)診斷結果進行預防性治療，因此得到正確的 診斷結果是不可或缺的。
發(fā)明概述
本發(fā)明旨在提供可防止被檢物錯用、被檢物間污染所致的誤檢并具 備醫(yī)療現(xiàn)場要求的高安全性和可靠性的檢測方法。 第一實施方案
本發(fā)明的第一實施方案是檢測第1~第n (n為大于等于2的自然 數(shù))核酸樣品的多核酸檢測方法，包括
第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備準備分別對應于笫1 ~第n核酸樣品的第1 ~第n孑L，從而 使第1孔含
固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測 核酸探針固定區(qū)域和
固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的第1 陽性對照固定區(qū)域，且 使第k(k為2 n的自然數(shù))孔含 固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域和
固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k 陽性對照固定區(qū)域； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，所述試劑含相 互不同的核酸，各核酸含與固定于第1~第n孔中的第1~第n陽性對 照固定區(qū)域的第1~第n陽性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸；
第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；
第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
第二實施方案
本發(fā)明的第二實施方案是檢測第1~第n (n為大于等于2的自然 數(shù))核酸樣品的多核酸檢測方法，包括
第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備
準備分別對應于第1 ~第n核酸樣品的第1 ~第n孑L，從而 使第1孔含
固定有第1檢測核酸探針的用于檢測第1核酸樣品的第1 檢測核酸探針固定區(qū)域、
13固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的 第1陽性對照固定區(qū)域和
用于檢測第l核酸樣品之外的核酸樣品混入的第1陰性對 照固定區(qū)域，且
使第k(k為2 n的自然數(shù))孔含
固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k 檢測核酸探針固定區(qū)域、
固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的 第k陽性對照固定區(qū)域和
用于檢測第k核酸樣品之外的核酸樣品混入的第k陰性對 照固定區(qū)域， 其中，
第1陰性對照固定區(qū)域由(n-l)個固定區(qū)域構成，在各固定 區(qū)域上分別獨立固定有與固定于第2 第n陽性對照固定區(qū)域的 第2 ~第n陽性對照核酸探針含同一序列的各核酸探針，且
第k (k為2~n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域由(n-l)個固 定區(qū)域構成，在各固定區(qū)域上分別獨立固定有與固定于除第k之 外的第1~第n陽性對照固定區(qū)域的除第k之外的第1~第n陽 性對照核酸探針含同 一序列的各核酸探針； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，所述試劑含相 互不同的核酸，各核酸含與固定于第1~第n孔中的第1~第n陽性對 照固定區(qū)域的第1~第n陽性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸；
第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；
第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
14第三實施方案
本發(fā)明的第三實施方案是檢測第1~第n (n為大于等于2的自然 數(shù))核酸樣品的多核酸檢測方法，包括
第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備 準備分別對應于第1~第n核酸樣品的第1~第n孑L,從而
使第1孔含
固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測 核酸探針固定區(qū)域、
固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的笫1 陽性對照固定區(qū)域和
用于檢測第l核酸樣品之外的核酸樣品混入的第1陰性對照固 定區(qū)域，且 使第k(k為2 n的自然數(shù))孔含
固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域、
固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k 陽性對照固定區(qū)域和
用于檢測第k核酸樣品之外的核酸樣品混入的第k陰性對照 固定區(qū)域， 其中，
第1陰性對照固定區(qū)域由1個固定區(qū)域構成，在所述固定區(qū)域 上一同固定有與固定于第2 ~第n陽性對照固定區(qū)域的第2 ~第n陽 性對照核酸探針含同一序列的核酸探針，且
第k (k為2-n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域由l個固定區(qū)域 構成，在所述固定區(qū)域上一同固定有與固定于除第k之外的第1~ 第n陽性對照固定區(qū)域的除第k之外的第1~第n陽性對照核酸探 針含同一序列的核酸探針； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，所述試劑含相互不同的核酸，各核酸含與固定于第1~第n孔中的第1~第n陽性對 照固定區(qū)域的第1~第n陽性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸；
第三步將用于識別第1~笫n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；
第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
第四實施方案
本發(fā)明的第四實施方案是檢測第1~第11 (n為大于等于2的自然 數(shù))核酸樣品的多核酸檢測方法，包括
第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備 準備分別對應于第1~第n核酸樣品的第1~第n孔，從而 使第1孔含
固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測 核酸探針固定區(qū)域、
固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的第1 陽性對照固定區(qū)域和
固定有第1陰性對照核酸探針的用于檢測第l核酸樣品之外的 核酸樣品混入的第1陰性對照固定區(qū)域，且 使第k(k為2 n的自然數(shù))孔含 固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域、
固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k 陽性對照固定區(qū)域和
固定有第k陰性對照核酸探針的用于檢測第k核酸樣品之外 的核酸樣品混入的第k陰性對照固定區(qū)域；
16第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，其中， 所述用于識別第1核酸樣品的試劑包括 含與固定于第1陽性對照固定區(qū)域的第1陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第1陽性對照的試劑和
含與固定于第2 ~第n陰性對照固定區(qū)域的第2 ~第n陰性對照 核酸探針具有分別互補的序列的多個核酸的用于判定第1陰性對照 的試劑，且
所述用于識別第k(k為2 n的自然數(shù))核酸樣品的試劑包括 含與固定于第k陽性對照固定區(qū)域的第k陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第k陽性對照的試劑和
含與固定于除第k之外的第1 ~第n陰性對照固定區(qū)域的除第k 之外的第1~第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列的多個核 酸的用于判定第k陰性對照的試劑； 第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；
第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
第五實施方案
本發(fā)明的第五實施方案是檢測第1~第n (n為大于等于2的自然 數(shù))核酸樣品的多核酸檢測方法，包括
第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備 準備分別對應于第1~第n核酸樣品的第1~第n孔，從而 使第1孔含
固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測 核酸探針固定區(qū)域、
固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的第1
17陽性對照固定區(qū)域和
固定有第1陰性對照核酸探針的用于檢測第l核酸樣品之外的 核酸樣品混入的第1陰性對照固定區(qū)域，且
使第k (k為2-n的自然數(shù))孔含 固定有笫k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域、
固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k 陽性對照固定區(qū)域和
固定有第k陰性對照核酸探針的用于檢測第k核酸樣品之外 的核酸樣品混入的第k陰性對照固定區(qū)域； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，其中， 所述用于識別第1核酸樣品的試劑包括 含與固定于第1陽性對照固定區(qū)域的第1陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第1陽性對照的試劑和
含與固定于第2 ~第n陰性對照固定區(qū)域的第2 ~第n陰性對照 核酸探針具有分別互補的序列，且與和固定于第2~第n陽性對照 固定區(qū)域的第2~第n陽性對照用核酸探針雜交的核酸具有分別互 補的序列的多個核酸的用于判定第1陰性對照的試劑，且
所述用于識別第k(k為2 n的自然數(shù))核酸樣品的試劑包括 含與固定于第k陽性對照固定區(qū)域的第k陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第k陽性對照的試劑和
含與固定于除第k之外的第1 ~第n陰性對照固定區(qū)域的除第k 之外的第1~第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列，且與和 固定于除第k之外的第1~第n陽性對照固定區(qū)域的除第k之外的 第1~第n陽性對照用核酸探針雜交的核酸具有分別互補的序列的 多個核酸的用于判定第k陰性對照的試劑； 第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；
第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中；
18第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
可通過本發(fā)明的多核酸檢測方法防止被檢物錯用和被檢物間污染 所致的誤檢，從而可實現(xiàn)具備醫(yī)療現(xiàn)場所需的高安全性和信賴性的檢測 方法。
以下描述本發(fā)明的優(yōu)點， 一部分可通過描述顯而易見，或可通過實 施本發(fā)明得知?？赏ㄟ^以下描述的儀器及其組合實現(xiàn)并得到本發(fā)明的優(yōu) 點。
附圖簡述
附圖構成說明書的一部分，描繪了本發(fā)明的實施方案，并結合上述
發(fā)明概述和下述發(fā)明詳述用于解釋本發(fā)明的原理。
圖1:第一實施方案的用于檢測核酸樣品的設備ll的模式圖。
圖2:使用圖1所示用于檢測核酸樣品的設備11檢測多個核酸的
方法的模式圖。
圖3:第二實施方案的用于檢測核酸樣品的設備31的模式圖。 圖4:使用圖3所示用于檢測核酸樣品的設備31檢測多個核酸的 方法的模式圖。
圖5:第三實施方案的用于檢測核酸樣品的設備51的模式圖。 圖6:圖5所示固定于陰性對照固定區(qū)域的核酸探針的模式圖。 圖7:使用圖5所示用于檢測核酸樣品的設備51檢測多個核酸的 方法的模式圖。
圖8:第四實施方案的用于檢測核酸樣品的設備81的模式圖。 圖9:使用圖8所示用于檢測核酸樣品的設備81檢測多個核酸的 方法的模式圖。
圖10:第五實施方案的多核酸檢測方法的模式圖。
圖11:圖IO所示用于判定陰性對照的試劑中所含多個核酸的模式圖。
圖12:表示從第一實施方案的樣品Sl S4檢測到的電流值的第1 柱形圖。
圖13:表示從第一實施方案的樣品S1 S4檢測到的電流值的第2 柱形圖。
圖14:表示從第二實施方案的樣品S1 S4檢測到的電流值的柱形圖。
圖15:表示從第三實施方案的樣品S1 S4檢測到的電流值的柱形圖。
圖16:表示從第四實施方案的樣品S1 S4檢測到的電流值的第1 柱形圖。
圖17:表示從第四實施方案的樣品S1 S4檢測到的電流值的第2 柱形圖。
圖18:表示從第五實施方案的樣品S1 S4檢測到的電流值的柱形圖。
發(fā)明詳述
基本內容
以下對(1)用于檢測核酸樣品的設備、(2)檢測方法、(3)核酸 樣品及(4 )檢測過程進4亍說明。
(1)用于檢測核酸樣品的設備
本實施方案的用于檢測核酸樣品的設備的特征在于具備例如基板、
形成于基板上的多個核酸探針固定區(qū)域和用于隔開所述核酸探針固定 區(qū)域的框架。所述框架形成至少一個孔，各孔構成用于檢測l種核酸樣 品的1個檢查行道，固定有檢測核酸探針的核酸探針固定區(qū)域(以下簡 稱檢測核酸探針固定區(qū)域)分別形成于各孔中。
對所述基板和框架的材料無特定限制，可使用本領域技術人員已知 的任意材料?？墒褂美绮ＡА⑹⒉ＡА⒐?、礬土、藍寶石、鎂橄欖 石、碳化硅、氧化硅、氮化硅等無機材料。也可使用聚乙烯、乙烯、聚
20丙烯、聚異丁烯、聚對苯二曱酸乙二醇酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚 氯乙稀、聚偏二氯乙烯、聚醋酸乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯 酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛樹 脂、脲醛樹脂、環(huán)氧樹脂、蜜胺樹脂、苯乙烯-丙稀腈共聚物、丙稀腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、硅樹脂、聚苯醚、聚砜等有機材料。對基板形 狀無特定限制，可為平面狀和凹凸狀中的任一種，也可為多孔體。
所述核酸探針固定區(qū)域由檢測核酸探針固定區(qū)域、陽性對照固定區(qū) 域和陰性對照固定區(qū)域構成。
"檢測核酸探針固定區(qū)域"是用于檢測有無待檢乾核酸序列的區(qū)域。 例如，當檢查有無某疾病基因時，可通過固定具有與所述疾病基因互補 的序列的核酸探針來判定核酸樣品中有無疾病基因?？赏ㄟ^設定多個檢 測核酸探針固定區(qū)域，并分別固定含不同堿基序列的核酸探針來同時檢 查多個檢測項目。"與疾病基因具有互補序列的核酸探針"指具有與疾病 基因的至少一部分互補的序列的核酸探針。
"陽性對照固定區(qū)域，，是用于確認有無核酸樣品錯用的區(qū)域。以往的 用于檢測核酸樣品的設備中由于無所述"陽性對照固定區(qū)域，，，所以當同 時檢測多個核酸樣品時，即便將某核酸樣品錯用為別的核酸樣品，也無 法確認所述事實。而本實施方案的用于檢測核酸樣品的設備可通過所述 "陽性對照固定區(qū)域"確認有無核酸樣品的錯用，從而可提供無樣品錯用 的具備高安全性和信賴性的用于檢測核酸樣品的設備。
"陰性對照固定區(qū)域，，是用于確認有無污染的區(qū)域。以往的用于檢測 核酸樣品的設備中由于無所述"陰性對照固定區(qū)域，，，所以當同時檢測多 個核酸樣品時，即便某核酸樣品中混入其他核酸樣品(污染)，也無法 確認所述事實。而本實施方案的用于檢測核酸樣品的設備可通過所述 "陰性對照固定區(qū)域"確認有無其他核酸樣品混入(污染)，從而可提供 無污染的具備高安全性和信賴性的用于檢測核酸樣品的設備。
使用本領域技術人員已知的任意材料。例如可使用DNA、 RNA、 PNA、 甲基磷酸酯骨架的核酸、其他核酸類似物及它們的嵌合核酸。對所使用
21的探針長度無特定限制，例如8 ~ 200個堿基、優(yōu)選10~100個#, 更優(yōu)選12 ~ 50個堿基。
可使用本領域技術人員已知的任意方法。例如可通過物理吸附、化學吸 附、疏水結合、包埋和共價結合等進行固定。更具體可通過例如經(jīng)由導 入探針末端的氨基，使用碳二亞胺等縮合劑將探針共價結合到基板上。 也可通過向基板包被陰離子性有機物將核酸探針經(jīng)由離子鍵固定于基 板上。也可通過將生物素導入探針末端，通過生物素-抗生物素蛋白鍵 合固定所述探針。也可通過向探針末端導入巰基，在包被于基板上的含 巰基物質間形成S-S來強固固定。這種情況下，可通過預先用具有官能 團的分子修飾基板表面來使固定變得容易。另外，優(yōu)選在探針和末端修 飾基團之間導入用于抑制J41表面和探針的立體阻礙的間隔物。對間隔 物分子無特定限制，可為例如烷烴骨架、炔烴骨架、烯烴骨架、乙二醇 骨架或核酸鏈。另外，分子結構可為直鏈，也可為支鏈。對間隔物部分 的長度無特定限制，以碳-碳鍵計優(yōu)選為10~500、更優(yōu)選為20~200、 再更優(yōu)選為50 ~ 100。
向基板固定核酸探針時，可通過使用被稱為DNA點斑儀(DNA spotter)或DNA陣列儀(DNA arrayer)的固定裝置較易進行探針固 定。此時，為避免損傷表面，優(yōu)選使用噴墨或靜電點斑儀。也可在基板 表面直接合成核酸鏈。
板與框架前進行，但也可在密接后固定核酸探針。另外，本實施方案的 用于檢測核酸樣品的設備未必非要以核酸探針固定區(qū)域固定有核酸探 針的狀態(tài)提供，也可作為未固定有核酸探針的基板提供。在這種情況下， 可將期望的核酸探針如上所述固定于基板上，而將所述基板用作檢測核 酸樣品的設備。
對由框架形成的孔的形狀無特定限制，可為圓形、四邊形或多邊形。 另外，可制作孔無底的框架，并將其與在其上已形成核酸探針固定區(qū)域 的M進行密接而使用而使制成本實施方案的核酸檢測基板變得容易。密接框架和J41希望使用粘結或壓接等強化密接方法以防止漏液，也可 利用硅包裝進行密接。
另夕卜，對于本實施方案的核酸檢測勤良，未必非要將形成核酸探針 固定區(qū)域的基板和框架作為一體提供，也可以兩者分離的狀態(tài)提供。在 這種情況下使用核酸檢測J4l時，如上將基板和框架進行密接而使用。
本實施方案的用于檢測核酸樣品的設備有多個由所述框架形成的
孔，以檢測多個核酸樣品。對所述孔的個數(shù)無特定限制，優(yōu)選3~100 個、更優(yōu)選4~50個、再更優(yōu)選5~20個。所述孔形成于同一設備中， 但J41不限于1個。也可在1個J41上形成全部孔，也可在多個基板上 形成多個孔。可通過例如^f吏用多個形成1個孔的M來同時檢測多個核 酸樣品。在這種情況下，在l個基板上檢測l個核酸樣品。 (2)檢測方法
技術領域：
本發(fā)明包括本領域技術人員已知的全部檢測方法，無意根據(jù)檢測方 法進行限定性解釋?？墒褂美?，根據(jù)熒光色素的熒光強度進行的檢測、 使用放射性同位素的檢測、使用嵌入劑分子的電化學應答的檢測、根據(jù) 靜電容量變化的檢測等。尤其具有代表性的檢測方法是根據(jù)熒光的檢測 和電化學檢測。根據(jù)熒光的檢測由于可視覺識別檢測結果，因此可防止 檢測結果的判定錯誤。因為電化學檢測可僅根據(jù)電流值進行檢查，因此 可實現(xiàn)裝置的小型化、檢查費用的低廉化、檢查時間的縮短化。另夕卜， 在進行電化學檢測時，所述各核酸探針固定區(qū)域構成為電極，所述電極 上固定有各核酸探針。
根據(jù)熒光檢測時，預先用熒光物質標記核酸樣品。例如使用用熒光 物質標記的引物PCR擴增耙核酸。與核酸探針形成雜交鏈的草巴核酸即 便經(jīng)洗滌后仍停留在核酸探針固定區(qū)域內，從而發(fā)出熒光。可使用任何 公知的熒光物質，例如使用FITC、 Cy3、 Cy5或羅丹明等。可使用熒 光檢測儀檢測熒光物質的發(fā)光。可根據(jù)得到的熒光發(fā)光量確定對應于各 核酸探針的靶核酸的有無。
在熒光檢測方法中，為抑制核酸或熒光色素等向核酸探針固定區(qū)域 上的非特異性附著，優(yōu)選用巰基乙醇、巰基己醇、巰基庚醇、巰基乙二
23醇、巰基寡乙二醇、巰基聚乙二醇、巰醇(如具有C30 CS0鏈的烷基硫醇)或硬脂酰胺等脂類、表面活性劑、白蛋白或核酸等包被核酸探針固定區(qū)域表面。
進行電化學檢測時使用例如具有電化學活性的分子。具有電化學活性的分子指結合于雜交鏈，并于施加電位后發(fā)射電子的分子。對于所述分子，可使用任何7>知分子，例如使用Hoechst33258 (注冊商標)(可從CALBIOCHEM得到)、吖啶橙、奎納克林、道諾霉素、金屬嵌入劑、雙嵌入劑(如雙吖啶)、三嵌入劑或聚嵌入劑。尤其優(yōu)選使用Hoechst33258 (注冊商標)。Hoechst 33258 (注冊商標)是由化學物質p-(5-(5-(4-曱基哌嗪-l-基)苯并咪唑-2-基)苯并咪唑-2-基)苯酚構成的分子。而且，可用具有電化學活性的金屬絡合物(如二茂鐵(二環(huán)戊二烯鐵)或紫羅堿)修飾這些嵌入劑?？蛇m宜選擇所述分子的濃度， 一般在lng/mL 1000ng/mL范圍內。此時可使用離子強度0.01 ~ 5、 pH5 ~ 10范圍內的緩沖液。
所述分子識別所述雜交鏈并嵌入其中。施加電位后發(fā)生氧化還原反應，由所述嵌入分子釋i文電子而形成電流。此時，可以恒定速度進4亍電位掃描或通過脈沖施加電位，或可施加恒定電位。電位掃描速度在10 ~1000mV/秒的范圍內。測定時可使用恒電位器、數(shù)字多用表和函數(shù)發(fā)生器等裝置調節(jié)電流、電壓。源于所述分子的電流流過電極，可通過測量所述電流值而檢測有無對應于各核酸探針的靶核酸。
在電化學檢測方法中，為抑制核酸或嵌入劑等向核酸探針固定區(qū)域(電極)的非特異性附著，優(yōu)選用巰基乙醇、巰基己醇、巰基庚醇、巰基乙二醇、巰基寡乙二醇、巰基聚乙二醇、巰醇(如具有C30 ~ C50鏈的烷基硫醇)或硬脂酰胺等脂類、表面活性劑、白蛋白或核酸等包被電極表面。
(3)核酸樣品
對通過本實施方案的用于檢測核酸樣品的設備檢測的核酸樣品無特定限制，其可為例如從血液、血清、白細胞、尿、糞便、精液、唾液、組織、培養(yǎng)細胞、痰、食品、土壤、排水、廢水、空氣等樣品提取的核
24酸樣品，或為提取后通過擴增處理得到的核酸樣品。本實施方案的檢測方法可用于檢測例如病毒(肝炎病毒(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、
己型、庚型)、HIV、流感病毒(曱型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型)、皰滲群病毒、腺病毒、人多瘤病毒、人乳頭瘤病毒、人細小病毒、腮、腺炎病毒、人輪狀病毒、腸道病毒、日本腦炎病毒、天花病毒、冠狀病毒、SARS、登革熱病毒、風滲病毒、HTLV等)感染、細菌(金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、病原性大腸桿菌、腸炎弧菌、幽門螺桿菌、彎曲桿菌、霍亂菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、炭疽桿菌、耶爾森菌、淋病雙球菌、李斯特氏菌、鉤端螺旋體、軍團菌、螺旋體、肺炎支原體、立克次體、衣原體、瘧疾、痢疾變形蟲、病原性真菌等)感染以及寄生蟲和真菌感染。
本實施方案的檢測方法也可用于判定誘發(fā)所述感染的微生物型(基因分型)。例如，丙型肝炎病毒的基因型la、 lb、 2a、 2b、 3a、 3b和人乳頭瘤病毒的基因型，即惡變相關的16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、51、 52、 53、 54、 56、 58、 59、 66、 68、 69和與惡變無關的6、 11、 34、40、 42、 43、 44、 70等。也可檢測耐藥基因，例如結核桿菌、艾滋病毒和誘發(fā)呼吸器官感染的病原菌的耐藥基因等。另夕卜，可用于檢查遺傳疾病、腫瘤疾病(視網(wǎng)膜母細胞瘤、病毒腫瘤、家族性結腸息肉病、遺傳性非息肉性結腸癌、神經(jīng)纖維瘤病、家族性乳癌、著色性干皮病、腦癌、口腔癌、食管癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、甲狀腺瘤、乳腺癌、尿腫瘤、男性生殖器瘤、女性生殖器瘤、皮膚瘤、骨肉瘤、骨軟骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、實體瘤等)。另外還通適用于醫(yī)療之外的，食品檢查、檢疫、醫(yī)藥品檢查、法醫(yī)學、農業(yè)、畜牧、漁業(yè)、林業(yè)等需要基因檢查的領域。另外也適用于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、單核普酸多態(tài)性(SNPs )、微衛(wèi)星序列等的檢測。還可適用于分析未知堿基序列。
(4)檢測過程
為檢測樣品所含核酸，先要從樣品中提取核酸而得到核酸樣品。對提取方法無特定限制，可使用例如苯酚-氯仿法等液-液提取法或使用載體的固液提取法。也可使用QIAamp ( QIAGEN公司生產)、Sumi Test
(住友金屬公司生產)等市售核酸提取方法。將這些樣品注入微孔滴定板等，并進行基因檢測。提取基因時，如果使用保持疏水性膜的微孔滴定板等，可更簡便進行檢測操作。優(yōu)選將提取出的核酸溶于合適的溶液中。
核酸與固定于探針固定區(qū)域的探針發(fā)生雜交反應時，將離子強度0.01~5， pH5~10的緩沖液作為反應溶液。可向反應溶液中加入作為雜交促進劑的硫酸葡聚糖、鮭魚精子DNA、牛胸腺DNA、 EDTA和表面活性劑等。也可加入用于調節(jié)鹽濃度的試劑、用作陽性對照的試劑等。也可根據(jù)情況進行核酸擴增反應作為預處理。對核酸擴增反應無特定限制，可為PCR法、LAMP法、ICAN法等。然后將提取出的核酸加入反應溶液中，于卯。C或以上使之熱變性。含核酸的反應溶液與探針固定電極的接觸可在變性后立即進行，也可在迅速冷卻至0。C后進行。反應過程中也可通過攪拌或振搖等操作提高反應速度。反應溫度優(yōu)選在10°C 9(TC范圍內，反應時間優(yōu)選為約l分鐘 過夜。雜交反應后洗滌探針固定區(qū)域。使用離子強度0.01~5， pH5~10的緩沖液作為洗滌液。此時，向含核酸的反應溶液中預先加入用于識別核酸樣品的試劑。用于識別核酸樣品的試劑中含對應于用作陽性對照的核酸探針、對應于用作陰性對照的核酸探針的成分。
洗滌后檢測有無雜交。對檢測方法無特定限制，可使用如上使用熒光染料對熒光強度的檢測、使用放射性同位素的檢測、使用嵌入劑分子的電化學應答的檢測、根據(jù)靜電容量變化的檢測等。
根據(jù)本實施方案的檢測方法，在形成于所述基板的各反應用孔中使用來自不同被檢物的樣品，從而可同時檢測多個樣品中核酸鏈的存在。
另夕卜，可自動化所述核酸反應和核酸檢測。通過自動化，從而可減少手工操作所致的測量結果的變動。自動檢測裝置可設置有控制提取反應、擴增反應、雜交反應、洗滌反應等的反應溫度的溫度控制系統(tǒng)。溫度控制系統(tǒng)可使用利用Peltier元件的系統(tǒng)、利用電加熱器的系統(tǒng)等。另外，自動檢測裝置可設置有用于遞送各試劑溶液的送液系統(tǒng)。送液系
26統(tǒng)可使用泵、配管、流速監(jiān)控器、脫氣結構、氣液感應監(jiān)控器等。另外，自動檢測裝置可設置有用于檢測雙鏈核酸、單鏈核酸的檢測系統(tǒng)。檢測
系統(tǒng)因檢測方式而多樣，焚光檢測方式中可使用激光照射裝置、CCD照相機等。電流檢測方式中可使用2電極或3電極電流電壓控制裝置。另外，自動檢測裝置可設置有基于所得信號進行自動判定的信號處理系統(tǒng)。也可利用計算機預先內置的數(shù)據(jù)庫和閾值等而基于所得信號來測定樣品核酸的序列或判定靶核酸的有無。所述自動化裝置可一次處理多個用于檢測核酸樣品的設備。另外，裝置可集全部工程執(zhí)行于一身，也可由多臺分擔工程。
本發(fā)明的實施方案以下根據(jù)


本發(fā)明的實施方案。下述實施方案僅限于示例性詳述本發(fā)明的結構。因此不應當根據(jù)以下實施方案中的記栽限制性解釋本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不僅限于權利要求書中記載的發(fā)明范圍，也包括以下實施方案的各種變型、改良形式的實施方案。(1)第一實施方案
圖l是顯示第一實施方案的用于檢測核酸樣品的設備ll的模式圖。用于檢測核酸樣品的設備11的特征在于設置有基板16、形成于M上的多個核酸探針固定區(qū)域、用于隔開所述核酸探針固定區(qū)域的框架17。所述框架17形成1個或多個孔12，所述各孔構成用于檢測1種核酸樣品的1個檢查行道，固定有待檢核酸探針的檢測核酸探針固定區(qū)域13分別形成于各孔12中。
第l 第n孑L 12^n中分別設置有用于注入第1 第n核酸樣品的注入口 15bn(以下簡稱為第1 第n注入口 15^)。第l孔12i是用于檢測第1核酸樣品的孔，第k ( k是大于等于2的自然數(shù))孑L 12k是用于檢測第k核酸樣品的孔。
其中第l孔1^含用于檢測第1核酸樣品的檢測核酸探針固定區(qū)域(以下簡稱第1檢測核酸探針固定區(qū)域13!)和用于識別第1核酸樣品的陽性對照固定區(qū)域1+ (以下簡稱第1 陽性對照固定區(qū)域14！)，且
第k (k是大于等于2的自然數(shù))孔12k含 用于檢測第k核酸樣品的檢測核酸探針固定區(qū)域13k (以下簡稱 第k檢測核酸探針固定區(qū)域13j和
用于識別第k核酸樣品的陽性對照固定區(qū)域14k (以下簡稱第k 陽性對照固定區(qū)域14J。
具有所述結構的用于檢測核酸樣品的設備11可檢測第1 ~第n ( n 是大于等于2的自然數(shù))核酸樣品。
圖1例示了可檢測第1 ~第4 (n=4 )核酸樣品(核酸樣品SI ~ S4) 的用于檢測核酸樣品的設備11。第1 ~第4孑L 12"4中分別設置有用于 注入第1 ~第4核酸樣品的注入口 15卜4 (以下簡稱為第1 ~第4注入 口 15h)。
"陽性對照固定區(qū)域"上分別固定有各不相同的識別用核酸探針。例 如，第1陽性對照固定區(qū)域1^上固定有構成第1陽性對照的核酸探針 Cl，第2陽性對照固定區(qū)域142上固定有構成第2陽性對照的核酸探針 C2，第3陽性對照固定區(qū)域143上固定有構成第3陽性對照的核酸探針 C3，第4陽性對照固定區(qū)域144上固定有構成第4陽性對照的核酸探針 C4。
"檢測核酸探針固定區(qū)域"上有與1種以上與待檢革巴序列互補的核 酸探針固定于其分別獨立的區(qū)域。當待檢耙序列有2種以上時檢測核酸 探針固定區(qū)域設置有2個以上獨立的固定區(qū)域，各固定區(qū)域上分別固定 有與l個靶序列互補的核酸探針。圖l例示了有4個待檢靶序列的情況， 各孔中用于檢測的核酸探針固定區(qū)域分別設置有4個獨立的固定區(qū)域， 各固定區(qū)域上分別固定有各與1個靼序列互補的核酸探針D1、 D2、 D3 和D4。其中所述"耙序列"指例如具有與待檢疾病基因的至少一部分互 補的序列的序列。 一般情況下，通過聚焦于待檢基因的特征序列位點， 設計含與所述序列位點互補的序列的核酸探針，并將其固定于檢測核酸 探針固定區(qū)域來進行檢測。
28圖2
圖2是顯示使用圖1所示用于檢測核酸樣品的設備11檢測多個核酸的方法的模式圖。
將用于識別第1~第n (n是大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的試劑分別加入到第1~第n核酸樣品中。用于識別第l核酸樣品的試劑含具有與固定于第1陽性對照固定區(qū)域1^的核酸探針C1互補的序列的"第1陽性對照用核酸"。用于識別第k(k是2 n的自然數(shù))核酸樣品的試劑含具有與固定于第k陽性對照固定區(qū)域14k的核酸探針C (k)互補的序列的第k陽性對照用核酸。將加入了含所述成分的用于識別第1~第n核酸樣品的試劑的第1~第n核酸樣品通過設置于第1 ~第n孔中的第1 ~第n注入口 15^分別注入到所述第1~第n孔中，從而在第1 ~第n陽性對照固定區(qū)域14^導致雜交反應，并通過對此進行檢測，可確認無第1 ~第n核酸樣品的錯用。
圖2中，將用于識別第1核酸樣品的試劑(試劑1)加入第1核酸樣品(樣品Sl)中(圖2a),將用于識別第2核酸樣品的試劑(試劑2 )加入第2核酸樣品(樣品S2 )中(圖2b )。同樣將用于識別第3核酸樣品的試劑(試劑3 )加入第3核酸樣品(樣品S3 )中，將用于識別第4核酸樣品的試劑(試劑4 )加入第4核酸樣品(樣品S4 )中。
用于識別第1核酸樣品的試劑(試劑1)含具有與固定于第1陽性對照(PC )固定區(qū)域14!的核酸探針Cl互補的序列的核酸Tl(圖2( a))，用于識別第2核酸樣品的試劑(試劑2 )含具有與固定于第2陽性對照(PC)固定區(qū)域142的核酸探針C2互補的序列的核酸T2 (圖2 (b))。同樣，用于識別第3核酸樣品的試劑(試劑3 )含具有與固定于第3陽性對照固定區(qū)域143的核酸探針C3互補的序列的核酸T3，用于識別第4核酸樣品的試劑(試劑4 )含具有與固定于第4陽性對照固定區(qū)域144的核酸探針C4互補的序列的核酸T4。
將加入了用于識別第1 ~第4核酸樣品的試劑(試劑1 ~ 4 )的第1 ~第4核酸樣品(樣品SI ~ S4)分別注入到第1 ~第4孔12i ~ 124中。通過設置于第1~第4孑L 12廣124上的第1~第4注入口 15廣154注入各
29樣品。例如，將加入了用于識別第l核酸樣品的試劑(試劑1)的第1
核酸樣品注入到第1孔12i時，試劑1所含核酸Tl與固定于第1陽性 對照固定區(qū)域14i的核酸探針Cl雜交(圖2 (a))。結果，可檢測來自 形成的雜交鏈的信號。反之，當把第l核酸樣品誤注入第2孔122時， 試劑1所含核酸Tl不能與固定于第2陽性對照固定區(qū)域142的核酸探 針C2雜交。結果，不能檢測來自形成的雜交鏈的信號，從而可容易且 確切證實發(fā)生被檢物的錯用。 (2)第二實施方案 圖3
圖3是顯示第二實施方案的用于檢測核酸樣品的設備31的模式圖。 第二實施方案的用于檢測核酸樣品的設備31除在各孔中含陽性對照固 定區(qū)域14i-n之外，還含第1~第n陰性對照固定區(qū)域32卜n。
第1陰性對照固定區(qū)域32!由(n-l)個固定區(qū)域構成，各固定區(qū) 域上分別各固定有固定于第2~第n陽性對照固定區(qū)域的各核酸探針 C2-Cn;且第k (k是2 n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域32k由(n-1)個固定區(qū)域構成，各固定區(qū)域上分別各固定有除固定于第k陽性對 照固定區(qū)域的核酸探4十C (k)之外的固定于第1~第n陽性對照固定 區(qū)域的各核酸探針Cl ~ Cn。
圖3例示了可檢測第1~第4 (n=4)核酸樣品的用于檢測核酸樣 品的設備31。第1陰性對照固定區(qū)域32i由3個固定區(qū)域構成，各固定 區(qū)域上分別各固定有固定于第2、第3和第4陽性對照固定區(qū)域的核酸 探針C2、 C3和C4;第2陰性對照固定區(qū)域322由3個固定區(qū)域構成， 各固定區(qū)域上分別各固定有固定于第1、第3和第4陽性對照固定區(qū)域 的核酸探針C1、 C3和C4;第3陰性對照固定區(qū)域323由3個固定區(qū)域 構成，各固定區(qū)域上分別各固定有固定于第1、第2和第4陽性對照固 定區(qū)域的核酸探針C1、 C2和C4;第4陰性對照固定區(qū)域324由3個固 定區(qū)域構成，各固定區(qū)域上分別各固定有固定于第1、第2和第3陽性 對照固定區(qū)域的核酸探針C1、 C2和C3。
圖4
30圖4是顯示使用圖3所示用于檢測核酸樣品的設備31檢測多個核酸的方法的模式圖。第二實施方案和第一實施方案的差別在于，通過在各孔中設置陰性對照，從而不僅可檢測核酸樣品的錯用，還可檢測核酸樣品中是否混入其他核酸樣品(污染)。
同第一實施方案一樣，將加入了用于識別第1~第4核酸樣品的試劑(試劑1 ~ 4 )的第1 ~第4核酸樣品(樣品SI ~ S4 )分別注入第1 ~第4孑L12廣124中。通過設置于第1~第4孔12廣124上的第1~第4注入口 15! 154注入各樣品。例如，將加入了用于識別第l核酸樣品的試劑(試劑1)的第1核酸^=羊品注入到第1孔12!時，試劑1所含核酸Tl與固定于第1陽性對照固定區(qū)域1^的核酸探針C1雜交(圖4(a))。結果，可檢測到來自形成的雜交鏈的信號。而試劑1所含核酸T1不能與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32i的核酸探針C2、 C3和C4中的任一個雜交(圖4(b))。結果，不能從第1陰性對照固定區(qū)域32i檢測到信號，從而可確認沒有發(fā)生其他核酸樣品的混入(污染)。
反之，當從第1陰性對照固定區(qū)域32t檢測到信號時，則可檢測出有其他核酸樣品的混入。例如，當加入了用于識別第2核酸樣品的試劑(試劑2 )的第2核酸樣品(樣品S2 )混入第1核酸樣品(樣品Sl)中時(圖4 (c))，由于第l核酸樣品(樣品S1)中混入了試劑2所含核酸T2，從而核酸T2與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32i的核酸探針C2雜交(圖4(d))。結果，可檢測到來自形成的雜交鏈的信號，從而可檢測出有其他核酸樣品的混入(污染)。第二實施方案在可檢測是否發(fā)生核酸樣品的錯用的同時，還可檢測有無污染，從而可提供安全性和可靠性更高的檢測方法。
(3)第三實施方案
圖5
圖5是顯示第三實施方案的用于檢測核酸樣品的設備51的模式圖。第三實施方案的用于檢測核酸樣品的設備51并非如第二實施方案中一樣在各孔中設置多個陰性對照固定區(qū)域，而以由1個固定區(qū)域構成為其特征。
31第1陰性對照固定區(qū)域由l個固定區(qū)域構成，在所述固定區(qū)域上一
同固定有與固定于第2~第n陽性對照固定區(qū)域的各核酸探針C2~C (n)具有同一序列的核酸探針，且第k (k為2 n的自然數(shù))陰性對 照固定區(qū)域由l個固定區(qū)域構成，在所述固定區(qū)域上一同固定有與除固 定于第k陽性對照固定區(qū)域的核酸探針C(k)之外的固定于第1~第n 陽性對照固定區(qū)域的各核酸探針具有同 一序列的核酸探針。
圖5例示了可檢測第1~第4 (n==4)核酸樣品的用于檢測核酸樣 品的設備51。第1陰性對照固定區(qū)域32i由l個固定區(qū)域構成，在所述 固定區(qū)域上一同固定有固定于第2、第3和第4陽性對照固定區(qū)域的各 核酸探針C2、 C3和C4;第2陰性對照固定區(qū)域322由l個固定區(qū)域構 成，在所述固定區(qū)域上一同固定有固定于第1、第3和第4陽性對照固 定區(qū)域的各核酸探針Cl、 C3和C4;第3陰性對照固定區(qū)域323由1 個固定區(qū)域構成，在所述固定區(qū)域上一同固定有固定于第1、第2和第 4陽性對照固定區(qū)域的各核酸探針C1、 C2和C4;第4陰性對照固定區(qū) 域324由l個固定區(qū)域構成，在所述固定區(qū)域上一同固定有固定于第1、 第2和第3陽性對照固定區(qū)域的各核酸探針Cl、 C2和C3。 圖6
圖6是顯示固定于圖5所示陰性對照固定區(qū)域的核酸探針的模式 圖。第三實施方案與第二實施方案的差別在于，陰性對照固定區(qū)域由l 個區(qū)域構成。陰性對照與陽性對照不同，隨著核酸樣品數(shù)的增多，所需 作為陰性對照的核酸探針數(shù)也增多。如果在1個固定區(qū)域一并固定多個 核酸探針，則即便核酸樣品數(shù)增多，也不必增加陰性對照固定區(qū)域數(shù)， 與樣品數(shù)的增減無關，可確保M上用于檢查的充分的空間恒定。
將多個陰性對照設置于1個區(qū)域時，所述設置狀態(tài)有例如將構成 陰性對照的多種核酸探針并列固定的形式(圖6(a))、將串聯(lián)多種核 酸探針的核酸鏈進行固定的形式(圖6(b))、另外還有在所述串聯(lián)多
的形式(圖6 (en等。在多種核酸探針^"列固定t形式(圖6 (a)) 中，當陰性對照數(shù)增加時，也可分成2個或3個區(qū)域進行固定。例如，當陰性對照由8種核酸探針構成時，將每4種混合并固定于2個區(qū)域；或當陰性對照由9種核酸探針構成時，將每3種混合并固定于3個區(qū)域等。當陰性對照數(shù)進一步增加時，還可分成4個、5個或更多區(qū)域進行固定。
在檢查M日趨小型化的現(xiàn)在，各檢查點也表現(xiàn)出微小化的傾向。而且還同時期望進一步增加樣品數(shù)。樣品數(shù)增加導致陰性對照數(shù)增加，但預期將來可實現(xiàn)的在極微小區(qū)域并列混合大量陰性對照時(圖6(a)),一個一個的陰性對照的固定量變少，結果可能檢測不到足夠的信號。但可通過串聯(lián)多種核酸探針，并在空間上展開(圖6 (b))來維持一個一個陰性對照的固定量。從而對于將來預期實現(xiàn)的極微小區(qū)域，也可將大量陰性對照固定于l個區(qū)域上。另外，可通過在串聯(lián)時將各核酸探針末端與其他核酸探針重合來抑制串聯(lián)導致的探針長度增大(圖6 (c))，這尤其對樣品數(shù)增多的情況有效。
圖7
圖7是顯示使用圖5所示用于檢測核酸樣品的設備51檢測多個核酸的方法的模式圖。第三實施方案與第二實施方案的差別在于陰性對照固定區(qū)域由1個區(qū)域構成。可通過使陰性對照固定區(qū)域為1個而顯著節(jié)約陰性對照所必需的基板空間，所述效果會隨著樣品數(shù)的增多而愈加顯著。
同第二實施方案一樣，將加入了用于識別第1~第4核酸樣品的試劑(試劑1 ~ 4 )的第1 ~第4核酸樣品(樣品SI ~ S4 )分別注入第1 ~第4孑L12廣124中。通過設置于第1~第4孔12i 124上的第1~第4注入口 15i 154注入各樣品。例如，將加入了用于識別第l核酸樣品的試劑(試劑1)的第1核酸樣品注入到第1孔12!時，試劑1所含核酸Tl與固定于第1陽性對照固定區(qū)域1^的核酸探針C1雜交(圖7a)。結果，可檢測到來自形成的雜交鏈的信號。而試劑1所含核酸T1不能與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32i的核酸探針C2、 C3和C4中的任一個雜交(圖7b)。結果，不能從第1陰性對照固定區(qū)域32,檢測到信號，從而可確認沒有發(fā)生其他核酸樣品的混入(污染)。圖7顯示了將構成陰性對照的多種核酸探針混合并固定的形式的陰性對照固定區(qū)域，
但其也可以是串聯(lián)多種核酸探針并固定的形式(圖6b)、將多種核酸探 針末端重疊而串聯(lián)并固定的形式(圖6c)中任一種形式的陰性對照固 定區(qū)域。
反之，從第1陰性對照固定區(qū)域32i檢測到信號時，則可檢測出有 其他核酸樣品的混入。例如，當加入了用于識別第2核酸樣品的試劑(試 劑2 )的第2核酸樣品(樣品S2 )混入第1核酸樣品(樣品Sl)中時 (圖7c)，由于第1核酸樣品(樣品Sl)中混入了試劑2所含核酸T2， 從而核酸T2與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32i的核酸探針C2雜交(圖 7d)。結果，可檢測到來自形成的雜交鏈的信號，從而可檢測出有其他 核酸樣品的混入(污染)。
第三實施方案如第二實施方案一樣在可檢測出有無核酸樣品的錯 用的同時，還可檢測出有無污染，因此可提供安全性和可靠性更高的檢 測方法。再者，由于第三實施方案將待固定于陰性對照固定區(qū)域的核酸 探針集中固定于l個區(qū)域，從而即便核酸樣品數(shù)增多，也無需增加陰性 對照固定區(qū)域數(shù)。從而可將檢測基板的大部分區(qū)域分配給檢查項目，因 此即便是檢查項目數(shù)多的核酸樣品檢測，也可實現(xiàn)在小型基板上一次進 行大量檢查。
(4)第四實施方案
圖8
圖8是顯示第四實施方案的用于檢測核酸樣品的設備81的模式圖。 第四實施方案的特征在于同陽性對照用試劑("用于判定陽性對照的試 劑") 一起制備了新的陰性對照用試劑，混合這些"用于判定陰性對照的 試劑，，來檢測是否有其他核酸樣品混入(污染)。
裝置的基本結構與第一 ~第三實施方案相同。即用于檢測核酸樣品 的設備81配備有各設置有用于注入第1~第n核酸樣品的注入口 15^ 的第1~第n孑L 12h。
其中第l孔12i含 用于檢測第1核酸樣品的第1檢測核酸探針固定區(qū)域13i、
34用于識別第l核酸樣品的第1陽性對照固定區(qū)域H和用于檢測第l核酸樣品之外的核酸樣品混入的第1陰性對照固定
區(qū)域32p且
第k(k為2 n的自然數(shù))孑L 12k含用于檢測第k核酸樣品的第k檢測核酸探針固定區(qū)域13k、用于識別第k核酸樣品的第k陽性對照固定區(qū)域14k和用于檢測第k核酸樣品之外的核酸樣品混入的第k陰性對照固定
區(qū)域32k。
向第l核酸樣品中加入用于判定第1陽性對照的試劑和用于判定第1陰性對照的試劑。用于判定第1陽性對照的試劑與第一~第三實施方案中說明的用于識別第l核酸樣品的試劑相同，含"第1陽性對照用核酸"，即與固定于第1陽性對照固定區(qū)域1+的核酸4果4十C1具有互補序列的核酸T1。而用于判定第1陰性對照的試劑含與固定于第2~第n陰性對照固定區(qū)域3221的核酸探針H2 H (n)具有分別互補的序列的核酸U2 U (n)。
同樣，向第k核酸樣品中加入用于判定第k陽性對照的試劑和用于判定第k陰性對照的試劑。用于判定第k陽性對照的試劑含與固定于第k陽性對照固定區(qū)域1《的核酸^:針C (k)具有互補序列的核酸T(k)。而用于判定第k陰性對照的試劑含除與固定于第k (k為2~n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域32k的核酸探針H (k)具有互補序列的核酸U (k)之外的，與固定于第1~第n陰性對照固定區(qū)域32^n的核酸探針H1 H (n)具有分別互補的序列的核酸U1 U (n)。
可通過使用所述用于判定第1 ~第n陽性對照的試劑和用于判定第1~第n陰性對照的試劑來將固定于各陰性對照固定區(qū)域的核酸探針限定為l種。另外，用于判定陽性對照的試劑和用于判定陰性對照的試劑可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制而作為"用于識別核酸樣品的試劑"。另外，"用于識別核酸樣品的試劑，，中可含任意添加劑，例如用于調整鹽濃度的緩沖劑等。
圖8例示了可檢測第1 ~第4 ( n=4 )核酸樣品(核酸樣品Sl-S4)
35的用于檢測核酸樣品的設備81。第1 ~第4孑L 12H上分別設置有用于 注入第1 ~第4核酸樣品的注入口 15w。
"陽性對照固定區(qū)域"上固定有各自不同的用于識別的核酸探針 C1 C4。例如，第1陽性對照固定區(qū)域l+上固定有構成第1陽性對照 的核酸探針C1;第2陽性對照固定區(qū)域142上固定有構成第2陽性對照 的核酸探針C2;第3陽性對照固定區(qū)域143上固定有構成第3陽性對照 的核酸探針C3;第4陽性對照固定區(qū)域144上固定有構成第4陽性對照 的核酸探針C4。
"陰性對照固定區(qū)域"上固定有與固定于"陽性對照固定區(qū)域"的核 酸探針Cl C4不同的用于識別的核酸探針HI ~ H4。例如，第1陰性 對照固定區(qū)域32i上固定有構成第1陰性對照的核酸探針H1;第2陰 性對照固定區(qū)域322上固定有構成第2陰性對照的核酸探4十H2;第3 陰性對照固定區(qū)域323上固定有構成第3陰性對照的核酸探針H3;第4 陰性對照固定區(qū)域324上固定有構成第4陰性對照的核酸探針H4。
用于判定第1 ~第4陽性對照的試劑(試劑1A ~ 4A )與第一 ~第 三實施方案中說明的用于識別第1~第4核酸樣品的試劑相同。
以下對用于判定第1~第4陰性對照的試劑(試劑1B~4B)進行 說明。
首先，用于判定第1陰性對照的試劑(試劑1B)是加入到第l核 酸樣品的試劑。試劑1B是含以下3個核酸U2、 U3、 U4的試劑
核酸U2:與固定于第2陰性對照(NC)固定區(qū)域322的核酸探 針H2具有互補序列的核酸；
核酸U3:與固定于第3陰性對照(NC)固定區(qū)域323的核酸探 針H3具有互補序列的核酸；
核酸U4:與固定于第4陰性對照(NC)固定區(qū)域324的核酸探 針H4具有互補序列的核酸。
將用于判定第1陰性對照的試劑(試劑1B)和用于判定第1陽性 對照的試劑(試劑1A) —同加入第l核酸樣品(樣品S1)中。其中， 試劑1A與試劑1B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如作為"用于識別核酸樣品的試劑1E"。
其次，用于判定第2陰性對照的試劑(試劑2B)是加入到第2核酸樣品的試劑。試劑2B是含以下3個核酸Ul 、 U3 、 U4的試劑
核酸U1:與固定于第1陰性對照(NC)固定區(qū)域32i的核酸探針Hl具有互補序列的核酸；
核酸U3:與固定于第3陰性對照(NC)固定區(qū)域323的核酸探針H3具有互補序列的核酸；
核酸U4:與固定于第4陰性對照(NC)固定區(qū)域324的核酸探針H4具有互補序列的核酸。
將用于判定第2陰性對照的試劑(試劑2B)和用于判定第2陽性對照的試劑(試劑2A) —同加入第2核酸樣品(樣品S2)中。其中，試劑2A與試劑2B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如作為"用于識別核酸樣品的試劑2E"。
再次，用于判定第3陰性對照的試劑(試劑3B)是加入到第3核酸樣品的試劑。試劑3B是含以下3個核酸Ul、 U2、 U4的試劑
核酸U1:與固定于第1陰性對照(NC)固定區(qū)域32i的核酸探針Hl具有互補序列的核酸；
核酸U2:與固定于第2陰性對照(NC)固定區(qū)域322的核酸探針H2具有互補序列的核酸；
核酸U4:與固定于第4陰性對照(NC)固定區(qū)域324的核酸探針H4具有互補序列的核酸。
將用于判定第3陰性對照的試劑(試劑3B)和用于判定第3陽性對照的試劑(試劑3A) —同加入第3核酸樣品(樣品S3)中。其中，試劑3A與試劑3B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如作為"用于識別核酸^"品的試劑3E"。
最后，用于判定第4陰性對照的試劑(試劑4B)是加入到第4核酸樣品的試劑。試劑4B是含以下3個核酸U1、 U2、 U3的試劑
核酸U1:與固定于第1陰性對照(NC)固定區(qū)域32i的核酸探針Hl具有互補序列的核酸；
37核酸U2:與固定于第2陰性對照(NC)固定區(qū)域322的核酸探 針H2具有互補序列的核酸；
核酸U3:與固定于第3陰性對照(NC)固定區(qū)域323的核酸探 針H3具有互補序列的核酸。
將用于判定第4陰性對照的試劑(試劑4B)和用于判定第4陽性 對照的試劑(試劑4A) —同加入第4核酸樣品(樣品S4)中。其中， 試劑4A與試劑4B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如 作為"用于識別核酸樣品的試劑4E"。 圖9
圖9是顯示使用圖8所示用于檢測核酸樣品的設備81檢測多個核 酸的方法的^t式圖。
將加入了試劑1A和1B的第1核酸樣品(樣品Sl )通過注入口 15i 注入到孔12i中。此時，試劑1A所含核酸T1與固定于陽性對照固定區(qū) 域1^的核酸探針C1雜交，從而檢測到源自所述雜交鏈的信號(圖9a)。 而試劑1B所含核酸U2、 U3、 U4均不能與固定于陰性對照固定區(qū)域32i 的核酸探針Hl雜交，從而不能從陰性對照固定區(qū)域檢測到信號(圖 9b )。
同樣，將加入了試劑2A和2B的第2核酸樣品(樣品S2 )通過注 入口 152注入到孔122中。此時，試劑2A所含核酸T2與固定于陽性對 照固定區(qū)域142的核酸探針C2雜交，從而檢測到源自所述雜交鏈的信 號(圖9c)。而試劑2B所含核酸U1、 U3、 U4均不能與固定于陰性對 照固定區(qū)域322的核酸探針H2雜交，從而不能從陰性對照固定區(qū)域檢 測到信號(圖9d)。相同的反應機制對于以下第3核酸樣品(樣品S3)、 第4核酸樣品(樣品S4)也成立。
現(xiàn)對第1核酸樣品(樣品Sl)中混入第2核酸樣品(樣品S2 )(污 染)的情況進行說明(圖9e)。樣品S2混入樣品Sl時，加入到樣品S2 中的試劑2B所含核酸U1與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32j的核酸探 針H1雜交，從而檢測到源自所述雜交鏈的信號(圖9f)?？赏ㄟ^從陰 性對照固定區(qū)域32i檢測到信號來確認有其他核酸樣品混入(污染)。第四實施方案的特征在于配制新的用于判定陰性對照的試劑而將
固定于第1~第n陰性對照固定區(qū)域的核酸探針數(shù)分別限制為l種。在第四實施方案中，即便核酸樣品數(shù)增加，固定于各陰性對照固定區(qū)域的核酸探針數(shù)仍為1種。從而無需隨著核酸樣品數(shù)的增減而對陰性對照固定區(qū)域進行設計上的變更，從而可簡便且快速地提供用于檢測大量核酸探針的設備。
(5)第五實施方案圖10
圖IO是顯示第五實施方案的多核酸檢測方法的模式圖。第五實施方案與第四實施方案的差異在于所使用的用于判定陰性對照的試劑。在
第五實施方案中使用的用于判定陰性對照的試劑含具有使固定于陰性對照固定區(qū)域的核酸探針H1 H (n)與用于判定陽性對照的試劑所含核酸Tl T(n)串聯(lián)的接頭序列的核酸V1 V (n)。由于通過使用所述具有接頭序列的核酸V1~V (n)(以下筒稱接頭序列V1~V (n))可加長由陰性對照形成的雜交鏈的長度，從而可使檢測敏感度更高。
第五實施方案同第四實施方案一樣可使用圖8所示用于檢測核酸樣品的設備81。以下例示第五實施方案的使用用于檢測核酸樣品的設備81檢測第1~第4核酸樣品的方法。
首先對用于判定第1~第4陰性對照的試劑(試劑1B 4B)進行說明。
用于判定第1陰性對照的試劑(試劑1B)是加入到第l核酸樣品的試劑。試劑1B是含核酸V2、 V3、 V4的試劑。
核酸V2的一端具有與固定于第2陰性對照固定區(qū)域322的核酸探針H2互補的序列、且另一端具有與和固定于第2陽性對照固定區(qū)域142的核酸探4十C2雜交的"核酸T2"互補的序列。
核酸V3的一端具有與固定于第3陰性對照固定區(qū)域323的核酸探針H3互補的序列、且另一端具有與和固定于第3陽性對照固定區(qū)域143的核酸探4十C3雜交的"核酸T3"互補的序列。
核酸V4的一端具有與固定于第4陰性對照固定區(qū)域324的核酸
39探針H4互補的序列、且另一端具有與和固定于第4陽性對照固定區(qū) 域144的核酸探針C4雜交的"核酸T4"互補的序列。 將用于判定第1陰性對照的試劑(試劑1B)和用于判定笫1陽性 對照的試劑(試劑1A) —同加入第l核酸樣品(樣品S1)中。其中， 試劑1A與試劑1B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如 作為"用于識別核酸樣品的試劑1E"。
其次，用于判定第2陰性對照的試劑(試劑2B)是加入到第2核 酸樣品的試劑。試劑2B是含核酸V1、 V3、 V4的試劑。
核酸V1的一端具有與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32!的核酸 探針H1互補的序列、且另一端具有與和固定于第1陽性對照固定區(qū) 域1+的核酸探針Cl雜交的"核酸Tl，，互補的序列。
核酸V3的一端具有與固定于第3陰性對照固定區(qū)域323的核酸 探針H3互補的序列、且另一端具有與和固定于第3陽性對照固定區(qū) 域143的核酸探針C3雜交的"核酸T3，，互補的序列。
核酸V4的一端具有與固定于第4陰性對照固定區(qū)域324的核酸 探針H4互補的序列、且另一端具有與和固定于第4陽性對照固定區(qū) 域144的核酸探針C4雜交的"核酸T4"互補的序列。 將用于判定第2陰性對照的試劑(試劑2B)和用于判定第2陽性 對照的試劑(試劑2A) —同加入第2核酸樣品(樣品S2)中。其中， 試劑2A與試劑2B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如 作為"用于識別核酸樣品的試劑2E"。
再次，用于判定第3陰性對照的試劑(試劑3B)是加入到第3核 酸樣品的試劑。試劑3B是含核酸V1、 V2、 V4的試劑。
核酸V1的一端具有與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32i的核酸 探針H1互補的序列、且另一端具有與和固定于第1陽性對照固定區(qū) 域14!的核酸探針Cl雜交的"核酸Tl"互補的序列。
核酸V2的一端具有與固定于第2陰性對照固定區(qū)域322的核酸 探針H2互補的序列、且另一端具有與和固定于第2陽性對照固定區(qū) 域142的核酸探針C2雜交的"核酸T2"互補的序列。
40核酸V4的一端具有與固定于第4陰性對照固定區(qū)域324的核酸探針H4互補的序列、且另一端具有與和固定于第4陽性對照固定區(qū)域144的核酸探針C4雜交的"核酸T4"互補的序列。將用于判定第3陰性對照的試劑(試劑3B)和用于判定第3陽性對照的試劑(試劑3A) —同加入第3核酸樣品(樣品S3)中。其中，試劑3A與試劑3B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如作為"用于識別核酸樣品的試劑3E"。
最后，用于判定第4陰性對照的試劑(試劑4B)是加入到第4核酸樣品的試劑。試劑4B是含核酸V1、 V2、 V3的試劑。
核酸V1的一端具有與固定于第1陰性對照固定區(qū)域32i的核酸探針H1互補的序列、且另一端具有與和固定于第1陽性對照固定區(qū)域1+的核酸探針Cl雜交的"核酸Tl"互補的序列。
核酸V2的一端具有與固定于第2陰性對照固定區(qū)域322的核酸探針H2互補的序列、且另一端具有與和固定于第2陽性對照固定區(qū)域142的核酸探針C2雜交的"核酸T2，，互補的序列。
核酸V3的一端具有與固定于第3陰性對照固定區(qū)域323的核酸探針H3互補的序列、且另一端具有與和固定于第3陽性對照固定區(qū)域143的核酸探針C3雜交的"核酸T3"互補的序列。將用于判定第4陰性對照的試劑(試劑4B)和用于判定第4陽性對照的試劑(試劑4A) —同加入第4核酸樣品(樣品S4)中。其中，試劑4A與試劑4B可為獨立的試劑，也可從一開始就混合配制，例如作為"用于識別核酸樣品的試劑4E"。
其次對第五實施方案的檢測原理進行說明。
將加入了試劑1A和1B的第1核酸樣品(樣品Sl )通過注入口 15i注入到孔12i中。此時，試劑1A所含核酸T1與固定于陽性對照固定區(qū)域1^的核酸探針C1雜交，從而檢測到源自所述雜交鏈的信號(圖10a )。而試劑1B所含核酸V2 、 V3、 V4均不能與固定于陰性對照固定區(qū)域32j的核酸探針Hl雜交，從而不能從陰性對照固定區(qū)域檢測到信號(圖10b )。同樣，將加入了試劑2A和2B的第2核酸樣品(樣品S2 )通過注 入口 152注入到孔122中。此時，試劑2A所含核酸T2與固定于陽性對 照固定區(qū)域142的核酸探針C2雜交，從而檢測到源自所述雜交鏈的信 號(圖10c)。而試劑2B所含核酸V1、 V3、 V4均不能與固定于陰性對 照固定區(qū)域322的核酸探針H2雜交，從而不能從陰性對照固定區(qū)域檢 測到信號(圖10d )。相同的反應機制對于以下第3核酸樣品(樣品S3 )、 第4核酸樣品(樣品S4 )也成立。
現(xiàn)對第1核酸樣品(樣品Sl)中混入第2核酸樣品(樣品S2 )(污 染)的情況進行說明(圖10e)。樣品S2混入樣品Sl時，加入到樣品 S2中的試劑2B所含核酸V1在其一端與固定于第1陰性對照固定區(qū)域 32i的核酸探針Hl雜交。此時試劑1A所含核酸T1與核酸V1的另一 端單鏈部分雜交，從而形成整體的長雙鏈區(qū)域(圖10f)。采用特異性識 別雙鏈區(qū)域的檢測方法時，例如使用電化學方法，由于長的雙鏈區(qū)域可 結合更多嵌入劑，從而可檢測到的電量變多，結果實現(xiàn)更高的檢測靈敏 度。從而可更精確并可靠檢測出有無其他核酸樣品的混入(污染)。
圖11
圖ll是顯示圖IO所示用于判定陰性對照的試劑中構成用于判定第 1陰性對照的試劑(試劑1B)的核酸形式的模式圖。
試劑1B中有將試劑1B中所含核酸V2、 V3、 V4作為各自獨立的 核酸配制的形式(圖lla)、作為互相串聯(lián)的1個核酸配制的形式(圖 lib )和通過設計為將各核酸探針的末端與其他核酸探針末端重疊而相 互串聯(lián)，從而將序列全長縮短的形式(圖llc)。當然對于用于判定第2~ 第n陰性對照的試劑(試劑2B~ (n) B)也具有同樣形式。
隨著核酸樣品數(shù)的增加，用于判定陰性對照的試劑中所含核酸種類 也增加。可通過串聯(lián)各核酸試劑(圖lib)而減少獨立的核酸種類，從 而可快速且容易地提供用于判定陰性對照的試劑。另外，在各核酸串聯(lián) 的情況下，可通過將其末端重疊(圖llc)而縮短各核酸的全長，這對 于核酸樣品數(shù)增加的情況尤其有效。 (6)用于檢測核酸樣品的試劑盒
42可提供可用于上述第一 ~第五實施方案的用于檢測核酸樣品的試劑盒。用于檢測核酸樣品的試劑盒中含可用于第一 第五實施方案的用
于檢測核酸樣品的設備和用于識別第1 ~第n (n為大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的試劑。在用于檢測核酸樣品的設備的檢測核酸探針固定區(qū)域上固定有與作為被檢對象的特定疾病基因具有互補序列的核酸探針，通過將多核酸樣品用試劑盒所含用于識別核酸樣品的試劑處理后，注入用于檢測核酸樣品的設備而同時且快速得到檢測結果。
試劑盒中所含用于檢測核酸樣品的設備可為用于檢測1個核酸樣品的各檢測行道整體形成于一個基板上，或各檢測行道形成于獨立的基板上。例如，可為檢測8個核酸樣品而使用2個含4個檢測行道的基板；也可為檢測9個的核酸樣品而使用3個含3個檢測行道的基板。
另夕卜，用于識別第1~第n核酸樣品的試劑可由各自獨立的用于判定第1~第n陽性對照的試劑和用于判定第1~第n陰性對照的試劑構成，也可有任意的添加劑(如用于調節(jié)鹽濃度的緩沖劑等)作為試劑存在。
實施例
實施例1(第一實施方案)1.所用儀器、所用材料等
(1) 用于檢測核酸樣品的設備
本實施例中使用的用于檢測核酸樣品的設備的基本結構如圖1所示。即在各孔中形成1個陽性對照固定區(qū)域和1個以上的檢測核酸探針固定區(qū)域。在本實施例中，如圖1所示，檢測項目數(shù)為4，在各孔中形成各自獨立固定了核酸探針Dl ~ D4的4個檢測核酸探針固定區(qū)域。
另夕卜，本實施例中使用了可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備。即各孔中形成的多個核酸探針固定區(qū)域均具有金電極，可檢測源自形成于各固定區(qū)域的雙鏈核酸的電信號?？捎商禺愋越Y合雙鏈核酸的嵌入劑得到電信號。本實施例中使用"Hoechst33258"作為嵌入劑。
(2) 核酸探針固定于陽性對照固定區(qū)域14^4的核酸探針C1 C4的序列如下 Cl: TTCAGTTATGTGGATGAT C2: TCAGTTATGTCGATGATG C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG。
固定于檢測核酸探針固定區(qū)域13卜4的核酸探針Dl ~D4的序列如
下
Dl: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT 。
(3) 用于判定的試劑
陽性對照判定試劑(試劑1 ~ 4 )所含核酸Tl ~ T4的序列如下 試劑1 (含核酸Tl (與Cl互補的序列)) 試劑2 (含核酸T2 (與C2互補的序列)) 試劑3 (含核酸T3 (與C3互補的序列)) 試劑4 (含核酸T4 (與C4互補的序列))
(4) 核酸樣品
作為4皮檢對象的第1~第4核酸樣品(樣品S1~S4)的序列含以 下序列
樣品Sl:(含與檢測核酸探針Dl互補的序列) 樣品S2:(含與檢測核酸探針D2互補的序列) 樣品S3:(含與檢測核酸探針D3互補的序列) 樣品S4:(含與檢測核酸探針D4互補的序列) 2.實驗步驟
向第1~第4核酸樣品(樣品S1~S4)中同用于調節(jié)鹽濃度的緩 沖劑一起分別加入陽性對照判定試劑(試劑1 ~ 4 )。然后將樣品SI ~ S4 分別通過注入口注入第1~第4孔中。注入各樣品后，于45。C下進行 10分鐘的雜交反應，接下來向各孔中加入用于洗滌的緩沖劑，并于30°C
44下進行10分鐘的洗滌反應，以除去非特異性吸附的核酸。隨后檢測第 1~第4各孔中的陽性對照固定區(qū)域上有無反應，并檢測第1~第4各 孔中的檢測核酸探針固定區(qū)域上有無反應。檢測有無反應是通過向各孔 中注入嵌入劑分子(50nM Hoechst 33258),向各電極施加電壓，并測 定嵌入劑分子的氧化電流來進行的。
隨后為模擬樣品錯用，故意將S1和S2調換，并同樣進行反應。 顯示電流值的測定結果的圖像如圖13所示。
3，實驗結果
圖12是將分別從樣品SI ~ S4檢測出的電流值以柱形圖表示的圖。 SI ~ S4是指第1 ~第4各核酸樣品SI ~ S4。陽性對照用探針(PCP ) 是指固定于陽性對照固定區(qū)域的核酸探針，展示了固定于各孔中的核酸 探針C1~C4的電流值。檢測用探針(DP)是指固定于檢測核酸探針 固定區(qū)域的核酸探針，展示了固定于各孔中的4個核酸探針D1 ~D4的 電流值。
本實施例中使用的可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備 在核酸形成雙鏈時可檢測到特定閾值以上的電流值。反之，當未形成雙 鏈時可檢測到閾值以下的電流值?？蓹z測到小電流值的原因被認為是通 過洗滌操作未完全除去的非特異性吸附的核酸所致。
如圖12所示，從全部4個孔的陽性對照用探針(PCP)得到閾值 以上的電流值，從而可確認無各核酸樣品間的錯用。其中所述閾值是 40nA，而在核酸樣品Sl中檢測到的電流值是61nA，在核酸樣品S2中 檢測到的電流值是72nA ，在核酸樣品S3中檢測到的電流值是62nA ， 在核酸樣品S4中檢測到的電流值是69nA。
從而可從得自檢測核酸探針固定區(qū)域D1~D4的電流值表征各核 酸樣品所含核酸的序列。即對于核酸樣品Sl,由于可從核酸探針D1檢 測到82nA，從而可確認核酸樣品Sl中含與核酸探針Dl互補的序列。 而對于核酸樣品S2，由于可從核酸探針D2檢測到62nA,從而可確認 核酸樣品S2中含與核酸探針D2互補的序列。而對于核酸樣品S3，由 于可從核酸探針D3檢測到73nA，從而可確認核酸樣品S3中含與核酸探針D3互補的序列。而對于核酸樣品S4，由于可從核酸探針D4檢測 到66nA，從而可確認核酸樣品S4中含與核酸探針D4互補的序列。
如圖13所示，從第l孔和第2孔中的陽性對照用探針(PCP)上 得不到閾值以上的電流值，從而可確證有核酸樣品錯用。其中所述閾值 是40nA,而在核酸樣品Sl中檢測到的電流值是19nA，在核酸樣品S2 中檢測到的電流值是17nA，在核酸樣品S3中檢測到的電流值是70nA， 在核酸樣品S4中檢測到的電流值是72nA。
此外，可確認核酸樣品S3、 S4間無樣品錯用，從而可得到正確的 檢查結果。即對于核酸樣品S3，由于可從核酸探針D3檢測到66nA， 從而可確認核酸樣品S3中含與核酸探針D3互補的序列。而對于核酸 樣品S4，由于可從核酸探針D4檢測到73nA，從而可確認核酸樣品S4 中含與核酸探針D4互補的序列。
實施例2 (第二實施方案)
1.所用儀器、所用材料等
(1) 用于檢測核酸樣品的設備 本實施例中使用的用于檢測核酸樣品的設備的基本結構如圖3所
示。即在各孔中形成l個陽性對照固定區(qū)域、3個陰性對照固定區(qū)域和 1個以上的檢測核酸探針固定區(qū)域。在本實施例中，如圖3所示，檢測 項目數(shù)為4 ，在各孔中形成各自獨立固定了核酸探針Dl ~ D4的4個檢 測核酸探針固定區(qū)域。另夕卜，本實施例中同實施例l一樣使用了可進行 電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備。
(2) 核酸探4f、用于判定的試劑
均如實施例1中所示。其中實施例2中使用了陰性對照固定區(qū)域 32"4。固定于陰性對照固定區(qū)域32h4的核酸探針C1 C4與固定于陽 性對照固定區(qū)域14"4的核酸探4十Cl ~ C4相同。 (3 )核酸樣品
作為被檢對象的第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)的序列含以 下序列
樣品Sl:(含與檢測核酸探針Dl互補的序列)
46樣品S2:(含與檢測核酸探針D2互補的序列) 樣品S3:(含與檢測核酸探針D3互補的序列) 樣品S4:(含與檢測核酸探針D4互補的序列)
2. 實驗步驟
向第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)中同用于調節(jié)鹽濃度的緩 沖劑一起分別加入陽性對照判定試劑(試劑1 ~ 4 )。然后將樣品SI ~ S4 分別通過注入口注入第1 ~第4孔中，但為模擬樣品混入，向第1孔中 注入故意混合S1和S2的樣品(Sl+S2)。注入各樣品后，于45。C下進 行10分鐘的雜交反應，接下來向各孔中加入用于洗滌的緩沖劑，并于 30。C下進行10分鐘的洗滌反應，以除去非特異性吸附的核酸。隨后檢 測第1~第4各孔中的陽性對照固定區(qū)域上有無反應，檢測第1~第4 各孔中的陰性對照固定區(qū)域上有無反應，并檢測第l-第4各孔中的檢 測核酸探針固定區(qū)域上有無反應。檢測有無反應同實施例1一樣，是通 過向各孔中注入嵌入劑分子(50nM Hoechst 33258 )，向各電極施加電 壓，并測定嵌入劑分子的氧化電流來進行的。顯示電流值的測定結果的 圖像如圖14所示。
3. 實驗結果
圖13是將分別從樣品SI ~ S4檢測出的電流值以柱形圖表示的圖。 SI ~ S4是指第1 ~第4各核酸樣品SI ~ S4。陽性對照用探針(PCP) 是指固定于陽性對照固定區(qū)域的核酸探針，顯示了固定于各孔中的核酸 探針Cl ~ C4的電流值。陰性對照用探針(NCP )是指固定于陰性對照 固定區(qū)域的核酸探針，表示固定于各孔中的核酸探針C1~C4的電流 值。檢測用探針(DP)是指固定于檢測核酸探針固定區(qū)域的核酸探針， 表示固定于各孔中的4個核酸探針D1 ~D4的電流值。
本實施例中使用的可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備 同實施例1一樣，在核酸形成雙鏈時可檢測到特定閾值以上的電流值； 反之，當未形成雙鏈時可檢測到閾值以下的電流值。
如圖14所示，從全部4個孔的陽性對照用探針(PCP)得到閾值 以上的電流值，從而可確認無各核酸樣品間的錯用。其中所述閾值是
4740nA,而在核酸樣品Sl中檢測到的電流值是71nA，在核酸樣品S2中 檢測到的電流值是66nA，在核酸樣品S3中檢測到的電流值是70nA, 在核酸樣品S4中檢測到的電流值是73nA。
另夕卜，可通過從第1孔的陰性對照用探針(NCP)得到閾值以上的 電流值來確證有其他核酸樣品的混入(污染)。
此外，可確認核酸樣品S2、 S3、 S4中無樣品混入，從而可得到正 確的檢查結果。即對于核酸樣品S2，由于可從核酸探針D2檢測到72nA， 從而可確認核酸樣品S2中含與核酸探針D2互補的序列。而對于核酸 樣品S3,由于可從核酸探針D3檢測到69nA,從而可確認核酸樣品S3 中含與核酸探針D3互補的序列。而對于核酸樣品S4，由于可從核酸探 針D4檢測到72nA，從而可確認核酸樣品S4中含與核酸探針D4互補 的序列。
實施例3(第三實施方案)
1.所用儀器、所用材料等
(1) 用于檢測核酸樣品的設備 本實施例中使用的用于檢測核酸樣品的設備的基本結構如圖5所
示。即在各孔中形成l個陽性對照固定區(qū)域、l個陰性對照固定區(qū)域和 1個以上的檢測核酸探針固定區(qū)域。在1個陰性對照固定區(qū)域混合固定 有3種不同的核酸探針 。在本實施例中，如圖5所示，檢測項目數(shù)為4， 在各孔中形成各自獨立固定了核酸探針Dl ~ D4的4個檢測核酸探針固 定區(qū)域。另夕卜，本實施例中同實施例l和2—樣使用了可進行電化學檢 測的用于檢測核酸樣品的設備。
(2) 核酸探針、用于判定的試劑
均如實施例1中所示。其中實施例3中使用了陰性對照固定區(qū)域 32^4。固定于陰性對照固定區(qū)域32^4的核酸探針C1 C4與固定于陽 性對照固定區(qū)域14卜4的核酸探針Cl ~ C4相同。
(3) 核酸樣品
作為被檢對象的第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)的序列含以 下序列樣品Sl:(含與檢測核酸探針Dl互補的序列) 樣品S2:(含與檢測核酸探針D2互補的序列) 樣品S3:(含與檢測核酸探針D3互補的序列) 樣品S4:(含與檢測核酸探針D4互補的序列)
2. 實驗步驟
向第1~第4核酸樣品(樣品S1~S4)中同用于調節(jié)鹽濃度的緩 沖劑一起分別加入陽性對照判定試劑(試劑1 ~ 4 )。然后將樣品SI ~ S4 分別通過注入口注入第1 ~第4孔中，但為模擬樣品錯用，故意調換注 入S3和S4。注入各樣品后，于45。C下進行10分鐘的雜交反應，接下 來向各孔中加入用于洗滌的緩沖劑，并于30。C下進行10分鐘的洗滌反 應，以除去非特異性吸附的核酸。隨后檢測第1~第4各孔中的陽性對 照固定區(qū)域上有無反應，檢測第1~第4各孔中的陰性對照固定區(qū)域上 有無反應，并檢測第1 ~第4各孔中的檢測核酸探針固定區(qū)域上有無反 應。檢測有無反應同實施例1 一樣，是通過向各孔中注入嵌入劑分子 (50nM Hoechst 33258 )，向各電極施加電壓，并測定嵌入劑分子的氧 化電流來進行的。顯示電流值的測定結果的圖像如圖15所示。
3. 實驗結果
圖15所示各標記與圖14相同。在本實施例中，在l個陽性對照固 定區(qū)域混合固定有3種不同的核酸探針。
本實施例中使用的可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備 同實施例1和2 —樣，在核酸形成雙鏈時可檢測到特定閾值以上的電流 值；反之，當未形成雙鏈時可檢測到閾值以下的電流值。
如圖15所示，不能從第3孔和第4孔中的陽性對照用探針(PCP) 上得到閾值以上的電流值，從而可確證有核酸樣品錯用。其中所述閾值 是40nA，而在核酸樣品Sl中檢測到的電流值是62nA，在核酸樣品S2 中檢測到的電流值是68nA，在核酸樣品S3中檢測到的電流值是22nA， 在核酸樣品S4中檢測到的電流值是25nA。
另夕卜，從第3孔和第4孔中的陰性對照用探針(NCP )上得到閾值 以上的電流值，從此結果也可確證有核酸樣品4昔用。
49此外，可確認核酸樣品S1、 S2無污染，從而可得到正確的檢查結 果。即對于核酸樣品S1，由于可從核酸探針D1檢測到65nA，從而可 確認核酸樣品Sl中含與核酸探針D1互補的序列。而對于核酸樣品S2, 由于可從核酸探針D2檢測到72nA，從而可確認核酸樣品S2中含與核 酸探針D2互補的序列。
實施例4(第四實施方案)
1.所用儀器、所用材料等
(1) 用于檢測核酸樣品的設備
本實施例中除使用實施例1~3中使用的用于判定陽性對照的試劑 1A ~ 4A之外，還使用用于判定陰性對照的試劑IB ~ 4B來檢測有無被 檢物的錯用或污染。
本實施例中使用的用于檢測核酸樣品的設備的基本結構如圖8所 示。即在各孔中形成l個陽性對照固定區(qū)域、l個陰性對照固定區(qū)域和 1個以上的檢測核酸探針固定區(qū)域。在1個陰性對照固定區(qū)域上固定有 與固定于陽性對照固定區(qū)域的核酸探針Cl ~ C4不同的核酸探針HI ~ H4。核酸探針HI ~ H4可由陰性對照用試劑IB ~ 4B進行檢測。在本實 施例中，如圖8所示，檢測項目數(shù)為4，在各孔中形成各自獨立固定了 核酸探針D1 D4的4個檢測核酸探針固定區(qū)域。另夕卜，本實施例中同 實施例1 3 —樣使用了可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備。
(2) 核酸探針
固定于陽性對照固定區(qū)域14卜4的核酸探針C1 C4的序列如下(同 實施例1 ):
Cl: TTCAGTTATGTGGATGAT C2: TCAGTTATGTCGATGATG C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
固定于陰性對照固定區(qū)域32i -4的核酸探針HI ~ H4的序列如下 HI: TCCGGGCGCAGAAAC H2: GTGCTGCAGGTGCG
50H3: CGTGATGACACCAAG H4: ATGCTTTCCGTGGCA
固定于檢測核酸探針固定區(qū)域13"4的核酸探針Dl ~D4的序列如 下(同實施例1):
Dl: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
(3) 用于判定的試劑
陽性對照判定試劑(試劑1A ~ 4A)所含核酸Tl ~ T4的序列如下 試劑1A (含核酸T1 (與Cl互補的序列)) 試劑2A (含核酸T2 (與C2互補的序列)) 試劑3A (含核酸T3 (與C3互補的序列)) 試劑4A (含核酸T4 (與C4互補的序列))
陰性對照判定試劑(試劑IB ~ 4B )所含核酸Ul ~ U4的序列如下 試劑1B (含核酸Ul (與Hl互補的序列)) 試劑2B (含核酸U2 (與H2互補的序列)) 試劑3B (含核酸U3 (與H3互補的序列)) 試劑4B (含核酸U4 (與H4互補的序列))
(4) 核酸樣品
作為被檢對象的第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)的序列含以 下序列
樣品Sl:(含與檢測核酸探針Dl互補的序列) 樣品S2:(含與檢測核酸探針D2互補的序列) 樣品S3:(含與檢測核酸探針D3互補的序列) 樣品S4:(含與檢測核酸探針D4互補的序列) 2.實驗步驟
向第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)中同用于調節(jié)鹽濃度的緩 沖劑一起分別加入陽性對照判定試劑(試劑1A~4A)和陰性對照判定試劑(試劑IB ~ 4B )。然后將樣品SI ~ S4分別通過注入口注入第1 ~ 第4孔中。注入各樣品后，于45°〇下進行10分鐘的雜交反應，接下來 向各孔中加入用于洗滌的緩沖劑，并于30。C下進行10分鐘的洗滌反應， 以除去非特異性吸附的核酸。隨后檢測第1~第4各孔中的陽性對照固 定區(qū)域上有無反應，檢測笫1~第4各孔中的陰性對照固定區(qū)域上有無 反應，并檢測第1~第4各孔中的檢測核酸探針固定區(qū)域上有無反應。 檢測有無反應同實施例1 一樣，是通過向各孔中注入嵌入劑分子(50nM Hoechst 33258),向各電極施加電壓，并測定嵌入劑分子的氧化電流來 進行的。顯示電流值的測定結果的圖像如圖16所示。
然后，為模擬樣品錯用，故意調換S1和S2而進行同樣的檢測。 顯示電流值的測定結果的圖像如圖17所示。
3.實驗結果
圖16所示各標記與圖14和15相同。在本實施例的陰性對照固定 區(qū)域上固定有與固定于陽性對照固定區(qū)域的核酸探針C1~C4不同的 核酸探針HI ~ H4。
本實施例中使用的可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備 同實施例1~3—樣，在核酸形成雙鏈時可檢測到特定閾值以上的電流 值；反之，當未形成雙鏈時可檢測到閾值以下的電流值。
如圖16所示，從全部4個孔的陽性對照用探針(PCP)得到閾值 以上的電流值，從而可確認無各核酸樣品間的錯用。其中所述閾值是 40nA，而在核酸樣品S1中檢測到的電流值是60nA,在核酸樣品S2中 檢測到的電流值是72nA，在核酸樣品S3中4企測到的電流值是68nA, 在核酸樣品S4中檢測到的電流值是71nA。
另夕卜，從全部4個孔的陰性對照用探針(NCP)上得不到閾值40nA 以上的電流值，從而可確認無其他核酸樣品的混入(污染)。
從而可從得自檢測核酸探針固定區(qū)域D1~D4的電流值表征各核 酸樣品所含核酸的序列。即對于核酸樣品S1，由于可從核酸探針D1檢 測到56nA，從而可確認核酸樣品Sl中含與核酸探針D1互補的序列。 而對于核酸樣品S2，由于可從核酸探針D2檢測到67nA，從而可確認
52核酸樣品S2中含與核酸探針D2互補的序列。而對于核酸樣品S3，由 于可從核酸探針D3檢測到56nA，從而可確認核酸樣品S3中含與核酸 探針D3互補的序列。而對于核酸樣品S4，由于可從核酸探針D4檢測 到72nA，從而可確認核酸樣品S4中含與核酸探針D4互補的序列。
再如圖17所示，從第1孔和第2孔中的陽性對照用探針(PCP) 上得不到閾值以上的電流值，從而可確證有核酸樣品錯用。其中所述閾 值是40nA，而在核酸樣品Sl中檢測到的電流值是18nA，在核酸樣品 S2中檢測到的電流值是16nA，在核酸樣品S3中檢測到的電流值是 78nA，在核酸樣品S4檢測到的電流值是81nA。
此外，可確認核酸樣品S3、 S4中無樣品4晉用，從而可得到正確的 檢查結果。即對于核酸樣品S3，由于可從核酸探針D3檢測到62nA， 從而可確認核酸樣品S3中含與核酸探針D3互補的序列。而對于核酸 樣品S4,由于可從核酸探4十D4檢測到71nA，從而可確i人核酸樣品S4 中含與核酸探針D4互補的序列。
實施例5(第五實施方案)
1.所用儀器、所用材料等
(1) 用于檢測核酸樣品的設備 本實施例中除使用實施例1~4中使用的用于判定陽性對照的試劑
1A ~ 4A之外，還使用用于判定陰性對照的試劑IB ~ 4B來檢測有無被 檢物的錯用或污染。
本實施例中使用的用于檢測核酸樣品的設備的基本結構如圖8所 示。即在各孔中形成l個陽性對照固定區(qū)域、l個陰性對照固定區(qū)域和 1個以上的檢測核酸探針固定區(qū)域。在1個陰性對照固定區(qū)域上固定有 與固定于陽性對照固定區(qū)域的核酸探針C1 C4不同的核酸探針H1 H4。核酸探針HI ~ H4可由陰性對照用試劑IB ~ 4B進行檢測。在本實 施例中，如圖8所示，檢測項目數(shù)為4，在各孔中形成各自獨立固定了 核酸探針D1 D4的4個檢測核酸探針固定區(qū)域。另夕卜，本實施例中同 實施例1~4 一樣使用了可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備。
(2) 核酸探針固定于陽性對照固定區(qū)域-4的核酸探針CI ~ C4的序列如下(同 實施例1):
CI: TTCAGTTATGTGGATGAT C2: TCAGTTATGTCGATGATG C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
固定于陰性對照固定區(qū)域32!—4的核酸探針HI ~ H4的序列如下 HI: TCCGGGCGCAGAAAC H2: GTGCTGCAGGTGCG H3: CGTGATGACACCAAG H4: ATGCTTTCCGTGGCA
固定于檢測核酸探針固定區(qū)域13"4的核酸探針Dl ~D4的序列如 下(同實施例1):
Dl: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT D4. AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。 陽性對照判定試劑(試劑1A ~ 4A)所含核酸Tl ~ T4的序列如下 試劑1A (含核酸Tl (與CI互補的序列)) 試劑2A (含核酸T2 (與C2互補的序列)) 試劑3A (含核酸T3 (與C3互補的序列)) 試劑4A (含核酸T4 (與C4互補的序列))
陰性對照判定試劑(試劑IB ~ 4B)所含核酸VI ~ V4的序列如下 試劑IB (含核酸V1 (與HI互補的序列+與Tl互補的序列)) 試劑2B (含核酸V2 (與H2互補的序列+與T2互補的序列)) 試劑3B (含核酸V3 (與H3互補的序列+與T3互補的序列)) 試劑4B (含核酸V4 (與H4互補的序列+與T4互補的序列))。 (4)核酸樣品
作為^皮檢對象的第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)的序列含以下序列
樣品Sl:(含與檢測核酸探針Dl互補的序列) 樣品S2:(含與檢測核酸探針D2互補的序列) 樣品S3:(含與檢測核酸探針D3互補的序列) 樣品S4:(含與檢測核酸探針D4互補的序列)
2. 實驗步驟
向第1~第4核酸樣品(樣品S1 S4)中同用于調節(jié)鹽濃度的緩 沖劑一起分別加入陽性對照判定試劑(試劑1A~4A)和陰性對照判定 試劑(試劑IB ~ 4B )。然后將樣品SI ~ S4分別通過注入口注入第1 ~ 第4孔中，但為模擬樣品混入，向第3孔中注入故意混合S3和S4的樣 品(S3+S4)。注入各樣品后，于45。C下進行10分鐘的雜交反應，接下 來向各孔中加入用于洗滌的緩沖劑，并于3(TC下進行10分鐘的洗滌反 應，以除去非特異性吸附的核酸。隨后檢測第1~第4各孔中的陽性對 照固定區(qū)域上有無反應，檢測第1~第4各孔中的陰性對照固定區(qū)域上 有無反應，并檢測第1 ~第4各孔中的檢測核酸探針固定區(qū)域上有無反 應。檢測有無反應同實施例1 一樣，是通過向各孔中注入嵌入劑分子 (50jiM Hoechst 33258 )，向各電極施加電壓，并測定嵌入劑分子的氧 化電流來進行的。顯示電流值的測定結果的圖像如圖18所示。
3. 實驗結果
圖18所示各標記與圖17相同。在本實施例的陰性對照固定區(qū)域上 固定有與固定于陽性對照固定區(qū)域的核酸探針Cl-C4不同的核酸探 針H1 H4。
本實施例中使用的可進行電化學檢測的用于檢測核酸樣品的設備 同實施例l-4一樣，在核酸形成雙鏈時可檢測到特定閾值以上的電流 值；反之，當未形成雙鏈時可檢測到閾值以下的電流值。
如圖18所示，從全部4個孔的陽性對照用探針(PCP)得到閾值 以上的電流值，從而可確認無各核酸樣品間的4晉用。其中所述閾值是 40nA，而在核酸樣品S1中檢測到的電流值是66nA，在核酸樣品S2中 檢測到的電流值是65nA,在核酸樣品S3中檢測到的電流值是77nA，
55在核酸樣品S4中檢測到的電流值是81nA。
另外，可從第3孔的陰性對照用探針(NCP)得到閾值以上的電流 值，從而可確證有其他核酸樣品的混入(污染)。
此外，可確認核酸樣品S1、 S2、 S4中無樣品混入，從而可得到正 確的檢查結果。即對于核酸樣品S1，由于可從核酸探針D1檢測到63nA, 從而可確認核酸樣品Sl中含與核酸探針Dl互補的序列。而對于核酸 樣品S2，由于可從核酸探針D2檢測到72nA,從而可確認核酸樣品S2 中含與核酸探針D2互補的序列。而對于核酸樣品S4，由于可從核酸探 針D4檢測到62nA,從而可確認核酸樣品S4中含與核酸探針D4互補 的序列。
本領域技術人員容易知曉其他優(yōu)點及改進。所以本發(fā)明的范圍不局 限于本文所述發(fā)明詳述及代表性實施方案。所以可在不脫離本發(fā)明的權
利要求書或其相當?shù)拿枋龆x的本發(fā)明的總發(fā)明概念的精神和范圍的 情況下，對本發(fā)明進行各種修飾。序列表<110〉 Kabushiki Kaisha Toshiba <120〉多核酸檢測方法<130> 08S1594〈160〉 20〈170〉 Patentln version 3.4<210> 1〈211〉 18<212〉 DNA<213〉 人工的<220><223> 探針<400〉 1ttcagttatg tggatgat 18〈210〉2〈211〉18<212〉DNA<213>人工的<220〉<223〉探針<400>2tcagttatgt cgatgatg 18<210〉3<211〉21<212〉DNA<213〉人工的<220〉〈223〉探針〈400〉 3tttcagttat gttgatgatg t<210> 4<211〉 20〈212> 陽<213> 人工的〈220〉<223〉 探針 <400〉 4tttcagttat gtagatgatg〈210〉 5<211〉 15<212> DNA <213〉人工的<220〉<223〉 探針 <400〉 5tccgggcgca gsaac〈210〉6<211〉14<212>DNA<213>人工的<220〉<223〉探針<400>6gtgctgc兆g tgcg<210>7〈211〉15〈212〉DNA<213〉人工的<220><223〉 探針<400> 7cgtgatgaca ccaag 15<210> 8<211〉 15<212〉 DNA<213> 人工的<220〉<223> 探針<400〉 8atgctttccg tggca 15<210〉 9<211〉 34<212> DNA<213〉 人工的<220><223> 探針<400〉 9accaataagg tttattgaat atttgggcat caga 34<210〉 10<211> 30<212〉 DNA <213>人工的<220><223〉 探針<400> 10tgcttctaca cagtctxctg tacctgggca 30<210〉 11<211〉 30<212〉 DNA <213〉人工的〈220〉<223> 探針<400> 11tggtxctggc actgataata gggaatgtat 30<210〉 12<211〉 30<212> DNA <213>人工的<220><223> 探針<400> 12agtagttatg tatatgcccc ctcgcctagt 30〈210〉 13〈211〉 18<212> 廳<213〉 人工的<220〉<223> 試劑<400〉 13atcatccaca taactgaa 18<210> 14<211〉 18〈212〉 DNA〈213〉 人工的〈220><223> 試劑<400> 14catcatcgac ataactga 18<210〉 15〈211〉 21<212> 讓<213〉 人工的<220〉〈223〉 試劑〈400〉 15acatcatcaa cataactgaa a 21〈210〉 16<211〉 20<212〉 DNA<213> 人工的<220><223〉 試劑<400〉 16catcatctac ataactgaaa 20<210> 17<211> 15<212〉 隠 <213〉人工的<220〉<223〉 試劑<400> 17gtttctgcgc ccgga 15<210〉 18<211> 14<212〉 DNA <213〉人工的<220〉
〈223〉 試劑 <400〉 18
cgcacctgca gcac 14
<210〉 19
<211〉 15
〈212〉 DNA
<213> 人工的
<220〉
<223〉 試劑
<400〉 19
cttggtgtca tcacg 15
<210〉 20
<211〉 15
<212〉 DNA
〈213> 人工的
<220>
<223〉 試劑
<400〉 20
tgccacggaa agcat 1權利要求
1.檢測第1～第n(n為大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的多核酸檢測方法，包括第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備準備分別對應于第1～第n核酸樣品的第1～第n孔，從而使第1孔含固定有第1檢測核酸探針的用于檢測第1核酸樣品的第1檢測核酸探針固定區(qū)域和固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第1核酸樣品的第1陽性對照固定區(qū)域，且使第k(k為2～n的自然數(shù))孔含固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢測核酸探針固定區(qū)域和固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k陽性對照固定區(qū)域；第二步準備用于識別第1～第n核酸樣品的試劑，所述試劑含相互不同的核酸，各核酸含與固定于第1～第n孔中的第1～第n陽性對照固定區(qū)域的第1～第n陽性對照核酸探針具有分別互補的序列的核酸；第三步將用于識別第1～第n核酸樣品的試劑分別加入到第1～第n核酸樣品中；第四步將第1～第n核酸樣品各注入第1～第n孔中；第五步檢測第1～第n陽性對照固定區(qū)域有無反應；第六步檢測第1～第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
2. 權利要求1的多核酸檢測方法，其特征在于，所迷第1~第n 孔是各自獨立的用于檢測核酸樣品的設備。
3. 權利要求1的多核酸檢測方法，其特征在于，將所述第1 ~第n 孔設置于1個用于檢測核酸樣品的設備上。
4. 用于檢測多核酸的試劑盒，含根據(jù)權利要求1的多核酸檢測方法準備的用于檢測核酸樣品的設備和根據(jù)權利要求1的多核酸檢測方法準備的用于識別第1 ~第n核 酸樣品的試劑。
5. 檢測第1 第n(n為大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的多核酸 檢測方法，包括第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備準備分別對應于第1 ~第n核酸樣品的第1 ~第n孑L，從而 使第1孔含固定有第1檢測核酸探針的用于檢測第1核酸樣品的第1 檢測核酸探針固定區(qū)域、固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的 第1陽性對照固定區(qū)域和用于檢測第l核酸樣品之外的核酸樣品混入的第1陰性對 照固定區(qū)域，且 使第k (k為2-n的自然數(shù))孔含 固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k 檢測核酸探針固定區(qū)域、固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的 第k陽性對照固定區(qū)域和用于檢測第k核酸樣品之外的核酸樣品混入的第k陰性對 照固定區(qū)域， 其中，第1陰性對照固定區(qū)域由(n-l)個固定區(qū)域構成，在各固定 區(qū)域上分別獨立固定有與固定于第2~第n陽性對照固定區(qū)域的 第2 ~第n陽性對照核酸探針含同一序列的各核酸探針，且第k (k為2 n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域由(n-l)個固 定區(qū)域構成，在各固定區(qū)域上分別獨立固定有與固定于除第k之外的第1~第n陽性對照固定區(qū)域的除第k之外的第1~第n陽性對照核酸探針含同 一序列的各核酸探針； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，所述試劑含相 互不同的核酸，各核酸含與固定于第1~第n孔中的第1~第n陽性對 照固定區(qū)域的第1~第n陽性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸；第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
6. 權利要求5的多核酸檢測方法，其特征在于，所述第1~第n 孔是各自獨立的用于檢測核酸樣品的設備。
7. 權利要求5的多核酸檢測方法，其特征在于，將所述第1 ~第n 孔設置于1個用于檢測核酸樣品的設備上。
8. 用于檢測多核酸的試劑盒，含根據(jù)權利要求5的多核酸檢測方法準備的用于檢測核酸樣品的設備和根據(jù)權利要求5的多核酸檢測方法準備的用于識別第1 ~第n核 酸樣品的試劑。
9. 檢測第l-第n(n為大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的多核酸 檢測方法，包括第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備 準備分別對應于第1 ~第n核酸樣品的第1 ~第n孑L，從而 使第1孔含固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測 核酸探針固定區(qū)域、固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的第1陽性對照固定區(qū)域和用于檢測第l核酸樣品之外的核酸樣品混入的第1陰性對照固 定區(qū)域，且使第k(k為2 n的自然數(shù))孔含固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域、固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k 陽性對照固定區(qū)域和用于檢測第k核酸樣品之外的核酸樣品混入的第k陰性對照 固定區(qū)域， 其中，第1陰性對照固定區(qū)域由1個固定區(qū)域構成，在所述固定區(qū)域 上一同固定有與固定于第2 ~第n陽性對照固定區(qū)域的第2 ~第n陽 性對照核酸探針含同一序列的核酸探針，且第k (k為2 n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域由l個固定區(qū)域 構成，在所述固定區(qū)域上一同固定有與固定于除第k之外的第1~ 第n陽性對照固定區(qū)域的除第k之外的第1~第n陽性對照核酸探 針含同 一序列的核酸探針； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，所述試劑含相 互不同的核酸，各核酸含與固定于第1~第n孔中的第1~第n陽性對 照固定區(qū)域的第1~第n陽性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸；第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中；第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應；第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應；第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
10.權利要求9的多核酸檢測方法，其特征在于，所述第l 第n孔是各自獨立的用于檢測核酸樣品的設備。
11. 權利要求9的多核酸檢測方法，其特征在于，將所述第1-第 n孔設置于1個用于檢測核酸樣品的設備上。
12. 用于檢測多核酸樣品的試劑盒，含根據(jù)權利要求9的多核酸檢測方法準備的用于檢測核酸樣品的設備和根據(jù)權利要求9的多核酸檢測方法準備的用于識別第1 ~第n核 酸樣品的試劑。
13. 權利要求9的多核酸檢測方法，其特征在于， 所述固定于第1陰性對照固定區(qū)域的核酸探針中與各第2 ~第n陽性對照探針具有同一序列的核酸中的至少2種互相串聯(lián)，且所述固定于第k(k為2 n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域的核酸 探針中與各固定于除第k之外的第1~第n陽性對照固定區(qū)域的除第 k之外的第1~第n陽性對照探針具有同一序列的核酸中的至少2種 互相串聯(lián)。
14. 權利要求9的多核酸檢測方法，其特征在于， 所述固定于第1陰性對照固定區(qū)域的核酸探針中與各第2 ~第n陽性對照探針具有同一序列的核酸中的至少2種互相串聯(lián)，其中至少 l個序列的末端與其他至少l個序列的末端重疊，且所述固定于第k(k為2 n的自然數(shù))陰性對照固定區(qū)域的核酸 探針中與各固定于除第k之外的第1~第n陽性對照固定區(qū)域的除第 k之外的第1~第n陽性對照探針具有同一序列的核酸中的至少2種 互相串聯(lián)，其中至少l個序列的末端與其他至少l個序列的末端重疊。
15. 檢測第1~第n (n為大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的多核 酸檢測方法，包括第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備 準備分別對應于第1 ~第n核酸樣品的第1 ~第n孑L，從而 使第1孔含固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測核酸探針固定區(qū)域、固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的第1 陽性對照固定區(qū)域和固定有第1陰性對照核酸探針的用于檢測第l核酸樣品之外的 核酸樣品混入的第1陰性對照固定區(qū)域，且使第k ( k為2 ~ n的自然數(shù))孔含 固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域、固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k 陽性對照固定區(qū)域和固定有第k陰性對照核酸探針的用于檢測第k核酸樣品之外 的核酸樣品混入的第k陰性對照固定區(qū)域； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，其中， 所述用于識別第1核酸樣品的試劑包括 含與固定于第1陽性對照固定區(qū)域的第1陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸樣品的用于判定第1陽性對照的試劑和含與固定于第2 ~第n陰性對照固定區(qū)域的笫2 ~第n陰性對照 核酸探針具有分別互補的序列的多個核酸的用于判定第1陰性對照 的試劑，且所述用于識別第k(k為2 n的自然數(shù))核酸樣品的試劑包括 含與固定于第k陽性對照固定區(qū)域的第k陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第k陽性對照的試劑和含與固定于除第k之外的第1 ~第n陰性對照固定區(qū)域的除第k 之外的第1~第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列的多個核 酸的用于判定第k陰性對照的試劑； 第三步將用于識別第1 ~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；第四步將第1~第n核酸樣品各注入第1~第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應；第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
16. 權利要求15的多核酸檢測方法，其特征在于，所述第1 ~第n 孔是各自獨立的用于檢測核酸樣品的設備。
17. 權利要求15的多核酸檢測方法，其特征在于，將所述第1~ 第n孔設置于1個用于檢測核酸樣品的設備上。
18. 用于檢測多核酸的試劑盒，含根據(jù)權利要求15的多核酸檢測方法準備的用于檢測核酸樣品的 設備和根據(jù)權利要求15的多核酸檢測方法準備的用于識別第1~第n 核酸樣品的試劑。
19. 權利要求18的用于檢測多核酸的試劑盒，其中所述用于識別 第1~第n核酸樣品的試劑由用于判定第1~第n陽性對照的試劑和用 于判定第1~第n陰性對照的試劑構成。
20，檢測第1~第n (n為大于等于2的自然數(shù))核酸樣品的多核 酸檢測方法，包括第一步準備如下用于檢測核酸樣品的設備 準備分別對應于第1 ~第n核酸樣品的第1 ~第n孑L，從而 使第1孔含固定有第l檢測核酸探針的用于檢測第l核酸樣品的第l檢測 核酸探針固定區(qū)域、固定有第1陽性對照核酸探針的用于識別第l核酸樣品的笫1 陽性對照固定區(qū)域和固定有第1陰性對照核酸探針的用于檢測第l核酸樣品之外的 核酸樣品混入的第1陰性對照固定區(qū)域，且 使第k(k為2 n的自然數(shù))孔含固定有第k檢測核酸探針的用于檢測第k核酸樣品的第k檢 測核酸探針固定區(qū)域、固定有第k陽性對照核酸探針的用于識別第k核酸樣品的第k陽性對照固定區(qū)域和固定有第k陰性對照核酸探針的用于檢測第k核酸樣品之外的核酸樣品混入的第k陰性對照固定區(qū)域； 第二步準備用于識別第1~第n核酸樣品的試劑，其中， 所述用于識別第1核酸樣品的試劑包括 含與固定于第1陽性對照固定區(qū)域的第1陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第1陽性對照的試劑和含與固定于第2 ~第n陰性對照固定區(qū)域的第2 ~第n陰性對照 核酸探針具有分別互補的序列，且與和固定于第2~第n陽性對照 周定區(qū)域的第2~第n陽性對照用核酸探針雜交的核酸具有分別互 補的序列的多個核酸的用于判定第1陰性對照的試劑，且所述用于識別第k(k為2 n的自然數(shù))核酸樣品的試劑包括 含與固定于第k陽性對照固定區(qū)域的第k陽性對照核酸探針具 有互補序列的核酸的用于判定第k陽性對照的試劑和含與固定于除笫k之外的第1 ~第n陰性對照固定區(qū)域的除第k 之外的第1~第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列，且與和 固定于除第k之外的第1~第n陽性對照固定區(qū)域的除第k之外的 第1~第n陽性對照用核酸探針雜交的核酸具有分別互補的序列的 多個核酸的用于判定第k陰性對照的試劑； 第三步將用于識別第1~第n核酸樣品的試劑分別加入到第1~ 第n核酸樣品中；第四步將第l 第n核酸樣品各注入第l 第n孔中； 第五步檢測第1~第n陽性對照固定區(qū)域有無反應； 第六步檢測第1~第n陰性對照固定區(qū)域有無反應； 第七步檢測第1~第n檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
21.權利要求20的多核酸檢測方法，其特征在于， 所述用于判定第1陰性對照的試劑含下列核酸互相串聯(lián)的多個核酸與所述固定于第2 ~第n陰性對照固定區(qū)域的第2 第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列的核酸和與和所述固定于第2 第n陽性對照固定區(qū)域的第2 第n 陽性對照核酸探針雜交的核酸具有分別互補的序列的核酸；且 所述用于判定第k(k為2 n的自然數(shù))陰性對照的試劑含下列 核酸互相串聯(lián)的多個核酸與所述固定于除第k之外的第1 ~第n陰性對照固定區(qū)域的除 第k之外的第1 ~第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸和與和所述固定于除第k之外的第1 ~第n陽性對照固定區(qū)域的 除第k之外的第1 ~第n陽性對照核酸探針雜交的核酸具有分別互 補的序列的核酸。
22. 權利要求20的多核酸檢測方法，其特征在于， 所述用于判定第1陰性對照的試劑含下列核酸互相串聯(lián)的多個核酸，其中各串聯(lián)的核酸末端與其他核酸末端重疊與所述固定于第2 ~第n陰性對照固定區(qū)域的第2 第n陰 性對照核酸探針具有分別互補的序列的核酸和與和所述固定于第2 ~第n陽性對照固定區(qū)域的第2 第n 陽性對照核酸探針雜交的核酸具有分別互補的序列的核酸；且 所述用于判定第k(k為2 n的自然數(shù))陰性對照的試劑含下列 核酸互相串聯(lián)的多個核酸，其中各串聯(lián)的核酸末端與其他核酸末端重 疊與所述固定于除第k之外的第1 ~第n陰性對照固定區(qū)域的除 第k之外的第1 ~第n陰性對照核酸探針具有分別互補的序列的核 酸和與和所述固定于除第k之外的第1 ~第n陽性對照固定區(qū)域的 除第k之外的第1 ~第n陽性對照核酸探針雜交的核酸具有分別互 補的序列的核酸。
23. 權利要求20的多核酸檢測方法，其特征在于，所述第1 ~第n 孔是各自獨立的用于檢測核酸樣品的設備。
24. 權利要求20的多核酸檢測方法，其特征在于，將所述第1~ 第n孔設置于1個用于檢測核酸樣品的設備上。
25. 用于檢測多核酸的試劑盒，含根據(jù)權利要求20的多核酸檢測方法準備的用于檢測核酸樣品的 設備和根據(jù)權利要求20的多核酸檢測方法準備的用于識別第1~第n 核酸樣品的試劑。
26. 權利要求25的用于檢測多核酸的試劑盒，其中所述用于識別 第1~第n核酸樣品的試劑由用于判定第1~第n陽性對照的試劑和用 于判定第1~第n陰性對照的試劑構成。
全文摘要
本發(fā)明提供多核酸檢測方法，包括第一步準備用于檢測核酸樣品的設備；第二步準備用于識別第1～第n核酸樣品的試劑；第三步將用于識別第1～第n核酸樣品的試劑分別加入到第1～第n核酸樣品中；第四步將第1～第n核酸樣品各注入第1～第n孔中；第五步檢測第1～第n孔中的陽性對照固定區(qū)域有無反應；第六步檢測第1～第n孔中的檢測核酸探針固定區(qū)域有無反應。
文檔編號C12Q1/68GK101633960SQ200910151890
公開日2010年1月27日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權日2008年7月3日
發(fā)明者岡田純, 源間信弘 申請人:株式會社東芝