專利名稱：：對含有特定序列的第一特異性mRNA進行定量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及高通量分離和定量全血中mRNA。更特別地，本發(fā)明涉及用于分離和擴增mRNA的方法和設(shè)備，其使用附著到固定寡聚(dT)的多孔板上的白細胞濾器的組合。
背景技術(shù)：
：分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究顯示可以從對其核糖核酸(RNA)的研究中推導(dǎo)出細胞的遺傳起源和功能活性。這種信息可以在臨床實踐中用于診斷感染、檢測細胞表達致癌基因的出現(xiàn)、檢測家族性疾病、監(jiān)測寄主防御機制的狀態(tài)以及確定HLA類型或者特性的其它標(biāo)記。RNA以三種功能不同的形式存在核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。然而穩(wěn)定的rRNA和tRNA參與翻譯的催化過程，mRNA分子攜帶遺傳信息。總RNA中由只有大約15%的mRNA、大約15%的tRNA以及大約80%的rRNA組成。mRNA是重要的診斷工具，特別是當(dāng)其用于定量觀測基因的上調(diào)或者下調(diào)時。人的外周血是用于mRNA分析非常好的臨床來源。例如，對血中特異性嵌合mRNA的監(jiān)測可以暗示不正常細胞的出現(xiàn)，并且應(yīng)用于慢性骨髓細胞性白血病(CML)的分子檢測(KawasakiE.S.，ClarkS.S.，CoyneM.Y.，Smiths.D.，ChamplinR.，Witte0.N.禾PMcCormickF.P.1988年，Diagnosisofchronicmyeloidandacutelymphocyticleukemiasbydetectionofleukemia—specificmRNAsequencesamplifiedinvitro，Proc.Natl.Acad.Sci.美國85:56985702，PachmannK.，ZhaoS.，SchenkT.，KantarjianH.，El-NaggarA.K.，SicilianoM.j.，GuoJ.Q.，ArlinghausR.B.禾口AndreeffM.2001年，Expressionofbcr-ablemRNAindividimlchronicmyelogenousleukaemiacellsasdeterminedbyinsitimmplification，Br.J.Haematol.112:749-59)。通過監(jiān)測癌特異性mRNA可以檢測微轉(zhuǎn)移的癌細胞，例如對直腸癌監(jiān)測癌胚抗原(CEA)、對前列腺癌監(jiān)測前列腺特異抗原(PSA)和對甲狀腺癌監(jiān)測甲狀腺球蛋白(WingoS.T.，RingelM.D.，AndersonJ.S.，PatelA.D.，LukesY.D.，DjuhY.Y.，SolomonB.，NicholsonD.，Balducci-SilanoP丄，LevineM.A.，F(xiàn)rancisG丄禾口TuttleR.M.1999年，Quantitativereversetranscription_PCRmeasurementofthyroglobulinmRNAi即eripheralbloodofhealthysubjects,Clin.Chem.45:785-89)以及對黑色素瘤監(jiān)測酪氨酸酶(PelkeyT.J.，F(xiàn)riersonH.F.Jr.禾口BrunsD.E.1996年，Molecularandimmunologicaldetectionofcirculatingtumorcellsandmicrometastasisfromsolidtumors，Clin.Chem.42:136981)。而且，由于這些癌特異性mRNA水平在治療后發(fā)生改變，特異mRNA的定量在后續(xù)治療過程中提供了有用的指標(biāo)。由于與白細胞(大約5000白細胞/yL)相比，血液含有大量的無核紅細胞(大約5百萬細胞/PL)，因此通常將從全血中分離粒細胞或者淋巴細胞作為mRNA分析的第一步來進行。然而，由于在不同樣品中白細胞特異亞群回收的不一致，因此分離白細胞的數(shù)目由每個樣品所確定，并將結(jié)果表達為每個白細胞mRNA的量，而不是每iiL血mRNA的量。而且，mRNA的量可以在冗長的分離過程中改變。盡管沒有方法來從血中分離癌細胞，但基因擴增技術(shù)可以對特異性mRNA水平進行鑒定和定量，甚至從大量不同的基因中，這使全血在可以得到基因特異性引物和探針時成為mRNA分析的理想材料。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，科學(xué)團體正面臨研究所與研究所之間以及實驗與實驗之間在基因表達分析方面有差異的巨大問題。盡管目前的基因擴增技術(shù)提供了對模板DNA的完全定量，但由于缺少每個樣品中RNA回收率和cDNA合成率的信息，這些數(shù)值不能被轉(zhuǎn)換成該基因在原材料中的量。總RNA常被用作mRNA定量的標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)記，并且通常結(jié)果表達為每yg總RNA基因的量。然而，必須要強調(diào)的是總RNA不能代表mRNA，因為mRNA的片斷只占總RNA的15%，而且即使在總RNA相同的情況下mRNA的量也會變化?？俁NA或者mRNA的產(chǎn)量也會隨著所采用的方法而廣泛變化。一旦提取了RNA，下一步是合成cDNA，其自身會引起不確定性，因為現(xiàn)有的方法不能說明是否在每次實驗中每個RNA模板都形成了cDNA的單拷貝。為了避免上面的問題，廣泛使用通過將目標(biāo)基因數(shù)據(jù)與看家基因或rRNA的數(shù)據(jù)進行比較的相對定量。然而，對照基因的量通常是不穩(wěn)定的，可能在實驗中發(fā)生變化。而且，這種變化代表了臨床中的嚴重問題，因為每個臨床樣本通常是在時間的不同點進行分析。通常很難從全血中分離純mRNA，因為全血含有大量RNA酶(來自粒細胞)和無核紅細胞。盡管可以得到各種用于全血應(yīng)用的RNA提取方法(deVriesT.J.，F(xiàn)ourkourA.，P皿tC.J.，RuiterD.J.禾口vanMuijenG.N.2000年，Analysisofmelanomacellsinperipheralbloodbyreversetranscription—polymerasechainreactionfortyrosinaseandMART—laftermono皿clearcellcollectionwithcellpreparationtubes:acomparisonwiththewholebloodguanidiniumisothiocyanateRNAisolationmethod,MelanomaResearch10:11926JohanssonM.，PisaE.K.，TomanenV.，ArstrandK.禾口KagedalBl.2000年，Quantitativeanalysisoftyrosinasetranscriptsinblood，Clin.Chem.46:92127;WingoS.T.，RingelM.D.，AndersonJ.S.，PatelA.D.，LukesY.D.，DjuhY.Y.，SolomonB.，NicholsonD.，Balducci-SilanoP丄，LevineM.A.，F(xiàn)rancisG丄禾口TuttleR.M.1999年，Quantitativereversetranscription—PCRmeasurementofthyroglobulinmRNAinperipheralbloodofhealthysubjects，Clin.Chem.45:785-89)，但是該檢驗是勞動密集型的，需要多輪離心，以及仔細的操作，這在去除核酸酶活性中是必須的。因此，需要一種用于分離和定量全血中大量mRNA的快速簡單方法和設(shè)備。特別地，需要具有可重復(fù)回收和完全連續(xù)操作來擴增基因的高通量、全血衍生mRNA處理技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種直接分離和定量全血中mRNA的有效高通量方法和設(shè)備，其具有可重復(fù)的回收，其使用附著到固定寡聚(dT)的多孔板上的白細胞濾器的組合。本發(fā)明一方面包括一種高通量定量全血中mRNA的方法，其包括步驟(a)收集全血；(b)通過過濾從全血中去除紅細胞和血液組分以生產(chǎn)過濾膜上的白細胞；(c)對白細胞進行細胞裂解以獲得含mRNA的裂解物；(d)將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的板上以捕獲mRNA;以及(e)對mRNA進行定量。在該方法的一個優(yōu)選實施方式中，在收集白細胞之前對全血施加抗凝血劑?？梢詫⒍鄠€過濾膜疊在一起來提高所捕獲白細胞的產(chǎn)量。使用裂解緩沖液對捕獲在過濾膜上的白細胞進行裂解以從白細胞中釋放mRNA。可以使用離心、真空吸引、正壓或者乙醇清洗然后真空吸引來完成將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的板上。通過產(chǎn)生cDNA并用PCR擴增該cDNA來對mRNA進行定量。特別優(yōu)選的實施方式使用TaqManPCR來定量mRNA。本發(fā)明另一方面包括使用人工對照RNA作為通用標(biāo)準(zhǔn)。在優(yōu)選的實施方式中，檢測每個樣品中標(biāo)準(zhǔn)RNA的回收使得基因擴增的結(jié)果可以用來確定每yl全血中存在的mRNA量。本發(fā)明實施方式導(dǎo)致樣品和實驗之間的低變化系數(shù)。在優(yōu)選的實施方式中，在回收RNA、合成cDNA以及定量的過程中，變化可以被最小化。使用標(biāo)準(zhǔn)化的對照RNA可以進行更有效的檢驗、定量以及比較檢測。本發(fā)明另一方面包括一種進行高通量定量全血中mRNA的設(shè)備，其中該設(shè)備包括(a)多孔板，其含有多個樣品傳輸孔，在孔下方捕獲白細胞的過濾器，以及在濾器下含有固定的寡聚(dT)的mRNA捕獲帶；和(b)真空盒，其用于容納過濾板以在板和盒之間形成密封。在該設(shè)備的優(yōu)選實施方式中，白細胞被捕獲在多個層疊在一起的過濾膜上。在該設(shè)備的另一優(yōu)選實施方式中，真空盒用于容納真空源。在該設(shè)備的另一優(yōu)選實施方式中，在真空盒和多孔板之間插入多孔支持物。本發(fā)明另一方面包括一種試劑盒，其包括用于進行高通量定量全血中mRNA的設(shè)備、肝素、低滲緩沖液和裂解緩沖液。本發(fā)明另一方面包括一種用于進行高通量定量全血中mRNA的全自動系統(tǒng)，其包括將血樣品、低滲緩沖液和裂解緩沖液施加到設(shè)備的遙控設(shè)備；自動真空吸引儀、離心機以及自動PCR儀。圖1是高通量mRNA設(shè)備的分解圖；圖2顯示高通量mRNA設(shè)備的多孔板，其包括白細胞過濾器和固定寡聚(dT)的過濾器孔；圖3是表示在過濾板上捕獲新鮮和冷凍血液樣品白細胞效率的圖表；圖4是表示清洗血液數(shù)目對mRNA定量影響的圖表；圖5是表示細胞裂解前對過濾板的最終處理對mRNA定量影響的圖表；圖6是表示裂解緩沖液如何抑制RNA酶的圖表；圖7是表示用于mRNA定量的反轉(zhuǎn)錄酶最佳濃度的圖表；圖8是表示用于PCR以捕獲mRNA的cDNA的最佳量的圖表；6圖9是表示本發(fā)明雜交動力學(xué)的圖表；圖10是表示每孔所使用全血體積和mRNA定量之間平行關(guān)系的圖表；圖11是表示硫氰酸胍最佳濃度的圖表；圖12是表示蛋白酶K最佳濃度的圖表；圖13A13D是表示檢驗有效性的圖表；圖14A14D是表示回收合成的摻標(biāo)(spiked)RNA的圖表；圖15表示由特異性反義引物(NNN)和固定的寡聚(dT)合成cDNA;圖16是表示使用和不使用變性特異性引導(dǎo)的RNA回收的圖表；圖17是表示使用和不使用特異性引物對RNA擴增的圖表；圖18A表示本發(fā)明典型的捕獲mRNA的示意；圖18B是表示各種雜交性能的圖表；圖18C是表示各種捕獲總RNA和多聚(A)RNA的方法效率的圖表；圖18D是表示PCR循環(huán)最佳數(shù)目的圖表；圖18E是表示用于捕獲RNA的裂解緩沖液最佳范圍的圖表；圖19A是表示PCR循環(huán)數(shù)目相對各種抗凝血劑的圖表；圖19B是表示PCR循環(huán)數(shù)目相對存儲時間的圖表；圖19C是表示PCR循環(huán)數(shù)目相對雜交溫度的圖表；圖19D是表示PCR循環(huán)數(shù)目相對雜交時間的圖表；圖19E是表示PCR循環(huán)數(shù)目相對匪LV單位的圖表；圖19F是表示PCR循環(huán)數(shù)目相對每孔cDNA的圖表；圖20A是表示摻標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)RNACt值的圖表；圖20B是表示摻標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)RNACt回收百分率的圖表；圖20C是表示抑制劑dA20Ct值的圖表；圖20D是表示抑制劑dA20抑制百分率的圖表；圖20E是表示每Pi血Ct值的圖表；圖20F是表示每y1血mRNA回收的圖表；圖21AE表示對每個對象mRNA的回收；圖21A是表示在各種對象中標(biāo)準(zhǔn)RNA回收百分率的圖表；圖21B是表示在各種對象中所回收的每Pi血CD4mRNA的圖表；圖21C是表示在各種對象中所回收的每Pi血p21mRNA的圖表；圖21D是表示在各種對象中所回收的每y1血FasLmRNA的圖表；圖21E是表示在各種對象中所回收的每y1血LTC4SmRNA的圖表；圖22A是表示在全血中體外誘導(dǎo)的mRNA的圖表；圖22B是表示在體外剌激前的血儲存的圖表；圖22C是通過對剌激和載體對照二者分別顯示mRNA分子/mL血，表示在各種對象中FasLmRNA的體外誘導(dǎo)的圖表，；圖22D是通過對剌激和載體對照二者分別顯示mRNA分子/mL血，表示在各種對象中p21mRNA的體外誘導(dǎo)的圖表；圖22E是與圖22C相同的通過旋轉(zhuǎn)直至回歸線成水平的圖表；圖22F是與圖22D相同的通過旋轉(zhuǎn)直至回歸線成水平的圖表；圖22G是與圖22C相同的通過顯示每個對象的倍數(shù)增加的數(shù)據(jù)；圖22H是與圖22D相同的通過顯示每個對象的倍數(shù)增加的數(shù)據(jù)。具體實施例方式本發(fā)明允許進行較大體積未制備全血的分析，提供分析單獨從白血細胞得到的mRNA的有效方法，去除rRNA和tRNA，提供穩(wěn)定的mRNA回收并容易適合自動化。本發(fā)明提供了靈敏的定量系統(tǒng)，其包括使用即時PCR的完全定量，以及變化系數(shù)在2025%范圍內(nèi)優(yōu)異的可重復(fù)性。而且，本發(fā)明適合各種疾病目標(biāo)(表I)。表I刺激疾病候選基因(-)白血病遷移基因癌癥(診斷、監(jiān)測和篩選)來自微轉(zhuǎn)移癌細胞的癌癥特異性基因HIV/CMW(診斷、監(jiān)控和血庫)來自感染W(wǎng)BC的病毒衍生mRNA體內(nèi)靈敏麼/叉抗白血病藥物免疫抑制細胞因子抗癌藥物對WBC的副作用看家基因體外抗病毒藥物靈敏度來自感染W(wǎng)BC的病毒衍生mRNA本發(fā)明不限定于任何特定的機械結(jié)構(gòu)。然而，圖1和2表示用于完成本發(fā)明高通量mRNA定量的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。真空盒10形成該結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。真空盒可以由任何充分結(jié)實足以忍受真空吸引的材料制成；而優(yōu)選使用一次性塑料材料。真空盒被改裝成接收真空源來進行真空吸引12。過濾器塞14定位在真空盒的真空吸引儀轉(zhuǎn)接器之間。真空盒10優(yōu)選具有突出物16來與多孔過濾板40或者可選擇的多孔支持物20相配。在真空盒上部內(nèi)可選擇設(shè)有多孔支持物20以便支持多孔過濾板40。密封墊30優(yōu)選包括硅基橡膠或者其它軟塑料，位于多孔支持物的頂端。在密封墊的上面，有多孔過濾板40，其包括多樣品孔46、在樣品傳遞孔下面的多個捕獲白細胞過濾器42、以及在濾器下面的mRNA捕獲帶44。mRNA捕獲帶的孔中含有固定的寡聚(dT)。—個優(yōu)選的實施方式涉及從全血中簡單、可重復(fù)和高通量定量mRNA的方法?？焖賹嶒灧桨甘谷⊙髆RNA的二級誘導(dǎo)或降解最小化，同時96孔過濾板和微板的使用使得可以同時進行96個樣品操作。在程序中最小化的操作提供了非常小的樣品與樣品間的變化，其中變化系數(shù)(CV)值小于30%，即使在使用PCR作為定量方法的時候。在一個實施方式中，該方法包括制備真空盒。在一個優(yōu)選實施方式中，在真空盒中加入血胞囊例如聚丙烯酸酯聚合物基質(zhì)(RedZ，Safetec)以固化血液。接著在真空盒中放入多孔支持物。然后將由硅基橡膠或其它軟塑料制成的密封墊放于多孔板支持物的頂部。將過濾器塞(X-6953,60iiFilterPlugHDPE，PorexProductsGroups)放置在真空盒的真空吸引儀轉(zhuǎn)接器內(nèi)。在這個實施方式中，該方法包括制備過濾板。使用玻璃纖維膜或者白細胞過濾膜來捕獲白細胞。為了簡化檢測，使用玻璃纖維膜或者白細胞過濾膜來構(gòu)建多孔過濾板，以能夠同時處理多個血樣。在美國專利No.4，925，572和4，880，548中公開了用來捕獲白細胞過濾器的實施例，其所公開的內(nèi)容在這里引入作為參考。通常采用將白細胞吸附在過濾器表面作為去除白細胞的機制。由于給定重量纖維的表面與纖維的直徑成反比，因此，預(yù)期更細的纖維將具有更高的能力，并且如果所使用纖維直徑更小，達到期望效率所必需的纖維重量將更小。大量通常使用的纖維包括聚酯、聚酰胺和丙烯酸樹脂，其進行輻射枝接，由于其對在所需接枝水平的Y_射線所引起的降解有充分抗性，并且具有可獲得單體進行反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。PBT已經(jīng)成為用于開發(fā)本發(fā)明產(chǎn)品的主要樹脂，并且是實施例中所使用的樹脂。然而，需要注意的是發(fā)現(xiàn)其它樹脂可以纖維化或者收集作為1.5微米或更小的纖維墊或者網(wǎng)，以及臨界濕潤表面張力被調(diào)節(jié)到最優(yōu)范圍內(nèi)的產(chǎn)品可以很好的適合制造相同效率但更少白細胞損失的設(shè)備。相似的，適當(dāng)處理的玻璃纖維對于制造有效設(shè)備是有用的。當(dāng)使用PBT基過濾器時，CD4mRNA的吸附是玻璃纖維基過濾器的4倍。過濾板置于真空盒內(nèi)。在另一優(yōu)選實施方式中，多個過濾膜被層疊在一起來提高從全血中捕獲白細胞的量。在一個優(yōu)選實施方式中，過濾板置于板支持物和密封墊上。在另一實施方式中，過濾板用塑料膠帶(Bio-Rad223-9444)密封，并且該膠帶被切割使得允許以希望數(shù)目的孔進入。在另一實施方式中，用低滲緩沖液(20iiL5mMTris，pH7.4)對加入樣品的每個孔進行清洗。該方法優(yōu)選包括收集血、將血加到多孔過濾板以及去除紅細胞和其它非白細胞組分。在一個優(yōu)選實施方式中，全血被吸入含有抗凝血劑的血收集管中，其提高了白細胞的過濾效率?？鼓獎?，肝素，在提高白細胞過濾效率方面是特別有效的。在一個優(yōu)選實施方式中，血樣品被冷凍，這去除了某些破壞mRNA的RNA酶。用低滲緩沖液對孔進行清洗。一旦血被加入到過濾板上期望數(shù)目的孔中，將血過濾通過過濾膜?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員任何已知的技術(shù)來實施過濾，例如離心、真空吸引或者正壓。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，在將血樣品加入到過濾板孔中后開始真空吸引(使用6cmHg)。用低滲緩沖液(12X，200iiL5mMTris，pH7.4)對每個孔清洗多次。在另一優(yōu)選的實施方式中，使用乙醇(1X，200iiL100%乙醇)對含有樣品的每個孔進行清洗，其是在真空吸引過程中干燥過濾膜并顯著提高捕獲白細胞的效率。在另一實施方式中，采用真空(20cmHg進行大于2分鐘)。該方法包括細胞裂解以及mRNA雜交到固定在mRNA捕獲帶內(nèi)的寡聚(dT)上。將裂解緩沖液應(yīng)用到過濾板孔(40yL/孔)，進行孵育(室溫下進行20分鐘)以從被捕獲的白細胞中釋放出mRNA。在一個優(yōu)選的實施方式中，將多孔過濾板密封在塑料包中并進行離心(IECMultiRF，2000轉(zhuǎn)/分鐘，4C進行1分鐘)。接著再加入裂解緩沖液(20yL/孔)，接下來進行離心(IECMultiRF，3000轉(zhuǎn)/分鐘，4C進行5分鐘)。接著從離心機中去除多孔過濾板并進行孵育(室溫下2小時)。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，裂解緩沖液包括去污劑、鹽、pH緩沖液、硫氰酸胍和蛋白酶K。裂解緩沖液的優(yōu)選實施方式含有至少一種去污劑，但可以含有一種以上去污劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用具有不同強度的去污劑濃度的不同組合來得到各種類型細胞不同膜的不同水平的裂解。例如，IGEPALCA-630是比N-月桂肌氨酸(N-Laurosarcosine)弱的去污劑，在一個實施方式中，單獨IGEPALCA-630足以裂解細胞質(zhì)膜。在另一實施方式中，強去污劑例如N-月桂肌氨酸可以與一種或者更多種弱去污劑結(jié)合使用來優(yōu)化對細胞核膜的裂解。去污劑優(yōu)選足以裂解至少細胞質(zhì)膜。另一優(yōu)選的實施方式包括足以裂解細胞核膜的去污劑，因為顯著量的mRNA殘余在細胞核中。在某些情況下，希望只檢測細胞質(zhì)mRNA，而其它情況下希望檢測細胞質(zhì)和細胞核中的mRNA。裂解緩沖液的強去污劑優(yōu)選包括但不限于N-月桂酰肌氨酸、S.D.S、脫氧膽酸鹽和十六烷基三甲基溴化銨。弱去污劑包括IGEPALCA_630、N_癸?；鵢N_甲基葡糖胺、辛基_P_D_吡喃型葡萄糖苷或者其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的去污劑。裂解緩沖液中可以使用0.052%的去污劑。一個特別優(yōu)選的裂解緩沖液實施方式含有0.5XN-月桂酰肌氨酸。另一個優(yōu)選的裂解緩沖液實施方式含有0.12%IGEPALCA-630。特別優(yōu)選的實施方式含有0.1%IGEPALCA-630。鹽和螯合劑的組合也可以作為裂解劑。例如75iiMNaCl和24iiMNa-EDTA可以作為裂解劑。裂解劑的實施方式可以含有其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它裂解劑。裂解緩沖液的鹽作為mRNA-寡聚(dT)雜交劑。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的，優(yōu)選具有不超過4XSSC的嚴格程度(與其互補DNA序列雜交在一起的嚴格程度)。裂解緩沖液的其它實施方式包括NaCl或者其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的鹽。優(yōu)選裂解緩沖液貯液的pH緩沖液維持在7.08.OpH。一個實施方式含有l(wèi)mM100mMTrisHCl，pH7.4。在特別優(yōu)選的實施方式中，pH緩沖液含有10mMTrisHC1，pH7.4。裂解緩沖液的其它優(yōu)選實施方式含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的pH緩沖液，其包括具有0.03%H202的0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽，pH5.0。根據(jù)裂解緩沖液特別優(yōu)選的實施方式，硫氰酸胍作為RNA酶失活劑。我們發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有技術(shù)中通常使用的硫氰酸胍不具有有效的濃度。因此，優(yōu)選的，硫氰酸胍的濃度大于1.4M。硫氰酸胍濃度可以高到IOM，更優(yōu)選不高于2M。然而，如圖11所示，濃度超過1.7M時，裂解緩沖液的效率降低了。因此，優(yōu)選實施方式使用大約1.4大約1.75M的硫氰酸胍。一個優(yōu)選的實施方式含有1.71.8M硫氰酸胍。按照下面實施例4所描述的，工作裂解緩沖液可以從貯液中制備，其具有1.791M硫氰酸胍的精確濃度。在將其它試劑加入到裂解緩沖液時，硫氰酸胍的濃度被稀釋。將55ml的其它試劑加入到lml實施例4中的緩沖液時，優(yōu)選的裂解緩沖液含有大約1.61大約1.71M的硫氰酸胍。這樣，優(yōu)選的實施方式含有濃度在大約1.6大約1.7M的硫氰酸胍。特別優(yōu)選的實施方式進一步含有20mg/ml的蛋白酶K作為RNA酶失活劑。裂解緩沖液的一個優(yōu)選實施方式含有200iig/ml20mg/ml的蛋白酶K。另一優(yōu)選實施方式含有200iig/ml1.Omg/ml的蛋白酶K。另一優(yōu)選實施方式含有200yg/ml500yg/ml的蛋白酶K。十二烷基硫酸鈉也可以作為RNA酶失活劑。另一實施方式含有O.110%的2-巰基乙醇作為RNA酶失活劑。一個特別優(yōu)選的實施例包括1%2-巰基乙醇。RNA酶失活劑的其它實施方式可以優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的降低RNA酶中二硫鍵的材料。裂解緩沖液的優(yōu)選實施方式進一步含有螯合Mg"和Ca2+的螯合劑。一個優(yōu)選的實施方式含有0.lmM5mMEDTA。特別優(yōu)選的實施方式含有l(wèi)mMEDTA。裂解緩沖液貯液的其它優(yōu)選實施方式含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的螯合劑，其包括但不限于EDTMP、2，3-二巰基丙醇和EGTA。裂解緩沖液的優(yōu)選實施方式可以含有tRNA，其來自各種來源并含有其以抑制非特異性血衍生DNA和RNA吸附到過濾板上。另外，tRNA的存在防止血衍生RNA的降解。在優(yōu)選實施方式中，工作裂解緩沖液的tRNA包括10mg/ml大腸桿菌(E.coli)tRNA。其它實施方式可以含有來自任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知來源的tRNA。裂解緩沖液的優(yōu)選實施方式可以含有來自廣泛多種來源的DNA，其被加入以抑制非特異性血衍生DNA和RNA吸附到過濾板上。工作裂解緩沖液的DNA包括10mg/ml的超聲降解的鮭魚精子DNA。在其它實施方式中，可以使用來自其它生物的DNA。裂解緩沖液特別優(yōu)選的實施方式可以含有摻標(biāo)對照RNA來計算目標(biāo)mRNA在原始樣品中的精確量。在本發(fā)明的實施方式之前，難以將一個實驗的結(jié)果與其他實驗的結(jié)果進行比較，因為研究所與研究所之間的變化和缺少標(biāo)準(zhǔn)化。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，通過將利用TaqMan檢驗所得到的數(shù)值除以每個樣品中摻標(biāo)對照RNA劑量的回收百分率，來確定目標(biāo)RNA的精確量。下面描述并在實施例5中示范了這樣的精確定量。裂解緩沖液的優(yōu)選實施方式每個孔中含有101Xe1Q，更優(yōu)選1Xe51Xe1Q個摻標(biāo)RNA的拷貝。在優(yōu)選實施方式中，所使用對照RNA的量至少足以被檢測，但不能多到顯著地干涉需要定量的目標(biāo)mRNA的量。在優(yōu)選實施方式中，加入到裂解緩沖液中的對照RNA是多聚(A)+RNA。在特別優(yōu)選實施方式中，其中檢測樣品是人血，對照RNA與人血中存在的RNA不同源。在某些優(yōu)選實施方式中，對照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源性小于90%，或者與目標(biāo)mRNA在長度上有大于10%的差異。在其它優(yōu)選實施方式中，對照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源性小于85%，或者與目標(biāo)mRNA在長度上有大于5%的差異。在進一步實施方式中，對照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源性小于75%，或者與目標(biāo)mRNA在長度上有大于2%的差異。在可以替代的實施方式中，對照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源性小于65%，或者與目標(biāo)mRNA在長度上有大于1%的差異。在一個實施方式中，對照RNA可以優(yōu)選地通過PCR方法擴增模板寡聚核苷酸來制備。因此，可以使用正向引物(SEQIDNos:10、ll、15和8)、反向引物(SEQIDN0:9、16和9)以及TaqMan探針(FAM-SEQIDNO13_TAMRA、FAM_SEQIDN017-TAMRA和FAM-SEQIDNO12-TAMRA)來擴增各種對照RNA寡聚核苷酸?？商娲膶嵤┓绞桨ㄊ褂枚鄠€不同的需要定量的目標(biāo)mRNA。進一步的實施方式包括使用多個對照RNA。該方法包括對mRNA進行定量，在優(yōu)選實施方式中需要由mRNA合成cDNA和使用PCR擴增cDNA。在一個優(yōu)選實施方式中，使用裂解緩沖液(150ill/孔X3次，手工)和清洗緩沖液(150ill/孔X3次，手工或者BioTekftG4)對多孔過濾板進行清洗。接著，將cDNA合成緩沖液加入到多孔過濾板(40iU/孔，手工或者I&J恥)。將Axymat(AmgenAM-96-PCR-RD)放置在多孔過濾板上，接著將其放在熱塊(37C，VWR)上并孵育(>90分鐘)。然后，將多孔過濾板進行離心(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4C下1分鐘)。將PCR引物加入384孔PCR板，將cDNA從多孔過濾板轉(zhuǎn)移到384孔PCR板。對PCR板進行離心(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4C下1分鐘)，開始即時PCR(TaqMan/SYBER)。如下面實施例6所述，另一優(yōu)選實施方式包括在mRNA雜交或者cDNA合成過程中應(yīng)用特異性反義引物。寡聚(dT)和特異性引物(NNNN)同時在多聚-ARNA的不同位置引導(dǎo)cDNA的合成(圖15)。如圖15所示，特異性引物(NNNN)和寡聚(dT)在擴增過程中引起11cDNA的形成。即使通過在95t:對每個孔加熱2分鐘將特異性引物衍生的cDNA去除，由加熱變性程序(使用TaqMan定量PCR)所得到特異性CD4cDNA的量也與由未加熱陰性對照中所得到的量相似(圖16)。不希望被任何解釋或者理論所限制，這種結(jié)果一個可能的解釋就是在擴增過程中寡聚(dT)衍生的cDNA可以替換引物衍生的cDNA(圖15)。這是特別方便的，因為加熱變性程序被完全排除。而且，為不同目的加入多種反義引物，可以從殘余的cDNA擴增出每種基因，將GenePlate內(nèi)寡聚(dT)衍生的cDNA貯存以用于將來。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式包括進行高通量定量來自全血mRNA的設(shè)備。該設(shè)備包括多孔過濾板，其含有多個樣品傳輸孔、在樣品傳輸孔下方捕獲白細胞的過濾器、以及在濾器下方的mRNA捕獲帶，其含有固定在mRNA捕獲帶的孔中的寡聚(dT)。為了提高白細胞的收集效率，將多個過濾膜層疊在一起。將多孔板安裝在真空盒上，其適合容納過濾板并在多孔板和真空盒之間形成密封。在該設(shè)備的一個優(yōu)選實施方式中，真空盒適合容納真空源以進行真空吸引。在另一優(yōu)選實施方式中，多孔支持物置于真空盒內(nèi)，在多孔過濾板的下方。在該設(shè)備的一個優(yōu)選實施方式中，將可以由軟塑料例如硅基橡膠制成的密封墊插入多孔支持物和多孔過濾板之間。盡管許多傳統(tǒng)的擴增技術(shù)可以與本發(fā)明結(jié)合使用，但本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式包括使用全血衍生RNA和對照RNA進行即時定量PCR(TaqMan)。Holland等人的PNAS88:72767280(1991)描述了一種TaqMan檢驗的檢驗。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物檢測系統(tǒng)中采用Taq聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性以伴隨擴增產(chǎn)生特異性可檢測的信號。一種寡聚核苷酸探針，3'末端不能延伸，5'末端被標(biāo)記，并被設(shè)計成在目標(biāo)序列內(nèi)部雜交，將該探針引入到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢驗中。在擴增過程中，探針與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物鏈中之一的退火產(chǎn)生了適合核酸外切酶活性的底物。在擴增過程中，Taq聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性把探針降解成更小的片段，其可以與未降解的探針區(qū)別開。這種檢驗是敏感和特異性的，并且相對于更多麻煩的檢測方法有顯著的改進。Gelfand等人的美國專利No.5，210，015和Holland等人的PNAS88:72767280(1991)描述了這種檢驗的一個版本，在這里引用作為參考。進一步，F(xiàn)isher等人的美國專利No.5，491，063提供了TaqMan型檢驗。Fisher等人的方法提供了一種反應(yīng)，其導(dǎo)致被發(fā)射光標(biāo)記所標(biāo)記的單鏈寡聚核苷酸探針的剪切，其中該反應(yīng)是在出現(xiàn)DNA結(jié)合化合物時進行的，該化合物與標(biāo)記相互作用以修飾標(biāo)記的發(fā)射光。該方法利用標(biāo)記探針的發(fā)射光變化，其來自于探針的降解。該方法通?？梢詰?yīng)用于利用導(dǎo)致寡聚核苷酸探針剪切的反應(yīng)的檢驗，特別的，可以應(yīng)用于同源擴增/檢測的檢驗，其中雜交的探針隨著引物的延伸而被剪切。提供了同源擴增/檢測的檢驗，其可以同時進行擴增目標(biāo)累積的檢測和目標(biāo)序列的序列特異性檢測。Fisher等人的美國專利No.5，491，063在此引入作為參考。TaqMan檢測的檢驗為經(jīng)典的PCR檢驗提供了多種優(yōu)點。首先，TaqMan檢測將PCR的靈敏性和目標(biāo)序列中存在的內(nèi)部寡聚核苷酸序列的雜交結(jié)合在一起。經(jīng)過PCR，樣品不需要必須在瓊脂糖凝膠上分離，并且取消了用來確定PCR產(chǎn)物同一性所必須的后續(xù)Southern印跡和雜交步驟。這些附加的PCR后確認步驟可以容易地連續(xù)多天以進行精確的鑒定。使用TaqMan系統(tǒng)，在2.5小時內(nèi)完成該檢驗。進一步，檢驗步驟中所采用的方法使有效地處理大量的樣品并沒有交叉污染成為可能，因此其適合遙控取樣。其結(jié)果是，使用TaqMan檢的檢測樣品。T叫Man系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是用于多元化的潛力。由于可以使用不同的熒光報告子染色劑來構(gòu)建探針，因此在相同的PCR反應(yīng)中可以結(jié)合幾種不同的HIV系統(tǒng)，這樣降低了在每個檢驗是單獨進行的情況下會發(fā)生的勞力成本?？焖俸妥罱K數(shù)據(jù)的優(yōu)點結(jié)合勞力和成本效率使得使用本發(fā)明特異性引物的T叫Man檢測系統(tǒng)成為用于監(jiān)測HIV存在的有利的系統(tǒng)。在優(yōu)選的實施方式中，通過簡單的為每個目標(biāo)改變引物和探針，可以對各種mRNA進行定量。因為肝素含有細胞外Ca2+，這是發(fā)揮最大生物學(xué)活性的重要因素之一，因此可以在全血中對藥物作用進行分析，而不需要分離白細胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，使用已知量摻標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)RNA來確定給定樣品總效率的能力來自于無關(guān)于劑量和無關(guān)于序列的實施方式。使用已知量的對照RNA可以將PCR檢測轉(zhuǎn)化為原始樣品中目標(biāo)mRNA的量。隨著時間對個體的大樣品進行這樣的計算，以確定每yl全血中各種基因mRNA存在的通常范圍。將本發(fā)明的實施方式用于在給定時間檢測個體全血時，表明存在暗示疾病的mRNA的結(jié)果，其水平落在正常范圍之外，發(fā)出疾病存在的信號。本發(fā)明的實施方式用于檢測各種疾病的檢驗。例如，通過在許多樣品中誘導(dǎo)mRNA到最大希望的水平，檢測給定樣品的mRNA，并檢測樣品的mRNA水平以確定其是否降到最大水平以下，從而來檢測暗示疾病的mRNA。相似的，本發(fā)明的實施方式可以用于確定醫(yī)療領(lǐng)域的效率。相似的，本發(fā)明的實施方式可以用于氧化壓力測試，其中對使用不同量抗氧化劑的人樣品的mRNA水平進行互相比較。另一優(yōu)選的實施方式涉及一種高通量定量全血中mRNA的試劑盒。該試劑盒包括高通量定量全血中mRNA的設(shè)備、含肝素的血收集管、低滲緩沖液和裂解緩沖液。另一優(yōu)選的實施方式涉及一種用于高通量定量全血中mRNA的全自動系統(tǒng)，其包括向設(shè)備加入血樣、低滲緩沖液和裂解緩沖液的遙控設(shè)備；自動真空吸引儀和離心機，以及自動PCR儀。實施例實施例1對本發(fā)明方法的各種方案進行測試并將其用于定量全血的13-肌動蛋白mRNA和CD4mRNA。檢測三種抗凝血劑ACD、EDTA和肝素，其中肝素導(dǎo)致了最大比例的白細胞保留。白血球吸附(Leukosorb)膜已經(jīng)用于輸血中的ACD血，即使將四層膜同時使用，也通過了大約1540%的白細胞。對EDTA血進行測試，發(fā)現(xiàn)其能力和白細胞保留與ACD的相似。然而，特別注意的是100%肝素血液中的白細胞被捕獲在白血球吸附膜上。對來自肝素血液白細胞的100X捕獲表現(xiàn)了使用本發(fā)明mRNA定量的有效性。這些數(shù)據(jù)說明使用肝素血最適合mRNA的精確定量，而ACD血對于需要大體積血和較小定量結(jié)果的應(yīng)用是有用的。對使用冷凍血和新鮮血樣品的結(jié)果進行了比較。如圖3所說明的，從新鮮血泄漏細胞中回收了比冷凍樣品泄漏細胞多的CD4mRNA。還測試了玻璃纖維過濾器全血保留的效率，相對于PBT-基過濾膜的保留值。如表II所示，即使在使用低滲緩沖液(50mMTris，pH7.4)對膜進行清洗的時候，玻璃纖維膜只接受40iiL的全血。然而，如表II所示，白血球吸附過濾器接受了顯著地比玻璃纖維過濾器較大量的全血。13表II.擴增全血中P-肌動蛋白mRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*1:A:ACD，E:EDTA，H:肝素*2:(A、H)代表在實驗中所使用的抗凝血劑*3(^:循環(huán)極限*4(^:變化系數(shù)采用低滲緩沖液清洗的各種膜來去除紅細胞和其它血組分。如圖4所示，使用低滲緩沖液清洗至少3次的樣品是未清洗的所捕獲CD4mRNA量的兩倍以上。圖4還表示使用低滲緩沖液清洗血液12次導(dǎo)致捕獲最大量的mRNA。另外，各種真空、離心以及在真空處理血樣品后用乙醇清洗以收集白細胞的方法相對于最終CD4mRNA的定量進行比較。圖5說明，盡管真空吸引達到了比離心更好的CD4mRNA定量，但在真空吸引之前用乙醇清洗血樣品產(chǎn)生了最多的mRNA?！┌准毎徊东@在玻璃纖維或者白血球吸附膜上，使用低滲緩沖液清洗的不同次數(shù)來去除紅細胞和其它血組分。為了將mRNA從所捕獲的白細胞中去除，將裂解緩沖液(RNAture)施加到過濾板(40y1/孔)上，并將該板在室溫孵育20分鐘。在優(yōu)選的實施方式中，裂解緩沖液中含有擴增引物。圖6說明裂解緩沖液在RNA酶抑制中發(fā)揮重要的作用，嗜曙紅細胞充滿RNA酶，其被裂解緩沖液失活。接著將多孔過濾板在塑料包中密封并進行離心(IECMultiRF，2000轉(zhuǎn)/分鐘，4C下進行1分鐘)。接著再次加入裂解緩沖液(20y1/孔)，接著進行離心(IECMultiRF，3000轉(zhuǎn)/分鐘，4C下進行5分鐘)。然后從離心機中取出多孔過濾板，并將其在室溫下孵育2小時以使多聚(A)+RNA與固定的寡聚(dT)進行雜交。接著使用150iU裂解緩沖液對多孔過濾板清洗3次以去除殘余的核酸酶，接著使用150iU清洗緩沖液(BioTek#G4)清洗3次以去除裂解緩沖液，其含有某些cDNA合成的抑制劑。進行最后的清洗后，從多孔過濾板完全去除清洗緩沖液，并通過加入40iU預(yù)混合的cDNA緩沖液在每個孔中合成cDNA。cDNA緩沖液優(yōu)選由下列成分組成5X第一鏈緩沖液(PromegaM531A、10mMd證(Promega貯液，20X))、弓|物(5線#24)、RNasin(PromegaN211A，40U/iiL)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(PromegaM170A，200U/iiL)，以及DEPC水。圖7表示用于mRNA定量的最佳匪LV濃度是50單位/孔。將Axymat(AmgenAM-96-PCR-RD)置于多孔過濾板上，接著將其置于熱塊上(37C，VWR)并孵育(>90分鐘)。然后離心多孔過濾板(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4C下1分鐘)。將PCR引物加入到384-孔PCR板，并將cDNA從多孔過濾板轉(zhuǎn)移到384-孔PCR板。圖8說明用于PCR的最佳cDNA值為2uL/孔。對PCR板進行離心(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4C下1分鐘)，然后開始即時PCR(TaqMan/SYBER)。本發(fā)明的方法具有高mRNA特異性；使用TaqManqPCR對CD4mRNA進行擴增達到了無法檢測的DNA濃度(<10拷貝/孔)。如圖9所示，本發(fā)明達到mRNA定量變化的低系數(shù)。與傳統(tǒng)的變化系數(shù)大約300%的mRNA定量變化系數(shù)相比，雜交兩個小時可以達到小于13%的變化系數(shù)。而且，如圖IO所示，線性結(jié)果表示所捕獲的mRNA的量與每孔全血的體積直接成比例，這使得本發(fā)明是定量mRNA的有效和可重復(fù)方法。實施例2將50L肝素化的冷凍人血應(yīng)用到白血球吸附過濾板。對每個孔進行真空處理并使用150iiL5mMTrispH7.4和150yL100%的乙醇進行清洗12次。接著，將40iiL含有1.7071.856M硫氰酸胍的裂解緩沖液加入到孔中。在室溫下孵育15分鐘后，將過濾板置于GenePlate上并以2000轉(zhuǎn)/分鐘在4C下離心1分鐘。再加入20yL裂解緩沖液，樣品離心5分鐘。在將GenePlate孵育2小時后，使用100yL裂解緩沖液對每個孔進行清洗3次，接著應(yīng)用3次150iiL清洗緩沖液(10mMTrispH7.4，lmMEDTApH8.O，O.5MNaCl)。在GenePlate內(nèi)合成cDNA，并使用2iiLcDNA用于TaqMan檢驗以定量CD4。圖11中表示了該結(jié)果。實施例3將50iiL肝素化的冷凍人血應(yīng)用到白血球吸附過濾板。對每個孔進行真空處理并使用150iiL5mMTrispH7.4和150yL100%的乙醇進行清洗12次。接著，將40iiL含有1.791M硫氰酸胍和00.5mg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液加入到孔中。在室溫下孵育15分鐘后，將過濾板置于GenePlate上并以2000轉(zhuǎn)/分鐘在4C下離心1分鐘。再加入20yL裂解緩沖液并再離心5分鐘。在將GenePlate孵育2小時后，使用100yL裂解緩沖液對每個孔進行清洗3次，接著應(yīng)用150iiL清洗緩沖液(10mMTrispH7.4，lmMEDTApH8.0，0.5MNaCl)3次。在GenePlate內(nèi)合成cDNA，并使用2iiLcDNA用于TaqMan檢驗以定量CD4。圖12中表示了該結(jié)果。實施例4裂解緩沖液貯液0.5XN-月桂酰肌氨酸4XSSC10mMTrisHC1，pH7.4lmMEDTA0.1%IGEPALCA-6301.791M硫氰酸胍工作裂解緩沖液裂解緩沖液貯液lml2-巰基乙醇10iiL超聲降解的鮭魚精子DNA(10mg/ml)大腸桿菌tRNA(10mg/ml)蛋白酶K(20mg/ml貯液)lOiiLlOiiL25iiL(最終0.5mg/ml)實施例5制備對照RNA為了合成對照RNA，使用T7-正向引物(SEQIDNO3、5和6)以及dT幼反向引物(T幼-SEQIDNO1和T4。_SEQIDNO7)對模板寡聚核苷酸(SEQIDNO2和4)以及來自K562細胞的cDNA(RNAture，Irvine,CA)進行擴增，其分別通過30個95。C變性30秒、55。C退火20秒，然后72。C延遲20秒的循環(huán)。寡聚核苷酸是從IDT(Coralvilie，IA)或者Proligo(Boulder，CO)購買的。序列如下:SEQIDNO1:5'-GGGTGCTGTGCTTCTGTGAAC-3'，SEQIDNO2:5'—GCCCCCTCACTCCCAAATTCCAAGGCCCAGCCCTCACACATTGTTCACAGAAGCACAGCACCC-3'，SEQIDNO3:5'-GTAATACGACTCACTATAGGGGGACAGCCCCCTCACTCCCAAA-3'，SEQIDNO4:5'-GAAGCGTGTGTCACTGTGTGTTTCCAAGGCCCAGCCCTCACACATTGTTCACAGAAGCACAGCACCC-3'，SEQIDNO5:5'-GTAATACGACTCACTATAGGGGGACGGAAGCGTGTGTCACTGTGTGT-3'，SEQIDNO6:5'—GTAATACGACTCACTATAGGGGGACGCATTCCGCTGACCATCAATA-3'，SEQIDNO7:5'-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3'。通過體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(T7RiboMaxExpress,Promega)在37。C下進行30分鐘來從純化的PCR產(chǎn)物合成RNA，接著用DNA酶處理15分鐘兩次。將純化的RNA產(chǎn)物懸浮在無核酸酶的水中，并以rRNA作為標(biāo)準(zhǔn)通過RiboGreen(MolecularProbes)檢驗來確定其濃度。通過毛細管電泳芯片(iChip，HitachiChemical，日本東京)來分析其質(zhì)量。收集白細胞從健康的成年志愿者收集靜脈血樣。由指定的供應(yīng)商獲得玻璃纖維過濾板(RNAture)和白血球吸附膜(PallLifeSciences,AnnArbor，MI)。由Whatman-Polyfiltronics(Clifton，NJ)制造定制的96-孔白血球吸附過濾板。由于認為人血樣是傳染的材料，因此設(shè)計了一次性真空管，并由AmbrittEngineering(SantaAna，CA)制造定制的產(chǎn)品。將過濾板置于一次性真空管上并用200iiL磷酸緩沖鹽水(PBS:Invitrogen，carlbad，CA)清洗兩次。停止真空后，接著向過濾板施加新鮮或者化凍的血樣(達到200iiL/孔)。在將所有的樣品分配入過濾板中后，開始14cmHg的真空過濾，接著用PBS清洗(200yL/孔)12次。最后一次清洗后，繼續(xù)真空5分鐘以使膜完全干燥并從膜去除殘余量的PBS。裂解細胞和制備mRNA將過濾板置于空白微孔板上，接著應(yīng)用40yL裂解緩沖液(RNAture，Irvine,CA)，其含有反向引物(終濃度為25nM)、作為定量標(biāo)準(zhǔn)的合成RNA、100iig/mL鮭魚精子DNA(Eppendorf-5Prime,Westbury，NY)、100iig/mL大腸桿菌(E.coli)tRNA(Sigma)、500iig/mL蛋白酶K(Pierce，Rockford，IL)以及1:IOO稀釋的2-巰基乙醇(BioRad，Hercules,CA)。將樣品在室溫下孵育1個小時。在某些實驗中(圖14C14D)，將各種濃度的寡聚dA2。加入到裂解緩沖液中。接著將過濾板置于固定寡聚(dT)的微孔板上(GenePlate，RNAture)，接著在650Xg下離心1分鐘。然后加入20yL裂解緩沖液，接著在1450Xg下離心5分鐘。進行該步驟后，在GenePlate每個孔中裂解緩沖液的體積大約為50iiL。將GenePlate進行孵育后，使用100yL清澈的裂解緩沖液對該板進行清洗3次，然后用150iiL清洗緩沖液清洗3次(10mMTrispH7.4，ImMEDTA，O.5MNaCl)。合成cDNA通過加入30iiLcDNA緩沖液在GenePlate內(nèi)合成cDNA，其含有1XRT緩沖液、0.5mMdNTP、15單位的rRNasin和37.5單位的匪LV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。將該樣品在37t:孵育2小時。由于反向引物加入到裂解緩沖液中，cDNA合成反應(yīng)中不包括引物。合成cDNA后，將50iiL無核酸酶的水加入到每個孔中，并使用2iiL進行下面所述的T叫Man檢驗。TaqMan即時PCR通過PrimerExpress2.0版(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)設(shè)計對照RNA用的引物和T叫Man探針。對于bcr-abl，我們使用公開的序列。在某些實驗中，使用HYB模擬器(RNAture)來設(shè)計反向引物。使用正向引物(SEQIDNO10、11、15和8)、反向引物(SEQIDNO9禾P16)以及TaqMan探針(FAM—SEQIDNO13—TAMRA,FAM—SEQIDNO17-TAMRA和FAM-SEQIDN012-TAMRA)來擴增對照RNA。為了確定血樣中CD4mRNA的量，在PCR板的不同孔中分析CD4和對照RNA，而不是在一個孔中進行多個PCR。對于P-肌動蛋白，使用可商業(yè)獲得的引物和探針(ABI)。將下列物質(zhì)混合入384孔PCR板(ABI)中2yLcDNA、5iiLTaqMan通用主混禾口(mastermix)(ABI)、lyL5iiM的正向引物、1iiL5iiM的反向引物以及IpL2iiM的TaqMan探針。在ABIPRISM7900HT(ABI)中進行PCR，1個循環(huán)90°C10分鐘，接著進行45個循環(huán)的90°C20秒、接著55°C20秒和最后的60°C1分鐘。使用SDS2.0版(ABI)對數(shù)據(jù)進行分析。在某些實驗中，直接在GenePlate(Opticon，MJResearch)內(nèi)進行TaqMan檢驗。使用寡聚核苷酸(SEQIDNO2、4和14)以及PCR產(chǎn)物作為對照RNA的定量標(biāo)準(zhǔn)。序列如下SEQIDNO8:5'-AAATGCCACACGGCTCTCA-3'SEQIDNO9:5'—CAAGTGTCTTCGTGTCGTGGG_3'SEQIDNO10:5'-AGCCCCCTCACTCCCAAA—3'SEQIDNO11:5'—AGCCCCCTCACTCCCAAA—3'SEQIDNO12:5'-CAGTGGCTAGTGGTGGGTACTCAATGTGTACTT-3'SEQIDNO13:5'—CCAAGGCCCAGCCCTCACACA_3'SEQIDNO14:5'-CAGGGACAAATGCCACACGGCTCTCACCAGTGGCTAGTGGTGGGTACTCAATGTGTACTTTTGGGTTCACAGAAGCACAGCACCCAGGG-3'，SEQIDNO15:5'—CCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAA—3'SEQIDNO16:5'—TCCAACGAGCGGCTTCAC—3'SEQIDNO17:5'—CAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGA—3'。分析數(shù)據(jù)使用每個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定PCR產(chǎn)物的量。然后將T叫Man結(jié)果乘以稀釋系數(shù)(X40:80iiLcDNA中取出2iiL用于PCR，并X1.67:從50yL裂解緩沖液/孔合成30iiLcDNA)。進一步通過將回收的摻標(biāo)RNA除以預(yù)先確定的摻標(biāo)RNA的量(通常為每孔107個拷貝)，從而確定每個樣品摻標(biāo)RNA的回收率。對于CD4mRNA，將TaqMan結(jié)果乘以稀釋系數(shù)，除以體積，再除以相同樣品中摻標(biāo)RNA的回收率。將每個血樣施加到過濾板的3個孔中(3份)，每個孔得到每個基因的單cDNA和單PCR。檢驗有效性圖13A表示了雜交動力學(xué)，其中在室溫下2小時后雜交達到平穩(wěn)期。圖13B中描述了血劑量依賴性，其中CD4mRNA檢測為0.05yL，并以對數(shù)級線性提高到200yL。我們也發(fā)現(xiàn)雜交效率在1525t:之間顯著變化(圖13C)。如圖13D所示，CD4mRNA在肝素化血中非常穩(wěn)定，并大部分在37°CT7小時或者4t:過夜而不改變。這說明CD4可以是全血中基因表達分析的良好對照。圖13中的結(jié)果表達為基因數(shù)目的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。盡管循環(huán)極限(Ct)的CV小于12%，但在通過從對數(shù)級別轉(zhuǎn)化成線性級別而將Ct轉(zhuǎn)化成基因數(shù)目時，其實質(zhì)性地提高。然而，如圖13所示，即使當(dāng)起始材料為全血時，CV仍低到1030%。皿本次研究中定量的目的是通過摻標(biāo)對照RNA的使用來確定每個樣品的總檢驗效率，其被進一步用作計算原樣品中目標(biāo)mRNA精確量的標(biāo)準(zhǔn)。該原理包括兩個假設(shè)RNA的回收是不依賴于劑量，以及該回收不依賴于種類。換句話說，在高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)mRNA之間，以及在不同序列的mRNA之間，回收率應(yīng)該是相同的。這些假設(shè)不僅應(yīng)用于mRNA純化步驟，而且應(yīng)用于從細胞裂解到PCR的整個mRNA定量過程。為了使第一個假設(shè)有效，將不同量的多聚(A)+對照RNA加入到裂解緩沖液中，并將其暴露到應(yīng)用50iiL血的白血球吸附膜上。在我們確認對照RNA沒有從單獨人血中擴增后，通過T叫Man檢驗來確定對照RNA的回收。如圖14A所示，在105109拷貝/孔的檢測范圍內(nèi)，觀察到對照RNA依賴于劑量的回收。如果將相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成回收率，這些數(shù)值將在大約20X處變得相似(圖14B)。圖14A和14B的數(shù)據(jù)是整個過程的總和，其包括mRNA純化和cDNA合成。在雜交平衡的情況下，解離常數(shù)(Kd)按照如下進行計算Kd=[RNA]X[寡聚dT]/[RNA:寡聚dT];其中[RNA]和[寡聚dT]分別代表RNA和寡聚dT自由狀態(tài)的濃度，[RNA:寡聚dT]代表與寡聚dT雜交的RNA的濃度。這意味著[RNA:寡聚dT]是隨所應(yīng)用RNA的量而變化的。事實上，在用Yoyo-l核酸染料檢測雜交的RNA時，[RNA:寡聚dT]是與所應(yīng)用RNA的量成比例提高的(Miura，Y.，Ichikawa，Y.，Ishikawa，T.，Ogura，M.，deFries,R.，Shimada，H.，&Mitsuhashi，M.FluorometricdeterminationoftotalmRNAwitholigo(dT)immobilizedonmicrotiterplates.ClinChem.42，175864，1996年)。然而，因為圖14B中對照RNA是每個孔中總mRNA非常小的一部分，因此其實際上不影響這個范圍內(nèi)Kd的數(shù)值。當(dāng)合成cDNA的步驟中含有引物時，我們將面對種類內(nèi)和種類間重復(fù)性的問題。然而，通過在雜交過程中加入引物，重復(fù)性提高，說明即使在引物序列不同的情況下，cDNA也是從預(yù)雜交的引物中被同等合成。盡管回收率本身可以在依賴樣品中mRNA量的個體之間變化，但是圖14A和14B說明來自一個濃度的回收率可以應(yīng)用到在相同樣品的其它濃度中。為了檢測第二個假設(shè)，即回收不依賴種類，雜交被裂解緩沖液中的寡聚dA競爭性抑制，其中含有三種合成的多聚(A)+RNA。如圖14B所示，回收的RNA在三種摻標(biāo)RNA以及目標(biāo)原有CD4mRNA中變化，因為我們特意使用了不同量的RNA。然而所有RNA都被3X101210"拷貝/孔的寡聚dA所抑制(圖14C)。有意思的是，在將相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成目前的總百分率時，所有四種RNA表現(xiàn)了與大約3X1012個拷貝/孔的IC5。非常相似的抑制曲線。這說明，在我們系統(tǒng)中mRNA的純化是寡聚(A)特異性并且不依賴序列。如圖14C所述，即使在應(yīng)用10"個寡聚dA拷貝時，某些非特異活性仍然保留。然而，如圖14D所示，這種非特異性活性小于總活性的5%。這樣，非多聚(A)序列似乎在該檢驗中沒有發(fā)揮重要的作用。因為圖14B和14C是mRNA定量全部步驟的總和，因此，這些圖表示，即使在序列不相同的情況下，目標(biāo)基因的檢驗效率與摻標(biāo)合成的RNA相同。這同時說明將TaqMan檢驗所得到數(shù)值除以每個樣品中摻標(biāo)對照RNA單劑量的回收百分率，從而獲得目標(biāo)mRNA的精確量。如圖13和14所示，檢驗中的變化為大約1020%。為了估計檢驗之間變化，除了來自相同個體的新鮮或者冷凍血外，還使用相同的冷凍部分進行7個不同的實驗。在每個實驗中，使用不同的過濾板和GenePlate，并制備用于裂解、cDNA合成和PCR的新鮮材料。如下面表III所示，對照RNA的回收率為429%。當(dāng)不考慮對照RNA的回收，我們比較CD4量的時候，這些數(shù)值會廣泛地變化。然而，在用每個樣品中回收率調(diào)整后，數(shù)值會變得很相似，其中檢驗間的CV是714%。表111摻標(biāo)RNA回收和CD4mRNA定量的總結(jié)對兔新鮮/冷凍CD4標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線拷貝爾L拷貝/nL(被調(diào)整)A*B*%問收率A*B*#1冷凍-0,1810.0612.2扭0.34-0,2413,00#1冷凍-0.19!0.214.70±0.37-0,2312鄰356，S94:56'6仍7，613，5仆i:657,n9#1冷凍-0.2010.47U.79士1.31-0.2012.40822,329±422,6667,24().99S十4,4SC',279#2新鮮-0.179,8229,13±1,17-0,1711,151,731,727±90,9015風(fēng)4()H170'柳#2新鮮"-0.2010.474.26+0.S6-0.2012,40357,278±252，1365,52'f，693丄:〗,'"4,592粒新鮮-0.2010,4712.27±1,62-0,2012,40557,028±220，0874,477，879±1,384,554*:拷貝數(shù)=l(T(AXCt+B)**:第一次后兩天，從相同個體取出的第二次血圖13A13D證明了檢驗的有效性。對來自50iiL肝素化人全血(圖13A、B和D)或者合成對照RNA(圖13C)的cDNA進行T叫Man檢驗。圖13A表示雜交動力學(xué)。血等分在-8(TC冷凍。在不同的時間對同樣的血等分進行化凍，并應(yīng)用到過濾板上以調(diào)整雜交雜交長度在室溫下從30270分鐘。圖13B表示劑量反應(yīng)。使用PBS進行IOUOO和IOOO倍稀釋，并將50200iiL的樣品應(yīng)用到過濾板。圖13C表示雜交溫度。在4、15、25和37t:下進行雜交2個小時。圖13D表示肝素化全血的穩(wěn)定性。將血樣保存在4t:或者37t:下不同的時間長度，將每個樣品進行單獨冷凍。將樣品同時解凍并將其應(yīng)用到過濾板。數(shù)據(jù)表達為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14A14D代表合成的摻標(biāo)RNA的回收。在圖14A和14B中，將0101CI個RNA34的拷貝應(yīng)用到每個孔。在進行mRNA純化和cDNA合成后，通過TaqManPCR確定對照RNA的量。圖14A表示回收的對照RNA的量相對于加入的對照RNA的量(拷貝數(shù))。圖14B表示回收百分率，其按下式算出%回收率=回收的對照RNA/加入的對照RNAX100。圖14C和14D表示在有寡聚dA存在時的回收百分率。將50yL肝素化血應(yīng)用到白19血球吸附過濾板后，將含有各種量對照RNA34(□)、對照RNA36(〇)和對照bcr-abl(△)與015個寡聚dA2?？截愂┘拥矫總€孔中。在mRNA純化和cDNA合成后，通過TaqManPCR確定對照RNA的量。圖14C表示回收的RNA的量(拷貝數(shù))相對于寡聚dAw的量。在圖14D中，總百分數(shù)按照下式算出%總數(shù)=回收的含有寡聚dA2。RNA的量/回收的不含有寡聚dA2。RNA的量X100。實施例6將50i！L肝素化人血應(yīng)用到附著4層白血球吸附膜的過濾板。對血進行真空吸弓|并用150iiL5mMTris(pH7.4)清洗12次。接著將過濾板置于GenePlate上，并將40yL裂解緩沖液(含有或者不含CD4的反義引物)應(yīng)用到每個孔。通過離心將細胞裂解物從過濾板轉(zhuǎn)移到GenePlate。使用40yL裂解緩沖液重復(fù)該過程一次。將GenePlate在室溫孵育2小時后，使用100i!L裂解緩沖液對每個孔清洗3次，然后三次應(yīng)用150iiL清洗緩沖液。通過加入cDNA合成緩沖液和適當(dāng)?shù)拿冈贕enePlate每個孔中合成cDNA。在37。C孵育2小時后，使用150iiL90°C的水將每個孔清洗三遍。接著通過TaqMan即時PCR對GenePlate內(nèi)的CD4mRNA進行檢測。為了使寡聚(dT)替代被特異引導(dǎo)(被NNNN)的cDNA的假設(shè)有效，在GenePlate中使用或者不使用特異性引物來合成cDNA。接著，直接從GenenPlate中擴增CD4基因。如圖17所示，由兩個樣品擴增CD4。這暗示上游cDNA被從固定的寡聚(dT)衍生的cDNA替代。實施例7整體方案如圖18A所示，將全血應(yīng)用到過濾板以捕獲白細胞(1)。在用磷酸緩沖鹽水(PBS:Invitrogen)清洗過濾板后，去除了紅細胞和細胞質(zhì)組分。這個過程比傳統(tǒng)的密度梯度分離外周血單核細胞(PBMC)是更簡單和更高通量的。如圖18B所示，(標(biāo)準(zhǔn)RNA(〇)、CD4(參)、p21(A)、FasL()和白細胞三亞乙基四胺(leukotrien)C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))過濾板的雜交性能比密度梯度方法稍好。在PBMC中，白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)mRNA顯著地少，可能因為去除了粒細胞。然而，在PBMC中，p21mRNA顯著地高，因為在長分離工藝中的二級誘導(dǎo)(圖22)。比較了另一種方法，其中將全血進行離心，并沉淀懸浮在低滲溶液(10mMKHC03、15mMNH4C1、0.14mMEDTA，pH7.2)中以使紅細胞破裂，然后立刻離心以沉淀白細胞(圖18B:低滲)。然而，CD4、p21、FasL和LTC4S的水平都比過濾板方法中的低。如圖ISA(II)所示，下一步是將裂解緩沖液應(yīng)用到過濾板上并將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的微孔板以純化mRNA。為了評價該步驟，采用了三種其它的方法來進行比較。將苯酚/異氰酸胍(Trizol，Invitrogen)(圖18C:P/GI)或者試劑盒供給的裂解緩沖液(RNeasy，Qiagen)(圖18C:Silica)應(yīng)用到過濾板的每個孔，接著根據(jù)產(chǎn)品的說明書手冊由離心柱(硅)沉淀RNA(P/GI)或者洗脫RNA。為了直接純化多聚(A)+RNA，將裂解緩沖液應(yīng)用到過濾板，并將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的微孔板(GenePlate,RNAture)(圖18C:dTMP)或者新的微管中，其含有寡聚(dT)纖維素(Invitrogen)(圖18C:dTC)。雖然在微管中使用大量的分離PBMC時，P/GI、硅(Silica)和dTC方法表現(xiàn)了充分的性能，但是這些方法對于過濾板體系不能很好地作用，其中只使用了50i!L血(圖18C)。而且，如果在管中裂解細胞沉淀，機械強度(震蕩或者吹打(pipetting))的程度對于釋放mRNA是必須的，這個步驟會造成實質(zhì)性變化。然而，使用過濾板方法，細胞分散在膜內(nèi)，而且應(yīng)用裂解緩沖液足以工作而不需要任何附加的機械力。由于裂解緩沖液優(yōu)選含有引物的混合物，因此兩個獨立的雜交反應(yīng)同時發(fā)生(圖18A)。一個發(fā)生在固定的固定寡聚(dT)和mRNA的多聚(A)尾端之間。另一個雜交反應(yīng)發(fā)生在特異性引物和mRNA的適當(dāng)位置之間(圖ISA(II))。盡管特異性引物的設(shè)計是關(guān)鍵的，但是充分雜交時間使檢驗比在cDNA合成過程中引物的雜交更可重復(fù)。首先出現(xiàn)好像cDNA-mRNA復(fù)合體通過與固定的寡聚(dT)雜交停留在固體表面(圖18AII)。因此，通過在95t:加熱5分鐘從固體表面去除cDNA。然而，擴增基因的量與未熱處理對照的相比沒有變化(圖18D嵌入物)。為了檢測cDNA-mRNA復(fù)合體是否被以某種方式從固體表面除去，在合成cDNA后，用水仔細地清洗微孔板，并直接用于PCR。然而，雜交步驟中使用或者不使用特異性引物都成功地擴增了目標(biāo)基因(圖18D)。這些數(shù)據(jù)表明特異性引物引導(dǎo)的cDNA可以被寡聚(dT)引導(dǎo)的cDNA代替(圖18A(III、IV))。這使該系統(tǒng)有優(yōu)勢，因為溶液中的cDNA用于基因定量，微孔板自身可以作為cDNA庫用作有效、儲存和將來使用。為了確認在裂解和后續(xù)雜交過程中RNA的穩(wěn)定性，使用水或者濃縮的嗜曙紅細胞提取物稀釋含有相同量標(biāo)準(zhǔn)RNA的各種濃度裂解緩沖液。如圖18E所示，在將嗜曙紅細胞提取物懸浮在清洗緩沖液(10mMTrispH7.4，lmMEDTA，0.5MNaCl)中時，其自身大大地破壞了標(biāo)準(zhǔn)RNA的定量，其中將雜交嚴格性維持在沒有主要的裂解緩沖液組分。然而，當(dāng)將嗜曙紅細胞提取物懸浮在裂解緩沖液中時，RNA被保留并且與其水稀釋溶液相似(圖18E)。寬范圍的最佳緩沖液濃度(70120%)使該體系耐用并且可重復(fù)。濃度高于140%的裂解緩沖液會顯著降低檢驗性能。^M^進行研究以確定最佳和可重復(fù)的條件，其表現(xiàn)出如圖19AF所示在5個不同目標(biāo)RNA中相同的性能(標(biāo)準(zhǔn)RNA(〇)、CD4(參)、p21(▲)、FasL()和白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))。可重復(fù)條件對于后續(xù)基因定量部分是關(guān)鍵的。圖19中的每個數(shù)據(jù)點是來自單個典型實驗三份(每份50iiL)血等分的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)。但是每個實驗重復(fù)至少二到三次。首先，檢測三種典型的抗凝血劑。盡管肝素表現(xiàn)出比ACD和EDTA稍好的性能，但是三種抗凝血劑都是可接受的(圖19A)。由于ACD和EDTA螯合鈣，其是許多生物學(xué)活性的關(guān)鍵組分，因此肝素是這個使用全血進行體外剌激項目的抗凝血劑的選擇(圖22)。在血解凍后保持全血的穩(wěn)定性是主要的考慮。因此，某些商用系統(tǒng)(PAXgene、PreAnalytix)使用特定的即刻裂解細胞的血容器，并且釋放的RNA穩(wěn)定相對長時間。然而，大體積裂解物的操作使得整個體系有問題。而且，由于該項目的目標(biāo)之一是在體外基因誘導(dǎo)之前和之后對mRNA進行定量(圖22AH)，因此肝素化全血貯存在4°C以及檢測在mRNA水平的變化。盡管四個正基因(CD4、p21、FasL和LTC4S)的水平在血解凍后不穩(wěn)定，但是一旦將血貯存在4t:兩小時后，該水平都變得穩(wěn)定和恒定(圖19B)。使用寡聚(dT)制備多聚(A)+mRNA通常在室溫進行。然而，其性能在203(TC之間會變化(圖19C)。當(dāng)使用短合成RNA時，在2023t:之間的變化是顯著的(圖19C)。因此，制備mRNA的步驟在4t:下進行。雜交的長度也是關(guān)鍵的。某些RNA(標(biāo)準(zhǔn)RNA和FasL)在兩小時后達到了穩(wěn)定狀態(tài)，而其它需要四小時以上到八小時來穩(wěn)定(圖19D)。因此，在4t:下進行制備mRNA的步驟過夜。通過切換到這種條件，實質(zhì)上改善了檢驗與檢驗之間的變化。21不使用任何附加的引物合成cDNA(圖18D)。盡管短合成RNA和大量RNA(CD4)需要少量的反轉(zhuǎn)錄酶，但其它RNA需要大約100單位的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶拉達到穩(wěn)定狀態(tài)(圖19E)。有趣的是，RNaseH-匪LV(Superscript,Invitrogen)與該體系中原來的匪LV相比表現(xiàn)出差的性能。在37t:孵育90分鐘以上對于所有檢測的RNA的種類是充分的(數(shù)據(jù)未顯示)。溶液中的cDNA直接用于后續(xù)的TaqMan即時PCR。該檢驗對轉(zhuǎn)入PCR的cDNA量的比例敏感。通?？梢缘玫降木彌_液含有二硫蘇糖醇(DTT)，其抑制PCR。因此，如圖19F所示，最大的cDNA體積是2iiL/10iiLPCR。通過從緩沖液中去除DTT，cDNA的體積提高到4iilVlOiiLPCR。皿本研究定量步驟的目標(biāo)是通過利用已知量的摻標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)RNA來確定每個樣品中總檢驗效率，其進一步用作將PCR結(jié)果轉(zhuǎn)化成原樣品中目標(biāo)mRNA量的標(biāo)準(zhǔn)。這個原則依賴兩個假設(shè)具有不同豐度的相似mRNA樣品之間的效率是一致的(不依賴劑量)；以及不同mRNA序列之間的效率是相同的(不依賴序列)。為了確認第一個假設(shè)，將不同量的合成RNA標(biāo)準(zhǔn)加入到裂解緩沖液中，其暴露到含有50iiL血的過濾板中。在確認標(biāo)準(zhǔn)RNA沒有由單獨人血中被擴增后，通過TaqManPCR確認標(biāo)準(zhǔn)RNA的回收。如圖20A所示(標(biāo)準(zhǔn)RNA(〇)、CD4(參)、p21(▲)、FasL()和白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))，在測試的104109個分子孔的范圍內(nèi)觀察到標(biāo)準(zhǔn)RNA不依賴于劑量的回收。由于與50iiL血中存在的總mRNA量相比，標(biāo)準(zhǔn)RNA的這個范圍是充分小的，因此四種其它自身mRNA的水平保持不變(圖20A)。將相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成回收百分率時，這些數(shù)值全部大約23%相似(圖20B)。在雜交的平衡條件下，解離常數(shù)(Kd)按照如下進行計算Kd=[RNA]X[寡聚(dT)]/[RNA:寡聚(dT)]其中[RNA]和[寡聚(dT)]分別代表RNA和寡聚(dT)自由狀態(tài)的濃度，[RNA:寡聚(dT)]代表與寡聚(dT)雜交的RNA的濃度。這意味著Kd在該系統(tǒng)中維持作為一個穩(wěn)定的數(shù)值，并且[RNA:寡聚(dT)]取決于應(yīng)用的RNA的量而變化。事實上，在用Yoyo-l核酸染料檢測雜交的總RNA時，[RNA:寡聚(dT)]是與應(yīng)用的RNA的量成比例提高的。這些數(shù)據(jù)也表示，由標(biāo)準(zhǔn)RNA的一個濃度得出的回收百分率可以應(yīng)用到相同樣品內(nèi)mRNA的任何濃度。對于第二個假設(shè)，使用或者不使用寡聚(dT)作為競爭性抑制劑來進行雜交。如圖20C中所示，所有5個目標(biāo)RNA的Ct值被每孔3X1012以上分子的寡聚(dT)顯著抑制，盡管這些RNA的表達水平都不同。有趣的是，當(dāng)相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成抑制百分率時，所有的5個RNA表現(xiàn)出幾乎相同的抑制曲線，其具有大約3X10121013個分子/孔的IC5。(圖20D)。這說明該系統(tǒng)是多聚(A)特異性和不依賴序列的。如圖20C所示，即使在應(yīng)用1015個分子寡聚(dA)(標(biāo)準(zhǔn)RNA與CD4)后，仍保留某些非特異性活性。然而，如圖20D所示，當(dāng)Ct數(shù)值(對數(shù)級)轉(zhuǎn)化成分子數(shù)目(線性級)時，這些非特異性活性是可以被忽略的。因此，非多聚(A)序列似乎在這個系統(tǒng)中沒有發(fā)揮重要的功能。因為圖20AD是對mRNA定量整個過程的總和，因此這些數(shù)據(jù)表示任何目標(biāo)基因的總檢驗效率與摻標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)RNA的效率是相同的。這對于多聚(A)+RNA來說是特殊的，因為在傳統(tǒng)總RNA純化方法中的長和短RNA之間存在實質(zhì)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差(數(shù)據(jù)未顯示)。下一步是將每孔中RNA的量轉(zhuǎn)化成每yL血RNA的量。如圖20E所示，四個原來mRNA的Ct值幾乎線性降低，其依賴于應(yīng)用血的體積。即使O.OOlyL(l:105稀釋，每孔100iiL)血中也可以檢測到大量mRNA例如CD4(圖20E)。由于裂解緩沖液中標(biāo)準(zhǔn)RNA的量是相同的，因此即使血體積變化很大時，標(biāo)準(zhǔn)RNA的回收也不變，如圖20E。在每孔大于100L血時，Ct值達到了穩(wěn)定狀態(tài)(圖20E)，這表明來自過濾板的白細胞增加的泄漏。一旦將相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成每PL血的量，該數(shù)值將在每孔350iiL血之間保持穩(wěn)定(圖20F)，這對于所有四個原有mRNA是真實的(圖20F)。定量還依賴于兩個絕對數(shù)值應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)RNA的數(shù)量，以及TaqManPCR中標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的數(shù)量。為了確保標(biāo)準(zhǔn)RNA產(chǎn)品的純度，在這個項目中使用RNA寡聚核苷酸。盡管合成具有IOO個堿基的RNA寡聚核苷酸是難以達到的，但是這種長度是希望的，因為RNA寡聚核苷酸優(yōu)選含有兩個引物位點、TaqMan探針位點和多聚(A)尾端。在本研究中的合成RNA是通過Dharmacon合成的，通過HPLC分析，具有86%的純度。HPLC純化的DNA寡聚核苷酸也被用作T叫ManPCR的模板，因為擴增曲線的斜率(表示PCR效率)在寡聚核苷酸和cDNA之間是相同的。產(chǎn)生了具有每孔10610個分子寡聚核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在對yM濃度的貯液進行1061012倍稀釋時，出現(xiàn)了一個問題。當(dāng)使用TE或者水來作為稀釋劑時，標(biāo)準(zhǔn)曲線變化很大，特別是在少于103個分子/孔的時候。在切換到含0.1%20之間的無核酸酶水時，這個問題被完全消除。確定iH常數(shù)倌為了確定健康對象每yL血中mRNA的對照值，對來自52個個體(54個數(shù)據(jù)點，其中l(wèi)個個體重復(fù)了3次)的CD4、p21、FasL和LTC4S的水平通過15個不同的實驗檢測2個月以上。每個數(shù)據(jù)點來自于3個50yL全血的等分。如圖21A所示，標(biāo)準(zhǔn)RNA的回收為3.56±0.49%(CV=13.7%)。盡管這個CV比傳統(tǒng)的免疫分析大得多，但因為其使用PCR，還是可以接受的，其中一個循環(huán)差別代表產(chǎn)物量中的兩倍。使用標(biāo)準(zhǔn)RNA回收值，成功地將每個mRNA的數(shù)值轉(zhuǎn)化成每PL血的分子數(shù)，而不是依賴于10—12摩爾或者10一15摩爾。如圖21BE所示(標(biāo)準(zhǔn)RNA(0)、CD4(參)、p21(A)、FasL(令)和白細胞三亞乙基四胺C4合成酶mRNA(LTC4S)(■))，CD4、p21、FasL和LTC4SmRNA的對照水平分別是每iiL全血100，772±59，184(CV=58.7%)、1，692±858(CV=50.7%)、17，841±12，190(CV=68.3%)以及42，058±22，521(CV=53.5%)個分子。50%的CV意味著殘余在TaqManPCR—個Ct內(nèi)的正常數(shù)值。有意思的是，當(dāng)平均值士ls.d.數(shù)值在每個圖中被遮蔽時，某些個體表達高數(shù)值(圖21BE)。將表達高FasLmRNA水平的個體重復(fù)3次(圖21D)。mRNA正常數(shù)值的確定結(jié)合低CV數(shù)值以及通過本發(fā)明優(yōu)選實施方式，可獲得標(biāo)準(zhǔn)的確定可以用于檢測本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種疾病檢測的檢驗中。體外響應(yīng)為了評定作為模式系統(tǒng)白細胞對12-十四酸佛波酯-13_乙酸鹽(PMA)和鈣離子載體A23187(Cal)(Sigma)的響應(yīng)，p21和FasLmRNA的水平進行定量(圖22，其中，對照剌激中的p21(△)、PMA+CAI剌激中的p21(▲)、對照剌激中的FasL()和PMA+CAI剌激中的FasL())。在另一優(yōu)選實施方式中，分析對各種生物活性試劑剌激響應(yīng)的各類型mRNA，其包括但不限于，例如放射線、紫外線、氧化壓力、臭氧、溫度、機械壓力、化學(xué)試劑、肽、激素、蛋白質(zhì)、抗原、抗體、藥物、小分子化合物、有毒材料、環(huán)境剌激、細胞-細胞間通訊、傳染性試劑以及過敏原。由于該系統(tǒng)使用肝素化的全血，而不是人造溶液中分離的白細胞的懸浮液，因此該結(jié)果反映了生理學(xué)上精確的條件。如圖22A所示，p21和FasLmRNA水平在PMA和Cal的剌激后都快速上升，在90120分鐘后達到了大約升高10倍的穩(wěn)定狀態(tài)。p21的升高比FasL要快得多(圖22A)。通過在37。C下孵育，而沒有任何剌激，也會提高p21的水平，而FasL保持不變(圖22A)。有趣的是，即使在將肝素化全血貯存在4t:下21個小時，也可以觀察到響應(yīng)(圖22B)，這提供了功能型分子分析的寬適應(yīng)性。在分析mRNA表達的上調(diào)或者下調(diào)中，提高倍數(shù)是通常使用的參數(shù)。然而，如圖22CD所示，在PMA-CaI剌激后所誘導(dǎo)的p21和FasLmRNA的量線性增長依賴于mRNA基礎(chǔ)水平的量。因此，即使當(dāng)樣品比正常人群多2個標(biāo)準(zhǔn)偏差時(圖22C)，提高倍數(shù)檢測也不能夠確定位于回歸線的非正常樣品(圖22G)。提高倍數(shù)檢測鑒定了位于回歸線外(圖22D)的非正常樣品(圖22H)。圖22CD的兩個二維圖表清楚地區(qū)別了兩種情況中正常和非正常的樣品。在圖22CH中，每個數(shù)據(jù)點是三次檢測的平均值。為了簡化圖表，沒有顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。然而，由于在X軸和Y軸平均值±2s.d.的遮蔽面積(圖22CD)含有左上角和右下角的開放空間，因此這些角落中的非正常樣品是難以確定的。通過將X軸旋轉(zhuǎn)移到回歸線(圖22EF)，將遮蔽面積最小化。這些圖表(圖22EF)提供了檢測正常人群外非正常樣品的更好方法。序列表〈110〉日立化成工業(yè)株式會社日立化成研究中心公司〈120〉對含有特定序列的第一特異性mRNA進行定量的方法〈130X)IJP0910587〈140>10/796，298〈141>2004-03-09〈150>10/698，967〈151>2003-10-30〈160>17〈170>FastSEQforWindowsVersion4.0〈210>1〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>1gggtgctgtgcttctgtgaac〈210>2〈211>63〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸序列〈400>2gccccctcactcccaaattccaaggcccagccctcacacattgttcacagaagcacagca60ccc63<210>3〈211>43〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400〉3gtaatacgactcactatagggggacagccccctcactcccaaa43〈210>4〈211>67〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸序列〈400〉4gaagcgtgtgtcactgtgtgtttccaaggcccagccctcacacattgttcacagaagcac60agcaccc67〈210>5〈211>47〈212>DNA0245]〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列<400>5gtaatacgactcactatagggggacggaagcgtgtgtcactgtgtgt47〈210>6〈211>46〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>6gtaatacgactcactatagggggacgcattccgctgaccatcaata46〈210>7〈211>18〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>合成的寡聚核苷酸序列<400>7tccaacgagcggcttcac〈210>8〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>8aaatgccacacggctctca19〈210>9〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>9caagtgtcttcgtgtcgtggg21〈210>10〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>合成的寡聚核苷酸引物序列〈400〉10agccccctcactcccaaa18〈210>11〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400〉11agccccctcactcccaaa18〈210>12〈211>33〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸探針序列〈400>12cagtggctagtggtgggtactcaatgtgtactt33〈210>13〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸探針序列〈400>13ccaaggcccagccctcacaca21〈210>14〈211>89〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸序列〈400>14cagggacaaatgccacacggctctcaccagtggctagtggtgggtactcaatgtgtactt60ttgggttcacagaagcacagcacccaggg89〈210>15〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>15ccactggatttaagcagagttcaa24〈210>16〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸引物序列〈400>16tccaacgagcggcttcac18〈210>17〈211〉26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡聚核苷酸探針序列〈400〉17cagcggccagtagcatct辟ctttga2628權(quán)利要求1.一種對含有來自樣品特定序列的第一特異性mRNA進行定量的方法，包括a)使用已知量的第二特異性mRNA摻標(biāo)所述樣品；b)純化樣品中的多聚AmRNA;c)由樣品中的mRNA制備cDNA;d)相應(yīng)于樣品中第一特異性mRNA和第二特異性mRNA的每個定量cDNA;e)確定第二特異性mRNA的回收百分率；以及f)使用第二特異性mRNA的回收百分率來確定第一特異性mRNA的初始量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括通過下述方法對第三特異性mRNA進行定量，其包括a)使用已知量的第二特異性mRNA摻標(biāo)所述樣品；b)純化樣品中的多聚AmRNA;c)由樣品中的mRNA中制備cDNA;d)相應(yīng)于樣品第三特異性mRNA和第二特異性mRNA的每個定量cDNA;e)確定第二特異性mRNA的回收百分率；以及f)使用第二特異性mRNA的回收百分率來確定第三特異性mRNA的初始量。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中第二特異性mRNA的序列不同于第一特異性mRNA。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中第二特異性mRNA的序列與第一特異性mRNA有小于90%的同源性或者有至少10%長度上的差異。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中其中第二特異性mRNA的序列與第一特異性mRNA有小于85%的同源性或者有至少5%長度上的差異。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中其中第二特異性mRNA的序列與第一特異性mRNA有小于75%的同源性或者有至少2%長度上的差異。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中其中第二特異性mRNA的序列與第一特異性mRNA有小于65%的同源性或者有至少1%長度上的差異。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，進一步包括提供多個不同的含有不同序列的第一特異性mRNA。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，進一步包括提供多個不同的含有不同序列的第二特異性mRNA。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，進一步包括提供多個不同含有不同序列的第一特異性mRNA。11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中從樣品中純化多聚AmRNA包括將多聚A與寡聚(dT)雜交。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中寡聚(dT)被固定。13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在純化之前，將第二特異性mRNA加入到樣品中。14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中樣品包括全血。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，進一步包括將樣品和第二特異性mRNA加入到過濾設(shè)備的孔中。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中從樣品純化多聚AmRNA包括將裂解緩沖液施加到孔中。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中過濾設(shè)備是過濾膜。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，還包括從全血中去除紅細胞和血組分而不是白細胞，以得到白細胞。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在過濾之前全血是冷凍的。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在過濾之前，對樣品施加抗凝血劑。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中過濾膜附著到多孔過濾板上。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中每個過濾板施加10le"個拷貝的摻標(biāo)對照RNA。23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中每個過濾板施加le5le1Q個拷貝的摻標(biāo)對照RNA。24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中過濾膜是PBT纖維膜。25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中白細胞被捕獲在多個層疊在一起的過濾膜上。26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，還包括使用低滲緩沖液清洗過濾膜上的白細胞，以進一步去除紅細胞和其它血組分。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，還包括干燥過濾膜。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中用乙醇對過濾膜進行清洗，并進行真空吸引直到過濾膜干燥。29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中固定的板包括多孔固定寡聚(dT)的板。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，還包括將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的板上。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的板上包括離心。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的板上包括真空吸引。33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中將裂解物轉(zhuǎn)移到固定寡聚(dT)的板上包括施加正壓。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中對mRNA的定量包括特異性mRNA的cDNA合成以及對得到的cDNA的擴增。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，還包括在所述的mRNA定量的步驟中應(yīng)用特異性反義引物。36.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中由mRNA制備cDNA包括將PCR引物應(yīng)用到第一特異性mRNA和第二特異性mRNA。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中由mRNA制備cDNA進一步包括提供探針分子。38.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中定量cDNA的步驟包括cDNA的擴增。39.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中擴增包括PCR。40.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中擴增包括即時PCR。全文摘要文檔編號C12N1/06GK101696448SQ20091014938公開日2010年4月21日申請日期2004年10月29日優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日發(fā)明者三橋?qū)⑷松暾埲?日立化成工業(yè)株式會社;日立化成研究中心公司;