水稻秈型雜種育性基因S5-i的分離克隆及應用的制作方法

文檔序號：574900閱讀：536來源：國知局

專利名稱：水稻秈型雜種育性基因S5-i的分離克隆及應用的制作方法
技術領域：
本發明是申請號200710053552.9專利申請案的分案申請。本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一種秈型雜種育性基因5"5-i的分離克隆、功能驗證及在水稻改良中的應用。
背景技術：
水稻屬禾本科(Cra/B2'"eae)、未亞科(尸ooW朋e)的稻屬((2zrzese)，分為兩個栽培稻種亞洲栽培稻(Ory幼sa"ra L.)和非洲栽培稻(&丁za ^a6em'鵬)。亞洲栽培稻又分為秈亞種(ssp. i/2t/j'ca) 和粳亞種(ssp. j'a;w"化a)。兩個亞種在形態和遺傳上存在著明顯的差異，同時也存在著生殖障礙，秈粳亞種間雜種往往表現為不育或半不育(Kato S, Kosaka H, Hara S (1928) On the affinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants. S"ZZ Fac yferj'c A>osAu 〃m>, 3:132-147; Oka HI (1988) Origin of cultivated rice. Scientific Societies Press, Tokyo, Japan pp 181-209; Liu KD， Zhou ZQ, Xu CG, Zhang Q, Saghai Maroof船(1996) An analysis of hybrid sterility in rice using a diallel cross of 21 parents involving /"o^'cs, j'apcwics and wide compatibility varieties. Euphytica 90:275 -280)。水稻秈粳亞種間具有比水稻品種間更強的雜種優勢，但秈粳亞種間雜種的不育性卻限制了對其雜種優勢的利用。研究者利用各種遺傳標記對水稻秈粳亞種間雜種的不育現象進行了廣泛的研究。研究表明影響小穗育性的位點分別對應于胚囊育性和花粉育性，說明雄性敗育和雌性敗育對亞種間雜種敗育都有著很重要的作用。研究進一步表明，控制水稻秈粳雜種育性的基因在雜合狀態下往往發生不親和互作，使雄配子敗育或雌配子敗育，但是這些基因在純合狀態下(如純和的親本中)不影響配子的正常發育。
Ikehashi禾卩Araki (Ikehashi H， Araki H (1986) Genetics of Fi sterility in remote crosses of rice. In: IRRI (ed) Rice genetics. IRRI， Manila, pp 119-130)首先將一個影響雜種育性的位點定位在第6染色體的色素基因C和糯性基因盯之間，并命名為S5。他們通過對育性分離結果的考察，指出 S5位點是一組復等位基因Sfn (廣親和)、(秈稻)、5"fj (粳稻)。所述基因符號S代表雜種不育性(Sterility), n、 i和j分別代表中性型(neutral)也稱廣親和型(wide-compatibility)、秈型(j'/ A'ca) 和粳型(乂a/w/3ica)的復等位基因。其中，由Sfn/5^n、 5fn/ 5fi、 5^n/ S5二j組合而成的合子，雜種育性正常。而由S^jA ^i組成的合子，則表現為不育或半不育。
為了在雜交水稻育種中有效克服雜種不育性的問題，本發明通過圖位克隆(map-based cloning)技術獲得了水稻雜種育性基因55的多個等位基因，包括廣親和型Sf n、秈型和粳型5fj，通過轉基因實驗驗證了此基因的功能。該基因的分離克隆使得水稻秈粳亞種間雜種優勢的利用成為可能。其功能研究和應用將更好的利用水稻秈粳亞種間強大的雜種優勢，進一步提高雜交水稻的生物學產量。

發明內容
本發明的目的是從秈稻中分離克隆一個水稻秈型雜種育性基因Sf i，提供上述雜種育性基因所編碼的蛋白質，并對該基因進行功能驗證及在水稻雜交育種中的應用。所述的基因與天冬氨酰蛋白酶基因序列高度同源，其生物學功能為控制水稻秈稻和粳稻雜種的胚囊育性。該基因導致秈稻和粳稻雜交后代雌配子敗育，對利用秈粳亞種間的雜種優勢和提高水稻的生物學產量起重要作用。
本發明涉及分離和應用一個編碼天冬氨酰蛋白酶的秈型雜種育性基因S5-i的DNA片段，并對該片段的作用機理進行闡述。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 3所示，或者基本上相當于SEQ ID NO: 3所示的高度同源DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO: 3所示序列的亞片段。
可以采用己經克隆的秈型雜種育性基因S5-i的DNA片段作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發明的基因或同源基因。可以采用PCR技術，從栽培稻或野生稻的基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發明的秈型雜種育性基因S5-i以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。同樣也可以采取化學合成的方法獲得本發明的基因或同源基因。采用以上技術，可以分離得到包含秈型雜種育性基因S5-i的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體轉化植株，可獲得對粳稻雜交后代不育的轉基因植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區域可以是 ATG起始密碼子和鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。
攜帶有本發明秈型雜種育性基因S5-i的表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒載體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞(ffeissbach (1998) Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp. 411-463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2"d Edition))。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。

序列表SEQ ID NO: 1顯示的是本發明分離克隆的包含有5^n基因編碼區DNA片段序列。序列表SEQ ID N0:2顯示的是本發明分離克隆的包含有5^j基因編碼區DNA片段序列。序列表SEQ ID N0:3顯示的是本發明分離克隆的包含有基因編碼區DNA片段序列。
圖l: 55基因克隆和分離鑒定流程圖。
圖2: 5^基因效應下秈稻、粳稻和廣親和品種雜種育性示意圖。
圖3:互補載體構建示意圖。
圖4:遺傳轉化載體pCAMBIA1301的結構。
圖5: Ti代轉基因陽性植株(左)小穗不育和轉基因陰性植株(右)小穗可育。圖6: l代轉基因陰性植株(a)和轉基因陽性植株(b)花粉均可育。
圖7: t代轉基因陰性植株(a〉胚囊可育和轉基因陽性植株(b)胚囊敗育。標尺長度50Mm。圖8: T。代轉基因陽性植株和轉基因陰性植株(a)以及L代轉基因陽性植株和轉基因陰性植株(b)胚囊育性、花粉育性和小穗育性圖示。
圖9:廣親和品種、粳稻和秈稻W基因cDNA結構示意圖。圖10:廣親和品種、粳稻和秈稻S5蛋白結構示意圖。
圖ll: S5基因在水稻全生育期不同組織中表達水平示意圖。使用的芯片數據包括秈稻Zhenshan97和 Minghui 63不同生長時期下的25種不同組織。
圖12:體外檢測S5蛋白絕對活性(a)和相對活性(b)。其中絕對活性以水為對照測定，相對活性以該蛋白活性最高的點為對照測定。白色柱狀圖示意蛋白酶在不同pH條件下活性，深色柱狀圖示意蛋白酶活性被p印statin A抑制。
圖13: SDS-PAGE膠圖顯示S5蛋白在不同pH條件下自身剪接活性。
圖14:原位雜交確定^S^基因在水稻中的表達部位。(a)該基因在Ballila珠被和孢母細胞表達；(b) 該基因在02428珠心和孢母細胞中表達；(c)該基因在Ballila小孢子母細胞中表達。標尺長度為25陶。
具體實施例方式
以下實施例進一步定義本發明，并描述了本發明在上述前期工作基礎上分離克隆包含有55基因完整編碼區段的DNA片段以及驗證55基因功能的方法(發明流程如圖1所示)。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例l :分離克隆包含有S5基因區段的DNA片段
1.利用圖位克隆技術鑒定水稻S5基因
本發明中構建定位群體時用到了三個親本02428、南京ll和Balilla。 02428是一個粳型的廣親和品種，是選用兩個粳稻品種云南螃蟹谷和上海汲浜稻，分別用輻射誘變處理，并經高光效篩選出的材料間雜交，從后代中選育成的(鄒江石等，廣親和選系02428在秈粳亞種間雜交的初步利用.中國農業科學，
41989， 22: 6-14)。南京11為江蘇農科院育成的中秈品種，屬勝利秈衍生品系。巴利拉(Balilla)是引自意大利的粳型品種。
本發明在前期工作中構建了一個包含7000個單株的三交F!大群體。1999年春在海南陵水配制02428/ 南京ll雜交組合。同年夏天在武漢種植R代植株，篩選陽性單株。1999年冬天，將雜種稻篼移往海南陵水基地，并盡量分篼。在2000春天，以02428/南京11真雜種稻篼作為母本，與Balilla大量配制三交 F,雜種。2000年夏天，在水稻生長季節，在華中農業大學(武漢)水稻試驗田分單株植株02428/南京 11〃Balilla三交F,群體，最后共成苗7000株。
考察7000株三交R群體中所有高結實率的單株，總共獲得了 1000多株結實率在70%以上的單株。從中隨機選取202株結實率在70%以上的真雜種單株，進行DNA抽提和標記分析，對5^區段的分子標記進行重組交換分析。DM的抽提按Murray和Thompson的CTAB法進行(Murray M G, Thompson W F (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant ■. Nucl Acids Res. 8: 4321-4325)。分子標記的RFLP分析，包括DNA酶切、電泳、轉膜和雜交，按Liu等人(Liu K D et al. (1997) A geno鵬-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theor Appl Genet. 95:809-814)的實驗程序進行。55基因限定在分子標記N29和23D12R之間，結果如表l所示。
表l 利用202株高結實率單株對廣親和基因的定位
交換單株數 68 68 55 52 52 50 51 53 53 65
選取SSR標記RM253或PCR—RFLP標記Cll和RG213對所有高結實率的單株進行了掃描，單株用到SSR 標記RM276和RM225進行篩選。其中，標記RM225、 RM253和Cll位于基因S5的一側，標記RG213和RM276 位于基因S5的另一側。共篩選到了 44株在標記之間發生重組的單株。利用S5區段的分子標記對這44株高結實率的重組單株進行了重組分析，結果顯示^5基因限定在分子標記7B1和15D2之間，兩端各有一個重組單株，部分重組單株的信息如表2所示。
表2 利用S5區段的分子標記對44株重組單株的基因型分析(部分數據)
F 0a 0
F 0 0
F 0 0
F 1 1
F 1 1
r i i
0 0
1 1 1
1 1 1
1 1 1
0 0 0
0 0 0
'Genotype 0 of each locus was composed of an allele from 02428 and an allele from Balilla bGenotype 1 of each locus was composed of an allele from Nanjing 11 and an allele from Balilla 上述結果將55基因定位在兩個亞克隆分子標記7B1和15D2之間約40 kb的DM區段上。利用 http:〃www. softberry. com網站上的FGENSH軟件對分子標記7B1和15D2之間40 kb的DNA片段進行了開放閱讀框(open reading frame: 0RF)的預測，共檢測到了 5個完整的ORFs, Blaxt X同源性分析發現候選基因0RF5與天冬氨酸蛋白酶(eukaryotic aspartyl protease)高度同源。
R2171
RG138
KG213
23D12R
N29
Cll
RM253
RZ450
KZ398
記
標
RG213
G200
WG138
R2349
23D12R
F7
7D3
7F11
15D2
7B1
F29
F34
F38
M6
1
Cll
E23
A30
RM253
Genotype
Individual
s2.遺傳轉化載體的構建及轉基因植株的表現
本發明基因S5位點是一組復等位基因5^n(廣親和)、5f i(秈稻)、5f j(粳稻)。其中，由5^n/5^n、 Sfn/5:i、 S&n/j組合而成的合子，雜種育性正常。而由S5"j/5^i組成的合子，則表現為不育或半不育(圖2)。根據此基因的功能，申請人采取將秈稻片段轉化粳稻植株的策略，從轉基因植株(基因型 j/5^j+S^i)的育性表型來驗證。此基因將會產生不育表型。
互補載體的構建方法是根據秈稻南京11基因組序列設計PCR引物ASPHF(5'-TAMAAGCTTCATCATaGCTGCTGCTAGATGGA -3')和ASPHR (5' - TGCTMGCTTTACGAGGTCATGGGTTGAAGTCCT -3') 將候選基因區段擴增出來，互補載體外源PCR擴增反應所用的試劑來自Takara公司，反應條件為94'C， 3 min; 94°C， 1 tnin, 60。C， 1 min, 68°C， 6 min, 30 cycles; 72°C， 5 min。
互補載體構建示意圖如圖3所示。PCR產物直接用HindIII酶切，雙元載體(圖4) pCAMBIA1301 (來自澳大利亞CAMBIA實驗室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture),攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米強啟動子Ubiquitinl的農桿菌介導的遺傳轉化載體)也采用HindIII酶切，去磷酸化后連接。轉化大腸桿菌DH1013 (購自Invitrogen公司)，篩選陽性克隆。釆用農桿菌介導的方法轉化，農桿菌菌株為超毒力菌株EHA105 (Sun X， Cao Y, Yang 2， Xu C， Li X, 沐ang S， Zhang Q (2004) Ja鄰 a gene conferring resistance to Ja/ A咖o朋s orj^ae pv. orjzae in rice, encoding a LRR rec印tor kinase-like protein. Plant J 37:517-527)，轉基因的受體為粳稻品種Balilla。
本發明遺傳轉化的主要步驟、培養基及其配制方法如下所述
(1) 試劑和溶液縮寫
本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA (6-BenzylarainoPurine, 6-芐基腺嘌呤)；CN (Carbenicillin'羧節青霉素)；KT (Kinetin，激動素)；NAA (N抑thalene acetic acid, 萘乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid,卩引哚乙酸)；2， 4_D (2, 4-Dichlorophe麗yacetic acid, 2,4-二氯苯氧乙酸)AS (Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate' 水解酪蛋白)；HN (Hygromycin B，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6腿x (N6 大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS 微量元素成分溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培養基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制) 硝酸鉀(KN03 ) 28 . 3克磷酸二氫鉀(KH2P04) 4.0克
硫酸銨((NH4)2S04 ) 4 . 63克
硫酸鎂(MgS04 7H20) 1. 85克
氯化鈣(CaCl 2H20) 1.66克
將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至iooo毫升。
2) N6培養基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制碘化鉀(KI) 0.08克
硼酸(H3B03) 0. 16克
硫酸錳(MnS04 4H20) 0. 44克
硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 15克
將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。
3) 鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)
將3. 73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2ft0)和2. 78克FeSCV7H20分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000毫升，至70'C溫浴2小時，4'C保存備用。
64) 維生素貯存液(按照100X濃縮液配制) 煙酸(Nicotinic acid) 0. l克維生素Bl (Thiamine HC1) 0. l克維生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. l克甘氨酸(Glycine) 0. 2克肌醇(Inositol) IO克加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存備用。
5) MS培養基大量元素母液(MSmax母液)(按照IOX濃縮液配制) 硝酸銨(NH4N03) 16. 5克
硝酸鉀 19.0克
磷酸二氫鉀 1.7克
硫酸鎂 3.7克
氯化鈣 4.4克
將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
6) MS培養基微量元素母液(MSrain母液)(按照100X濃縮液配制) 硫酸錳(MnS04 4H20 ) 2. 23克
硫酸鋅(ZnS04 '7H20) 0.86克硼酸(H3B03 ) 0. 62克
碘化鉀(KI) 0.083克鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0. 025克
硫酸銅(CuS04 5H20 ) 0. 00 25克
氯化鈷(CoCl2'6H20 ) 0. 00 25克
將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
7) 2,4-D貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，于室溫下保存。
8) 6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，室溫保存。
9) 萘乙酸(NM)貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取NM100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存備用。
10) 吲哚乙酸(IAA )貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取IM100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，4"C保存備用。
11) 葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制
秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4'C保存備用。
12) AS貯存液的配制
秤取AS 0.392克，加入DMS0 10毫升溶解，分裝至l. 5毫升離心管內，4'C保存備用。
13) 1N氫氧化鉀貯存液
秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存備用。 (3)用于水稻遺傳轉化的培養基配方 1)誘導培養基
N6max母液(取已經制備好的10X濃縮液，下同) IOO毫升N6mix母液(取已經制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
Fe2+EDTA貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
維生素貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
2， 4-D貯存液(取上述制備好的) 2. 5毫升
脯氨酸(Proline) 0. 3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口后按常規方法滅菌(例如121'C下滅菌25分鐘，下述的培養基滅菌方法與本培養基的滅菌方法相同)。
2) 繼代培養基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA Jt存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
2, 4-D貯存液 2. 0毫升
脯氨酸 0.5克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
3) 預培養基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D貯存液 0. 75毫升
CH 0. 15克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升 /皿)。
4) 共培養基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe"EDTA C存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D貯存液 0. 75毫升
CH 0.2克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克N6max母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2+EDTA Jt存液(100X)
維生素貯存液(100X)
2, 4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升/ 每皿)。
5) 懸浮培養基
N6max母液(10X) 5毫升 N6mix母液(100X) 0. 5毫升
Fe2+EDTA JC存液(100X) 0. 5毫升
維生素貯存液(100X) l毫升 2, 4-D貯存液 0. 2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸餾水至100毫升，調節pH值到5.4，分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入l毫升無菌葡萄糖C存液和100微升ASC存液。
6) 選擇培養基
25毫升 2.5毫升 2. 5毫升 2.5亳升 0. 625毫升 0.喊 7. 5克 L75克
加蒸餾水至250毫升，調節pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升)分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7) 預分化培養基
N6max母液(10X) 25毫升 N6mix母液(100X) 2. 5毫升
Fe2+EDTA C存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升 6-BA貯存液 0. 5毫升
KT貯存液 0. 5毫升
NAA於存液 50微升 IM貯存液 50微升 CH 0. 15克
蔗糖 7.5克
瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1 N氫氧化鉀調節pH值到5.9,封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升) 毫升/皿)。
8) 分化培養基
N6max母液(10X) IOO毫升 N6mix母液(100X) IO毫升
分裝倒入培養皿中(25
9Fe2+EDTA Jt存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
6-BA貯存液 2毫升
KT貯存液 2毫升
NM貯存液 0. 2毫升
iM ie存液 0. 2毫升
C H l克蔗糖 30克 Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，1 N氫氧化鉀調節pH值到6.0。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。 9)生根培養基
MSmax母液(10X) 50毫升 MSmix母液(100X) 5 Fe2+EDTA Jt存液(100X) 5 維生素貯存液(100X) 5 蔗糖 2 Phytagel 3 加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調節pH值到5. 8。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。 (4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟 4. 1愈傷誘導
1) 將成熟的Ballila水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；
2) 用滅菌水洗種子4-5次；
3) 將種子放在誘導培養基上；
4) 將接種后的培養基置于黑暗處培養4周，溫度25土rC。 4.2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度25士1'C。 4. 3預培養
挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養基上黑暗下培養2周，溫度25土rC。 4. 4農桿菌培養
1) 在帶有對應抗性選擇的LA培養基(LA培養基的配制參照J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002，北京)上預培養農桿菌5K1W5(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株)兩天，溫度28'C;
2) 將農桿菌轉移至懸浮培養基里，28。C搖床上培養2-3小時。 4. 5農桿菌侵染
1) 將預培養的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；
2) 調節農桿菌的懸浮液至0D 0. 8-1. 0;
3) 將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
4) 轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養基上培養3天，溫度19-2(TC。 4. 6愈傷洗滌和選擇培養
1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；
2) 浸泡在含400毫克/L潮霉素的滅菌水中30分鐘；
毫毫毫喊克
103) 轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
4) 轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2-3次，每次2周。 4. 7分化
1) 將抗性愈傷轉移至預分化培養基上于黑暗處培養5-7天；
2) 轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26。C。 4.8生根
1)剪掉分化時產生的根；
然后將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26°C 。 4.9移栽
洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。
本發明共獲得獨立轉基因T。代水稻植株33株，包括29株陽性單株和4株陰性單株。所獲得的L代水稻植株以B10家系為例，包括15株陽性單株和14株陰性單株。
轉基因水稻陽性和陰性植株小穗育性(圖5)差異顯著(t=7.4， /M).0000);轉基因水稻陰性植株小穗平均育性(53.3%)遠高于轉基因水稻陽性植株2. 8%的小穗育性。申請人亦檢測了 T。代轉基因水稻植株的胚囊育性和花粉育性，其中花粉育性在轉基因陽性和陰性水稻植株中無顯著差異(見圖6)，而轉基因陰性植株胚囊育性顯著高于轉基因陽性植株胚囊育性(圖7) (t=12.33, P=0.0000)。 T。代轉基因陽性植株和轉基因陰性植株以及t代轉基因陽性植株和轉基因陰性植株胚囊育性、花粉育性和小穗育性如圖8所示，結果表明本發明克隆的秈型雜種育性基因51^i參與決定秈稻和粳稻亞種間雜交后代的雌配子育性，將導致胚囊敗育，進而導致雜種育性降低。
3.含有S5基因區段的DNA片段的分離克隆
分別使用cDNA末端快速擴增(RACE)和PCR引物延伸的方法獲得該基因全長cDNA。使用材料為秈稻南京ll，粳稻Ballila和廣親和品種02428幼穗發育的五期葉片，液氮冷凍后于-70'C冰箱待用。按照TRIZOL 說明書所述步驟提取RNA (注TRIZOLReagent, InvitrogenCat. No. 15596-018),稀釋濃度至lug/wl， -70匯保存待用。
RACE具體步驟使用Clontech的SMART MCE cDNA Amplification Kit,步驟參照該試劑盒說明書。 5'端RACE引物S5-GSP1: CCGTTCCMCCAGMTAGTCGTGCT
S5-R1: ACCCGAACATGAGATCCATMACGA 3'端MCE引物S5-GSP2: AAGATGGTGACAGACACGCTGAGGA
S5-RACE4: CMTCMCAGGCCAACCTACTCAC UPM: Long (0.4M): CTMTACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCM CGCAGAGT
Short (2uM): CTMTACGACTCACTATAGGGC NUPM: MGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 其中UPM和NUPM由上述試劑盒提供。第一輪PCR反應條件-94'C變性30秒，72'C3分鐘，5個循環； 94。C變性30秒，7(TC退火30秒，72'C延伸3分鐘，5個循環； 94。C變性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸3分鐘，27個循環； 72'C最終延伸10分鐘。 5'貼0￡使用引物1^1 + S5-GSP1 3' RACE使用引物UPM+ S5-GSP2 第二輪PCR反應條件 94'C預變性4分鐘94。C變性l分鐘，59'C退火1分鐘，72。C延伸l分鐘20秒，35個循環；
72'C最終延伸IO分鐘。
5' RACE使用引物NUPM+ S5-R1
3' RACE使用引物NUPM+ S5-RACE4
PCR引物延伸具體步驟反轉錄采用20 u 1體系，按照DNaseI說明書所述步驟去除RNA中痕量DNA 后，按Superscript II說明書所述步驟操作，產物于-20'C保存待用。(注Deoxyribonuclease I， Invitrogen Cat. No. 18068-015; Superscript II Reverse Transcriptase , Invitrogen Cat. No. 18064-022)使用上述反轉錄產物lu 1為模板做PCR。使用rairara ￡x T^ (Takara code: DRR01AM)做 PCR， PCR所用試劑均來自T^ara ￡y 7a。包裝。
PCR所用引物如下 F5-3: ATCMCCCATTTCCTTTCCTACG F5-2: CTGCCCCTGAGCMGCMGAAAG F19-3: AGCCGACGACGAGTTGGAGTGT 5F2 CCMGATCTGCCGACGACGAGTTGGAGTGT BDF2: GACGACGAGTTGGAGTGT S5-F11: CAGCCGACGACGAGTTGGAGT S5-F2: GTGCGGCGAGCTGAGGTACGAT S5-GSP2: MGATGGTGACAGACACGCTGAGGA S5-RACE4: CAATCMCAGGCCMCCTACTCAC Rll: ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA BDR: CATTAGGMCAGGAAGTCGT S5-mi: CTCTGCCCGTTGGCGATMGC S5-R2: TCTGGGTGGCMAGCGAGTGC S5-R33: ATGGCGGCACGGTCGTATCTT R3-1: ACGTAAACATCTAGTAGTGGCTCA R3-2: TTGGCACGMCGGTTCMGAG R3-3: GATCAGTTATTTGGGCAAACCAG R3-4: GGTCCCAAATCMGTACCGCTAG R3-5: GCTCAACMTTAGGACATACGAC
分別對RACE產物和PCR產物測序獲得所需全長基因。
實施例2: i"5基因在水稻不同亞種的結構分析
對實施例1中測序得到的序列進行分析水稻品種02428 (廣親和)、Ballila (粳稻)和南京11 (秈稻)的全長cDNA分別是1778bp、 1912bp和1911bp，其結構由三個外顯子和兩個內含子組成(圖9)。秈稻和粳稻有且僅有三個堿基的差異，其中南京11在3'非翻譯區有一個單堿基的缺失，南京11和Ballila 在編碼區有兩個單堿基多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)，這兩個SNP在編碼蛋白中形成兩個錯義突變(圖10) 。 55基因編碼一個472氨基酸的蛋白質，BLASTp分析 (http:〃www.ncbi.nlm.nih. gov/ )表明該蛋白與天冬氨酰蛋白酶高度同源。PROSITE (http:〃www. expasy. ch/cgi-bin/prosite/)分析發現該蛋白在第129-140個氨基酸和334-345個氨基酸存在兩個活性位點。SignalP 3.0 (http:,//www. cbs. dtu. dk/cgi-bin/)軟件分析表明S5蛋白存在一個信號肽，它在蛋白成熟過程中被切除。
實施例3:利用芯片數據檢測S5基因在水稻全生育期中表達水平
本發明利用芯片數據(Database of the National Center of Plant Gene Research, available athttp:〃cr印.ncpgr.cn/.)檢測基因在水稻全生育期不同組織中表達水平，使用的芯片數據包括秈稻 Zhenshan 97和Minghui 63不同生長時期下的25種不同組織(表3)的表達譜(圖11)。結果表明55基因在全生育期都極低水平表達。
_^_芯片數據對應水稻組織名稱_
1 Calli:15 day after induction
2 Resistant calli-screening stage
3 Seed: germination (72 h after imbibition)
4 Seedling: 3 days after sowing
5 Seedling: trefoil stage
6 Shoot: seedling with 2 tillers
7 Root: seedling with 2 tillers
8 Panicle: secondary branch primordium differentiation stage
9 Leaf: secondary branch primordium differentiation stage
10 Sheath: secondary branch primordium differentiation stage
11 Panicle: 4-5 cm young panicle
12 Leaf: 4-5 cm young panicle
13 Sheath: 4-5 ctn young panicle
14 Panicle: pistil/stamen primordium differentiation stage
15 Panicle: pollen-mother cell formation stage
16 Stem: 5 days before heading
17 Flag leaf: 5 days before heading
18 Stem: heading stage
19 P肌icle: heading stage
20 Glume: one day before flowering
21 Stamen: one day before flowering
22 Spikelet: 3 days after pollination
23 Endosperm: 7 days after pollination
24 Endosperm: 14 days after pollination
_25 Endosperm: 21 days after pollination_
實施例4: S5蛋白具有天冬氨酰蛋白酶活性
天冬氨酰蛋白酶在酸性條件下被激活且其活性為pepstatin A所抑制(Rawlings ND， Barrett AJ (1995) Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods Enzymol. 248:105-20)。而本發明基因與天冬氨酰蛋白酶高度同源，為了驗證本發明基因6^是否編碼一個典型的天冬氨酰蛋白酶，本實例設計一個體外實驗來驗證S5蛋白是否具有這一功能。
具體實施步驟為 (1)原核表達載體構建
設計引物5F1 (5， -GGGAGATCTATGGTGATCTTCGAGCAGCCA-3，，接頭加BglII酶切位點)和5R (5，-AGGCTCGAGCGACGATCAGCAAACGGCA-3' 接頭加Xhol酶切位點)，以日本晴全長cDNA (來自北京凱拓公司) 為模板PCR擴增全長。PCR擴增反應所用的試劑來自Takara公司。反應條件為94'C， 5min; 94。C， 1 min， 59。C， 1 min， 72。C， 1. 5min， 30 cycles; 72°C， 5 min。產物構建到pGEM ~T (購自Promega)載體中，測序驗證。然后分別將外源構建到pMAL-c2x載體中(購自&"sZ^)，載體用BamHI和XhoI酶切。 (2〉蛋白誘導表達將構建好的表達載體轉化表達菌株BL21 (購自Irwitrogen公司)，等菌液0D值達到0. 6時，加入終濃度為0. 5mM的IPTG(isopropyl 1-thio-P -D-galactopyranoside)，然后37。C誘導表達3hrs。收集菌體，加入一倍體積的PBS懸浮，置-20 'C過夜。第二天溶解，立即放在冰上，加入終濃度為lmM的PMSF，超聲處理，整個超聲過程在冰上進行，以保證蛋白處于天然狀態。超聲處理完成之后12000rpm, 4'C冷凍離心。收集上清，用Amylose Resin (購自純化。純化步驟參照pMAL Protein Fusion and Purification Instruction Manual, Catalog #E8000S
(3) 蛋白酶活性檢測
20nl (10u g)純化的蛋白，加入等體積的pH緩沖液與20u 1 FITC-case in (Protease Fluorescent Detection Kit), 37"C下反應15小時后加入lOOul 0. 6N TCA (三氯乙酸)沉淀，12000rpm離心lOmin，吸上清100ul，加入2ml assay buffer,用熒光分光光度計(Fluorescence spectrophotometer, Hitachi850) 測量。水為對照。
pH緩沖液配方
0. 1M Gly-HCl， pH2. 5
0. 1M 0. 1 M sodium citrate, pH3. 0， pH3. 5, pH 4.0: 0. 1M sodium acetate, pH 5.0; 0. 1 M sodium phosphate, pH 6.0;
(4) 檢測ASP是否被p印statin A抑制劑抑制
實驗步驟8ug純化的目標蛋白中加入終濃度為0. 15mM p印statin A， 4°C孵育1.5小時后，加入 pH=3的緩沖液至終體積40u 1，然后再加入底物FITC-Casein 20 u 1 (sigma, PFOIOO)， 37 。C下孵育12小時后，加入100 u 1 0. 6NTCA沉淀，吸上清100 u 1，加入2ml assay buffer,用熒光分光光度計(Hitachi M850 fluorescence spectrophotometer , Japan)測量。只含有標簽MBP (麥芽糖結合蛋白)的純化蛋白作為對照，每個做三次重復。
(5) 天冬氨酸蛋白酶的自身剪接，形成成熟蛋白的初步分析
原核表達純化的J印10ia(20ng)，加入1/2體積的PH緩沖液，37'C反應過夜，加入一倍體積的 loading buffer,水煮5min, 12%SDS-PAGE電泳，考馬斯藍染液染膠。
結果表明該蛋白在pH3.0的條件下活性最高(圖12)，且被p印statin A完全抑制(圖12)。實驗同時表明該蛋白PH 2. 5-4. 0的條件下通過自身剪接，形成成熟蛋白(圖13)。
上述結果表明本發明基因確實編碼一個典型的天冬氨酰蛋白酶。實施例5: 5^基因的表達部位
為了確定S5基因的表達部位，本實例使用了 RNA原位雜交技術。根據RNA探針雜交信號確定本發明基因在珠心、珠被、孢母細胞和小孢子母細胞中表達(圖14)。
RNA原位雜交流程參見Drews (Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71 Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353—71)。
14<110>華中農業大學
〈120>水稻秈型雜種育性基因,
<130〉
〈141〉2007-10-10
<腸7
<170>Patentln version 3. 1
<210>1
<211>1778
<212>DM
<213〉7JC稻(0ryza sativa)
<220〉
<221>g6H6
<222>(l).. (1778)
<223>
<220〉
<221>5'UTR
<222>(1441).. (1778)
<223〉
〈220〉
<221>3'UTR
〈222〉(l)..加
<223>
<220〉
〈221〉CDS
<222>(22). (1440)
<223〉
〈400〉1
的分離克隆及應用
atcaacccat ttcctttcct a cgt ttg
Arg Leu 1
c犯gaa aga aag aaa gaa ggg ￡itt Gin Glu Arg Lys Lys Glu Gly lie 15
gca gcc gac gac gag ttg gag tgt Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys 30
gtg aac tct caa ggc gcc att cag Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin 45
caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val 60 65
act gcc Thr Ala
aaa ttt Lys Phe 20
ccc tec Pro Ser
35 ttc ccc Phe Pro 50
cgt gca Arg Ala
tgc Cys 5
get Ala
ctg Leu
taa
ccc ctg Pro Leu
tec ggc Ser Gly
tec ate ttc gat Ser lie Phe Asp
gtg Val
Thr
ttc Phe
cag Gin
esc aag His Lys 55
gca tec Ala Ser 70
站c Ser
gcc Ala
ca>c
His
40
aag
Lys
Lys 10
Thr 25 get Ala
ceic His
teg acc Ser Thr
51
99
147
195
243
15gga gca tea gga gca gga a犯gga gga gga ttg aac aat eta cag gaa 291 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gin Glu
75 80 85
gag gag ate act tea tea agt agt aca aaa ate gac gtg ate gaa gac 339 Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie A印Val lie Glu Asp 90 95 100 105
age age ate aac gac ttc ctg ttc eta atg gcc gtc agt ctg ggc aag 387 Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Ser* Leu Gly Lys
110 115 120
cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga tec acc etc teg 435 Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser
125 130 135
tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac acg cag tec gcg 483 Trp Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His Thr Gin Ser Ala
140 145 150
aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac aca tec egg cga 531 Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg
155 160 165
gtt cgc tgc teg teg gtx aag tgc ggc gag ctg agg tac gat ctg egg 579 Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg 170 175 180 185
etc cag caa gcc犯t tgc stg gag朋g gas gsc age tgc acg toe age 627 Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser
190 195 200
gtc acg tac ggg犯c ggg tgg gcg tac age gtg ggc卿atg gtg aca 675 Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr
205 210 215
gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc atg ttc ggg tgc 723 Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys
220 225 230
age atg gat gtc aag tac age gaa ttc gag gcc ggc ate ttt ggt ttc 771 Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly lie Phe Gly Phe
235 240 245
ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca ggg tac cct gat 819 Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala Gly Tyr Pro Asp 250 255 260 265
att ctg agt tac aag gca ttc age tac tgc ttg ccc act gac gag acc 867 lie Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr
270 275 280
aag ccc gga tac atg ate ctg gga aga tac gac cgt gcc gcc atg gat 915 Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp
285 290 295
ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg cca ace tac tea 963 Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg Pro Thr Tyr Ser300 305 310
ctg acg atg gag atg ctt ate gcc aac ggg cag aga ttg gtg aca tcg 1011 Leu Thr Met Glu Met Leu lie Ala Asn Gly Gin Arg Leu Val Thr Ser
315 320 325
tct tcg gag atg ate gtc gat tec ggg gcc cag agg acg tec ctg tgg 1059 Ser Ser Glu Met lie Val A印Ser Gly Ala Gin Arg Thr Ser Leu Trp 330 335 340 345
cct tec act ttt get etc ctt gac aag acc ate acg cag gca atg tcg 1107 Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr Gin Ala Met Ser
350 355 360
tcg att ggg tat cac egg aca tea aga gcg cgc caa gaa tea tac ate 1155 Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin Glu Ser Tyr lie
365 370 375
tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac ggc acc ate acg 1203 Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr lie Thr
380 385 390
ccc ttc tec aac tgg tec gcc ttg cct ctg ctg gag ate ggc ttc gcc 1251 Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu lie Gly Phe Ala
395 400 405
ggc ggt get gca etc get ttg cca ccc aga aac gtc ttc tac aac gat 1299 Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val Phe Tyr Asn Asp 410 415 420 425
cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt get cag aat cct get etc a_gg 1347 Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn Pro Ala Leu Arg
430 435 440
tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tec ttc gga aca acc ttc 1395 Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe GlyThr Thr Phe 445 450 455
gac ate cag ggg 3a8 c犯ttc ggc ttc aaa tat gcc get tgc tga 1440 A印lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Ala Cys
460465470
tegtcgattattcctcatcctatgatatatcttatagcttgegggtcgat taattagctg1500
gtttgccc肌ataactgatcggattggagtcttctcccgcgctacactac ccctagctgc1560
gategtateacaagctagcggtacttgatttgggacctaattcgttcaaa aaaaacttgg1620
cagcttaatttggg織t3gtagctagctgagccactact￡tgatgttta<c gtsccagct31680
tccgtcgtttgtttgtgtctcctgtgcttgtgetaaaectatctcttgaa ccgttcgtgc1740
caacttaattatttggtcgtatgtcct犯ttgttgatc1778
<210> 2 〈211〉 21 〈212〉 PRT
<213> 水稻(Oryza sativa) 〈400> 2
Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys Gin Glu Arg Lys Lys Glu 15 10 15Gly lie Lys Phe Ala 20
<210〉 3
<211〉 450
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
〈400〉 3
Ser Gly AlaThrAlaAlaAspAspGluLeuGluCysProSerSerlie
151015
Phe Asp HisAlaValAsnSerGinGlyAlalieGinPheProValPhe
202530
His Lys LysHisGinCysLeuArgProTrpSerValArgAlaThrGin
354045
Ala Ser SerThrGlyAlaSerGlyAlaGlyLysGlyGlyGlyLeuAsn
505560
Asn Leu GinGluGluGlulieThrSerSerSerSerThrLyslieAsp
65707580
Val lie GluAspSerSerlieAsnAspPheLeuPheLeuMetAlaVal
859095
Ser Leu GlyLysProProValValAsnLeuValAlalieAspThrGly
100105110
Ser Thr LeuSerTrpValGinCysGinProCysAlaValHisCysHis
115120125
Thr Gin SerAlaLysAlaGlyProliePheAspProGlyArgSerTyr
130135140
Thr Ser ArgArgValArgCysSerSerValLysCysGlyGluLeuArg
145150155160
Tyr Asp LeuArgLeuGinGinAlaAsnCysMetGluLysGluAspSer
165170175
Cys Thr TyrSerValThrTyrGlyAsnGlyTrpAlaTyrSerValGly
180185190
Lys Met ValThrAspThrLeuArglieGlyAspSerPheMetAspLeu
195200205
Met Phe GlyCysSerMetAspValLysTyrSerGluPheGluAlaGly
210215220
lie Phe GlyPheGlySerSerSerPheSerPhePheGluGinLeuAla
225230235240
Gly Tyr ProAsplieLeuSerTyrLysAlaPheSerTyrCysLeuPro
245250255
Thr Asp GluThrLysProGlyTyrMetlieLeuGlyArgTyrAspArg
260265270
Ala Ala MetAspGlyGlyTyrThrProLeuPheArgSerlieAsnArg
275280285
Pro Thr TyrSerLeuThrMetGluMetLeulieAlaAsnGlyGinArg
18290 295 300
Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met lie Val Asp Ser Gly Ala Gin Arg 305 310 315 320
Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr
325 330 335
Gin Ala Met Ser Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin
340 345 350
Glu Ser Tyr lie Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn
355 360 365
Gly Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu
370 375 380
lie Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val 385 390 395 400
Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn
405 410 415
Pro Ala Leu Arg Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Thr Phe Asp lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr Ala 435 440 445
Ala Cys 450
<210>4
<211>1912
<212>醒
<213>水稻(Oryza sativa)
〈220>
<221>g6H6
<222〉(l).. (1912)
〈223>
〈220〉
<221〉5'證
<222>(1577)(1912)
<223>
〈220〉
<221>3'UTR
<222>(l).. (157)
<223>
<220>
<221〉CDS
<222〉(158).. (1576)
〈223〉
<400>4
atcaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga 60 aagaaagaag ggattaaatt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt aacaatgact 120gactttteat ttgtttgcag ctagggtggg gatcgag atg gtg ate ttg ga<g cag 175
Met Val lie Leu Glu Gin 1 5
cca cag ctg etc ctt ctt ctt ctt ctt ctt gta gca get gca get gca 223 Pro Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala
10 15 20
acc ggc gcc aca gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tec tec ate 271 Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser lie
25 30 35
ttc gat cac get gtg aac tct caa ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc 319 Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin Phe Pro Val Phe
40 45 50
cac aag aag cac caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag 367 His Lys Lys His Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gin 55 60 65 70
gca tec teg acc gga gca tea gga gca gga aaa gga gga gga ttg aac 415 Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn
75 80 85
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90 95 100
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105 110 115
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120 125 130
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155 160 165
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170 175 180
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185 190 195
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235 240 245
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250 255 260
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315 320 325
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360 365 370
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lie
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65
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Ala
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Leu115lie
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Ala
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Leu
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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<210><211〉〈212>〈213〉<220><221〉<222>〈223〉〈220〉<221><222><223><220〉
6
1911
DNA
水稻
g6ri6(l)..
(Oryza sativa)
(1911)
5'UTR
(1577).. (1911)
23<221> 3' UTR〈222〉 (1)..(157)〈223〉〈220〉
〈221> CDS
〈222〉 (158).. (1576)
<223〉
<400> 6
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1 5 1015
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Phe
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Pro
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Ser
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Gly
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Asn
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Lys
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Leu 320 Val
Leu
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Cys
Asn
Gin
2權利要求
1、分離克隆的秈型雜種育性基因S5-i，它是(a)SEQ ID NO3中第1-1911位所示的核苷酸序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質相同的蛋白質的核苷酸序列。
2、權利要求l所述的基因在水稻改良中的應用。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一個水稻秈型雜種育性基因S5-i的分離克隆、功能驗證及其在改良水稻中的應用。本發明包括秈型雜種育性基因的DNA序列和其編碼的天冬氨酰蛋白酶。水稻秈稻和粳稻兩個亞種之間具有比水稻品種間更強的雜種優勢，但秈粳亞種間雜種的不育性卻限制了對其雜種優勢的利用。本發明克隆的秈型雜種育性基因對克服水稻秈粳亞種間雜種的不育性起重要作用。
文檔編號C12N15/82GK101684469SQ20091014886
公開日2010年3月31日申請日期2007年10月15日優先權日2007年10月15日
發明者丁寄花, 劉克德, 張啟發, 歐陽亦聃, 陳炯炯申請人:華中農業大學

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