專利名稱：微生物發酵法豬血清蛋白抗氧化肽的方法及其產品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種天然食品抗氧化劑的制備方法，尤其涉及一種采用微生物發酵 法制備具有抗氧化活性的豬血清蛋白多肽的方法以及由該方法制備得到的產品，屬 于抗氧化多肽制品領域。
背景技術：
動物血液是屠宰加工的主要副產物，蛋白質含量約為18°/ 左右，但是在我國血 液的利用率卻很低，因此造成蛋白資源的巨大的浪費并且隨之帶來較大的環境壓 力。目前，利用不同蛋白資源開發功能多肽已經成為研究的熱點。
豬血清蛋白具有良好的抗氧化作用，它保護生命的正常運行。血清蛋白是血液 循環中主要的抗氧化劑，根據文獻報道，血清蛋白可以保護培養的細胞使其免受氧 自由基的傷害；血清蛋白能抑制鐵離子催化的脂質氧化；體內試驗研究則表明，血 清蛋白具有保護人的低密度脂蛋白(LDL)使其免受氧化和防止紅細胞的溶血作用。
現有的豬血清蛋白抗氧化肽的制備方法在發酵過程中，由于微生物代謝，可產 生一系列的腥味或者腥臭味，影響了豬血清蛋白抗氧化肽的感官評定指標，因此需 要對發酵液進行脫腥脫臭處理，以增加其利用的價值和范圍。
發明內容
本發明目的在于克服現有技術的不足，提供一種豬血清蛋白抗氧化肽的制備 方法，該制備方法所得到的豬血清蛋白多肽在體外和體內均具有優異的抗氧化活 性；
本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的
一種采用微生物發酵法制備豬血清蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步驟
(1) 將豬血清蛋白進行微濾處理；
(2) 將微濾處理后的豬血清蛋白接種枯草芽孢桿菌菌懸液，發酵；
(3) 將發酵液經離心，取上清液，濃縮，冷凍干燥，即得；步驟(1 )中所述的豬血清蛋白的濃度優選為2-6% (w/w),更優選為4% (w/w); 步驟(1 )中所述的微濾處理優選為將豬血清蛋白經過0. 45 ja m的微孔率膜 過濾殺菌；
步驟(2)中所接種的枯草芽孢桿菌的接種量為1-5% (W/W),優選為4%。 枯草芽孢桿菌是一種常見的、以周生鞭毛運動的革蘭氏陽性芽孢桿菌。細胞染 色均勻，很少成鏈。芽孢橢圓形。菌落圓形或不規則形；表面色暗，有皺褶狀，不 透明。在液體培養基中不混濁或輕度混濁，表面有呈暗色、帶皺褶的菌膜飄浮。具 有較強的蛋白酶活力，主要應用于蛋白質的分解，提高蛋白利用率，以及提高多肽 的含量。枯草芽孢桿菌可以通過商業途徑購買得到，例如，可以購自于中國工業微 生物菌種保藏管理中心，菌種編號為CICC10063;
步驟(2)中所述的發酵優選在以下條件下進行發酵溫度為30 - 37°C,發酵 時間為24-84小時；更優選的，所述的發酵在以下條件進行發酵溫度為3(TC,發 酵時間為72小時。
其中，步驟(3)中為了達到更好的分離效果，優選的，將濃縮后的發酵液采 用超濾設備進行膜分離；更優選，將濃縮后的發酵液依次通過分子量為3000Da, 6000Da和10000Da的平^反膜，可獲得抗氧化活性最強的分子量在3000Da以下的肽 段，該肽段具有高的抗氧化活性和清除自由基的能力。
本發明方法所制備得到豬血清蛋白多肽主要由分子量在3000Da以下的混合豬 血清蛋白多肽組成，具有較高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在體外和體內均 有良好的抗氧化作用以及護肝作用，可以作為抗氧化保健產品。
動物試驗結果表明，本發明所制備的豬血清蛋白多肽能夠顯著降低CCl4誘導肝 損傷大鼠血清中的谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)水平(P < O.Ql),從生理角 度考慮對大鼠的肝臟具有很好的保護作用，對健康是有益的；而且豬血清蛋白多肽 可提高大鼠肝臟組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、 過氧化氫酶(CAT)活力(P < 0.01)，提高肝臟組織的總抗氧化能力(T-AOC) (P < 0.01)，并且降低肝臟組織中的丙二醛(MDA)含量(P < 0. 01);并且可以在一定程度 上保護肝組織結構，減輕CCl4對肝臟的損傷。說明本發明所制備的豬血清蛋白多肽 具有抗脂質氧化和清除自由基的能力，以及良好的護肝作用。
本發明豬血清蛋白多肽可以按照口服制劑的常規方法制備成膠嚢劑、顆粒劑、 片劑或散劑等各種口服制劑，優選為膠嚢劑。
本發明制備方法操作簡單，與合成抗氧化劑相比安全可靠，適合工業化生產，能夠大幅度提高豬血蛋白資源的利用率，提高豬血綜合利用的水平，以提高豬血資 源的附加值。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本 領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方 案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
實驗材料
枯草芽孢桿菌購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；菌種編號 CICC10063;購買后將菌粉在培養基中連續活化傳代3次。
實施例1
將濃度為6% (w/w)的豬血清蛋白經過0. 45 jum的微孔率膜過濾殺菌后接種4% (w/w)的枯草芽孢桿菌(菌種編號為CICC10063,中國工業微生物菌種保藏管理中 心)菌懸液，3(TC搖床發酵72小時得到發酵液；將發酵液經離心，取上清液，濃 縮，冷凍干燥，即得。
經檢測，本實施例所制備得到豬血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000Da之 間的混合豬血清蛋白多肽組成。
實施例2
將濃度為2% (w/w)的豬血清蛋白經過0. 45 iam的微孔率膜過濾殺菌后接種1% (w/w)的枯草芽孢桿菌(菌種編號為CICC10063,中國工業樣史生物菌種保藏管理中 心)菌懸液，37。C搖床發酵24小時得到發酵液；將發酵液經離心，取上清液，濃 縮，冷凍干燥，即得。
經檢測，本實施例所制備得到豬血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000Da之 間的混合豬血清蛋白多肽組成。
實施例3
將濃度為4% (w/w)的豬血清蛋白經過0. 45 ym的微孔率膜過濾殺菌后接種5(w/w)的枯草芽孢桿菌(菌種編號為CICC10063,中國工業4敖生物菌種保藏管理中 心)菌懸液，3(TC搖床發酵72小時得到發酵液；將發酵液經離心，取上清液，濃 縮，冷凍干燥，即得。
經檢測，本實施例所制備得到豬血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000Da之 間的混合豬血清蛋白多肽組成。
實施例4
將濃度為4% (w/w)的豬血清蛋白經過0. 45 jam的微孔率膜過濾殺菌后接種4% (w/w)的枯草芽孢桿菌(菌種編號為CICC10063,中國工業微生物菌種保藏管理中 心)菌懸液，30。C搖床發酵72小時得到發酵液；將發酵液離心，取上清液，濃縮； 將濃縮液依次通過分子量為3000Da, 6000Da和10000Da的平壽反膜后，即得。
經檢測，本實施例所制備得到豬血清蛋白多肽主要由分子量在3000Da以下的 混合豬血清蛋白多肽組成。
試驗例1 本發明豬血清蛋白多肽的體外抗氧化活性試驗
1、 供試樣品實施例1-3所制備的豬血清蛋白多肽；
2、 試—驗方法及結果
體外抗氧化活性在卵磷脂脂質氧化體系(簡稱Lipsome氧化體系)中進行， Lipsome氧化體系配制方法為稱取0. 895g氯化鉀，0. 078g組氨酸，加水稀釋到 100mL,調其pH值到6. 8,再取純度20%的大豆卵磷脂lg溶于氯化鉀-組氨酸緩沖 溶液中，制成2mg/mL的脂質體。進行抗氧化試驗時，取稀釋10倍的脂質體5mL， 加入樣品1 mL,以及加入0. 1 mL 50mM FeCl3溶液和0. 1 mL lOmM抗壞血酸鹽溶液， 37。C水浴lh，血清蛋白發酵液與未發酵的血清蛋白相比，其TBARS (流代巴比妥酸 值)下降35.14%,過氧化值(POV值)下降37. 26%;還原能力(FRAP值)提高2. 51倍， 對DPPH自由基(l, 1- 二苯代苦味酰基自由基)的清除率達到53. 85%,對羥基自由基 的清除率達到36. 67%;對銅離子螯合率達到46. 80%，對亞鐵離子螯合率達到12. 35%。
試驗例2 本發明豬血清蛋白多肽的抗氧化活性動物試驗 1 、供試樣品實施例4所制備的豬血清蛋白多肽； 2、試—驗方法及結果 (1)、試驗動物清潔級(SPF級)Wistar大鼠，雄性，購自維通利華試驗動物公司(北京)，年 齡為3個月，體重為240-290g,試驗地點在東北農業大學生命科學學院研究中心實 驗動物房內。將大鼠同室分籠飼養，自然光照，自由采食和飲水。環境溫度控制在 (23 ±2) 。C,濕度60%。
(2)、 CCl4誘導肝損傷大鼠模型的建立
將大鼠適應性祠養l周后建立模型，期間有淘汰，最終每組10只。隨機分為6 組(I)正常對照組；(II) CCl4模型陰性對照組；(III) CC14模型+供試樣品低劑 量組；(IV) CC14模型+供試樣品中劑量組；(V) CC14模型+供試樣品高劑量組； (VI) CC14才莫型+VE陽性對照組。其中I 、 II兩組每日分別灌胃1 mL 0. 3% CMC-Na, III、 IV、 V和VI各組每日分別灌胃低中高劑量供試樣品以及VE，劑量分別為50、 100、 200mg . kg-、乂及VE 50mg . kg-1。所有處理組均連續灌胃12天；在第13天時， 除了第I組以外，其他各組均皮下注射CCl, (0. 5 ml/kg)。 (3 )大鼠的處死以及血清和肝臟組織勻漿的制備
在注射CCl4后的24h之后，將大鼠處死。摘除眼球取血后，斷頸處死，立即剖 去肝臟。取出的肝臟去除脂肪和筋膜后，與冷的生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱 重，記錄。肝臟貯存于液氮中，待勻漿用。
大鼠血樣于4'C冰箱放置12h,以3000r/min, 4°C,離心10min,取上清，即 為血清。液氮中取出大鼠肝臟組織，4'C解凍后，取O. 5g,置于5ml小燒杯中，量 取4. 5ml的生理鹽水，將1/9的生理鹽水倒入燒杯中，以眼科剪迅速剪碎組織塊， 再將剪碎的組織連同生理鹽水一起倒入玻璃勻漿器中，然后用剩余的生理鹽水沖洗 燒杯和眼科剪，并倒入勻漿器，水浴勻漿，使組織勻漿化，勻漿完全后將勻漿液以 4000rpm離心10min,上清液即為10%組織漿液。 (4 )血清中ALT和AST水平的測定
大鼠血清中ALT和AST水平的測定分別采用ALT和AST試劑盒，采用全自動生 化分析儀進行測定。
(5 )肝臟組織中抗氧化酶系和丙二醛含量以及總抗氧化能力的測定 主要包括超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px),過氧化物酶 (CAT)和丙二醛(MDA)含量以及總抗氧化能力(T-AOC)的測定。 (a)超氧化物岐化酶(SOD)活力
SOD酶活測定采用氯化硝基氮藍四唑光還原法(NBT法)(Beauchamp和 Fridovich, 1971),按照試劑盒操作說明進行測定。(b) 過氧化氫酶(CAT)活力
按照Carrillo等人(1991)的方法測定。樣品于37。C水浴2min, 240nm處測定 5min內OD的變化，其變化和&02的變化成比例。
(c) 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)
GSH-Px用DTNB顯色法測定(Paglia和Valentine, 1967; Hafemen, 1974)。 37。C水浴10min,加入HA使之濃度為lmM。 340nm處測定OD值。NADPH氧化的速度 表示GSH-Px活性。
(d) 丙二醛(MDA)含量的測定
用硫代巴比妥酸(TBARS)方法測定(Placer et al. ， 1966 )，于試管中加入10% 的小鼠肝組織勻漿液0. 20ml及不同濃度的樣品0. 10ml,對照等加等體積生理鹽水。 37。C溫育1小時后取出，冰浴冷卻，按MDA測定試劑盒中方法操作，由于MDA與硫 代巴比妥酸縮合形成的紅色產物在532nm處有最大吸收，因此在該波長下測定吸光 度，計算其MDA含量，公式如下。其中勻漿液蛋白含量測定以牛血清白蛋白為標準， 采用Lowry法。另取兩組試管， 一組先加入1 Ommol/L的H202ml ，另 一組先加入lmmol/L 的FeS040. lml,然后再按前述方法，向這兩組試管加入組織勻漿和樣品液，溫育， 冷卻，測定MDA含量。
(e) 肝臟組織總抗氧化能力(T-AOC)的測定
T-AOC的測定按照Benzie和Strain(1996)的測定方法。測定原理是肌體中的 抗氧化物質，能使Fe"還原成Fe2、后者可和菲琳類物質形成穩固的結合物，通過 閉塞測定其抗氧化能力的高低，具體操作和結果計算按照試劑盒操作說明進行。
動物試驗結果表明，供試樣品(豬血清蛋白多肽)能夠顯著降低CCl4誘導肝損傷 大鼠血清中的谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)水平(P < 0.01),從生理角度考 慮對大鼠的肝臟具有很好的保護作用，對健康是有益的；而且供試樣品(豬血清蛋 白多肽)可提高大鼠肝臟組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活力(P < 0. 01),提高肝臟組織的總抗氧化能力(T-AOC) (P < 0.01),并且降低肝臟組織中的丙二醛(MDA)含量(P < 0.01);可以在一定程 度上保護肝組織結構，減輕CCl4對肝臟的損傷。說明本發明所制備的豬血清蛋白多 肽具有抗脂質氧化、清除自由基的能力和良好的護肝功效。
權利要求
1、一種豬血清蛋白抗氧化肽的制備方法，包括以下步驟(1)將豬血清蛋白進行微濾處理；(2)微濾處理后的豬血清蛋白接種枯草芽孢桿菌菌懸液，發酵；(3)發酵液經離心，取上清液，濃縮，冷凍干燥，即得。
2、 按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于按重量百分比計，步驟(l) 中所述的豬血清蛋白的濃度為2-6%,優選為4%。
3、 按照權利要求l所述的制備方法，其特征在于步驟(l)中所述的微濾處 理是將豬血清蛋白經過0. 45 mm的微孔濾膜過濾殺菌。
4、 按照權利要求l所述的制備方法，其特征在于按重量百分比計，步驟(2) 中接種的枯草芽孢桿菌的接種量為1-5%，優選為4%。
5、 按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的發酵在 以下條件下進行發酵溫度為30 - 37°C,發酵時間為24-84小時。
6、 按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的發酵在 以下條件下進行發酵溫度為3(TC,發酵時間為72小時。
7、 按照權利要求l所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中將濃縮后的發 酵液依次通過分子量為3000 Da, 6000 Da和10000 Da的平;f反膜，收集過濾液，冷 凍干燥，即得。
8、 按照權利要求1-6任何一項所述制備方法得到的豬血清蛋白抗氧化肽，其 特征在于所述豬血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000 Da之間的混合豬血清 蛋白多肽組成。
9、 按照權利要求7所述制備方法得到的豬血清蛋白抗氧化肽，其特征在于 所述豬血清蛋白多肽主要由分子量在3000 Da以下的混合豬血清蛋白多肽組成。
10、 按照權利要求8所述的豬血清蛋白抗氧化肽，其特征在于按照口服制劑 的常規方法制備成膠嚢劑、顆粒劑、片劑或散劑。
全文摘要
本發明公開了一種微生物發酵法制備豬血清蛋白抗氧化肽的方法及其產品。其制備方法包括以下步驟(1)將豬血清蛋白進行微濾處理；(2)微濾處理后的豬血清蛋白接種枯草芽孢桿菌菌懸液，發酵；(3)發酵液經離心，取上清液，濃縮，冷凍干燥，即得。本發明制備方法所得到的豬血清蛋白多肽具有較高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在體外和體內均有良好的抗氧化作用。本發明制備方法操作簡單，與合成抗氧化劑的方法相比安全可靠，適合工業化生產，能夠大幅度提高豬血蛋白資源的利用率，提高豬血綜合利用的水平，有效提高豬血資源的附加值。
文檔編號C12P21/06GK101608205SQ20091014824
公開日2009年12月23日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者刁新平, 騫 劉, 孔保華 申請人:東北農業大學