專利名稱：：鐵還原叢毛單胞菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及新菌種篩選
技術領域：
，具體的說，涉及一種鐵還原叢毛單胞菌及其應用。
背景技術：
：Fe(m)和腐殖質是土壤中大量存在的兩種組分。Fe(m)主要以難溶性氧化鐵形式存在，在地殼中平均含量約為5.6%，是厭氧土壤中自然豐度最高的電子受體。腐殖質是富含醌基的、非均相的天然有機混合物，是土壤有機質的主體，約占有機碳總量的6080%，在土壤肥力、農業可持續發展、環境保護等方面都具有重要作用。腐殖質還原又稱為腐殖質呼吸，是指微生物通過呼吸作用，將電子轉移至土壤中的腐殖質，將氧化態的腐殖質還原成還原態腐殖質，菌體在代謝過程中獲得能量的過程；近年的研究表明，腐殖質可在厭氧環境中充當有機物礦化的電子受體，加速有機污染物的降解。Fe(m)還原又稱Fe(m)呼吸，是指微生物通過呼吸作用將電子轉移至細胞外的鐵氧化物表面，將Fe(III)還原成Fe(n)，并從這一過程中獲得能量的過程。腐殖質和Fe(III)呼吸的直接后果是將氧化態腐殖質轉化為還原態，將Fe(III)轉化為Fe(II)，為有機物礦化與污染物還原修復提供基本驅動力。據估計，在某些淹水土壤與淡水沉積物中，Fe(m)/腐殖質呼吸直接導致了80%以上的有機碳礦化，其貢獻超過硝酸鹽呼吸、硫酸鹽呼吸、產甲垸作用等其它厭氧代謝方式的總和。腐殖質與Fe(III)還原條件下的污染物原位生物修復技術已成為國際熱點領域。腐殖質與Fe(m)還原是由特定微生物介導的酶促反應，具有腐殖質與Fe(III)還原活性的細菌是反應得以進行的關鍵。目前，已經發現腐殖質與Fe(III)還原細菌100多株，主要分布于地桿菌屬(Geok/"w希瓦氏菌屬(5T^而"e〃a5p.)、脫硫桿菌屬(Dew訴toZ)aC畫W.入脫硫弧菌屬(Dew//om/craZ^m5p.)等幾個屬。這些菌株尚存在以下缺陷1)大多數菌株只能在嚴格厭氧環境中生存，不利于大規模生產與實際應用；2)菌株的電子供體利用譜較窄，只能利用乙酸、乳酸等小分子量有機物作為電子供體，不能利用葡萄糖、蔗糖等分子量較大的有機物，對實際應用的環境要求相對較高。至今尚未發現具有腐殖質還原或Fe(m)還原活性的叢毛單胞菌。
發明內容本發明的目的在于提供具有腐殖質還原和鐵還原活性的鐵還原叢毛單胞菌。本發明的另一個目的在于提供上述鐵還原叢毛單胞菌在腐殖質還原或三價鐵還原中的應用。本發明分離篩選所得的鐵還原叢毛單胞菌(ComamoMw/emVe血ce"力CY01為革蘭氏陰性菌，長桿狀，于2007年3月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC1968。一、菌種的分離、純化取5g古森林土壤樣品于100mL液體培養基中，培養基組成為(g/L):AQDS(蒽醌-2,6-二磺酸)0.0412g，乙酸鈉1.36g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04'2H200.678g，KC1O.lg，維生素溶液lO.OmL(每升維生素溶液含生物素2.0mg，葉酸2.0mg，維生素B610.0mg，核黃素5.0mg，維生素B^Omg，煙酸5.0mg，泛酸5.0mg，維生素B!20.1mg，硫辛酸5.0mg)，微量元素溶液10.0mL(每升微量元素溶液中含氨三乙酸1.5g，MgS04.7H203.0g,MnS04.H200.5g，NaCll.Og，FeS04.7H20O.lg,CoCl2'6H20O.lg，CaCl2O.lg,ZnS04.7H20O.lg,CuS04.5H20O.Olg,A1KS04.12H20O.Olg，H3B03O.Olg，Na2M0O40.01g，NiCl2.6H200.024g)，pH5.05.5。接種前向培養液中鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)SI小時，鋁蓋密封，培養液置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)，30。C靜置培養，檢測還原態腐殖質模型物AQDS(蒽醌-2,6-二磺酸)產率的同時觀察培養液的顏色變化情況。當還原態AQDS的產量不斷增加時，培養液從無色變為黃色，顏色逐漸加深。當培養液顏色穩定不再變化時，以10%的接種量富集培養三次，然后稀釋，均勻涂布于固體培養基上(每升培養液加16克瓊脂，其它成分同上述液體培養基)，置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)3(TC培養48小時，挑取單菌落進行分離、純化。二、本發明菌株具有如下形態和生理、生化特性(1)菌體形態特性采用常規細菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，長桿狀，大小為1.21.5x0.30.4pm，具有運動性。(2)菌落形態特性在牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養基平板上好氧培養24小時后，菌落形態為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，淡粉色，菌落大小(力為l2mm;在上述培養基上好氧培養48小時后，菌落形態為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，黃色，菌落大小(力為34mm。(3)主要的生理、生化特性在好氧條件下氧化酶反應為陽性，不產氣，檸檬酸鹽利用試驗為陽性。具有兼性厭氧生長的能力；在好氧條件下，用BIOLOG鑒定后發現，在96種不同碳源中，該菌能利用其中的38種。在厭氧條件下能氧化的電子供體有丙三醇、葡萄糖、蔗糖；利用上述電子供體，該菌能還原檸檬酸鐵、氫氧化鐵、水鐵礦、針鐵礦等三價鐵，也能還原腐殖質與腐殖質模型物AQDS(蒽醌-2,6-二磺酸)。(4)分子生物學特性采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24:1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提取細菌總DNA。采用細菌16SrDNA通用引物F8和R1542擴增細菌的16SrDNA，在1500bp附近出現明顯的條帶，將PCR擴增產物回收后進行序列測定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blastn程序對數據庫中的所有序列進行比對。結合上述的生理生化特性、16SrDNA序列的結果，該菌株應歸屬于叢毛單胞菌屬，命名為鐵還原叢毛單胞菌(Com(3mw2aybrzV"^fwcera)CY01。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果發明人經過大量的實驗研究，篩選出了鐵還原叢毛單胞菌，其具有腐殖質還原和鐵還原活性。此菌能還原檸檬酸鐵、氫氧化鐵、水鐵礦、針鐵礦等三價鐵；也能還原腐殖質與腐殖質模型物AQDS(蒽醌-2,6-二磺酸)。鐵還原叢毛單胞菌兼性厭氧，電子供體利用譜較廣，此菌能在厭氧條件下能氧化的電子供體有丙三醇、葡萄糖、蔗糖。圖1為Owawo"oy/err/re^ceraCY01的掃描電鏡圖片。具體實施例方式實施例l:菌種的分離、純化取5g古森林土壤樣品于100mL液體培養基中，培養基組成為(g/L):AQDS(蒽醌-2,6-二磺酸)0.0412g，乙酸鈉1.36g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PCV2H200.678g，KC1O.lg，維生素溶液10.0mL(每升維生素溶液含生物素2.0mg，葉酸2.0mg，維生素B610.0mg，核黃素5.0mg，維生素B^0mg，煙酸5.0mg，泛酸5.0mg，維生素B^0.1mg，硫辛酸5.0mg)，微量元素溶液10.0mL(每升微量元素溶液中含氨三乙酸1.5g，MgSO4.7H2O3.0g，MnSO4.H2O0.5g，NaCll.Og，FeS04.7H20O.lg，CoCl2.6H20O.lg,CaCl2O.lg,ZnS04.7H20O.lg,CuS04.5H20O.Olg,A1KS04.12H20O.Olg，H3B03O.Olg，Na2M0O40.01g，NiCl2-6H200.024g)，pH5.05.5。接種前往培養液中鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)21小時，鋁蓋密封，培養液置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)，30。C靜置培養，檢測還原態腐殖質模型物AQDS(蒽醌-2,6-二磺酸)產率的同時觀察培養液的顏色變化情況。當還原態AQDS的產量不斷增加時，培養液從無色變為黃色，顏色逐漸加深。當培養液顏色穩定不再變化時，以10%的接種量富集培養三次，然后稀釋，均勻涂布于固體培養基上(每升培養液加16克瓊脂，其它成分同上述液體培養基)，置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)30。C培養48小時，挑取單菌落進行分離、純化。實施例2:菌種的鑒定(1)生理生化性質的測定表1.CY01菌株的生理生化特性檢測項目結果檢測項目結果革蘭氏染色陰性D-果糖一細胞形狀長桿狀L-海藻糖一細胞大小1.2~1.5>o0.3~0.4,D-半乳糖一產色素-D-甘露醇—運動性+D-甘露糖—菌落形態圓形丙酮酸甲酯+菌落大小12mm琥珀酸單甲酯+產氣-乙酸+菌落顏色(24h)淡粉順式烏頭酸+菌落顏色(48h)黃色檸檬酸+氧化酶反應+a-羥丁酸+厭氧情況兼性厭氧D-半乳糖酸內脂一還原水鐵礦(厭氧條件)+D-半乳糖醛酸-還原檸檬酸鐵.(厭氧條件)+D-葡萄糖酸+還原氫氧化鐵(厭氧條件)+丙二酸—還原針鐵礦(厭氧條件)+D-葡萄糖醛酸一蔗糖甘油/丙三醇-麥芽糖—木糖醇一注+表示可以利用；-表示不能利用(2)分子生物學鑒定采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24:1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提取細菌總DNA。采用細菌16SrDNA通用引物F8和R1542擴增細菌的16SrDNA，在1500bp附近出現明顯的條帶，將PCR擴增產物回收后進行序列測定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blastn程序對數據庫中的所有序列進行比較分析。結合上述的生理生化特性、16SrDNA序列的結果，該菌株應歸屬于叢毛單胞菌屬，命名為鐵還原叢毛單胞菌(Cowamowos/ernVet^cew)CYOl。實施例3:還原活性的鑒定電子供體為葡萄糖，電子受體為水鐵礦培養基配方每升去離子水中含水鐵礦10g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04.2H200.678g，KC10.1g，葡萄糖0.9008g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實施例l)，pH5.05.5;于121。C滅菌20分鐘，滅菌時葡萄糖和其它成分分開，滅菌后將葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)三1小時，接種C./emVe血ceraCYO1細菌懸浮液，使其菌數達到108/mL，于3(TC靜置厭氧培養，同時設置不加菌的對照。觀察培養液的顏色變化情況，每隔5天取4mL培養液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數)中180轉/分振蕩1.5小時。鄰菲羅林法測定Fe(II)的含量，計算Fe(III)還原率。Fe(III)還原率二Fe(II)濃度/Fe(m)起始濃度x100%。表2以葡萄糖為電子供體，水鐵礦為電子受體，驗證了C./m7>WwcmyCY01菌株的鐵還原能力。表2.不同培養時間下的Fe(m)還原率(％)o天5天10天15天20天對照0.040.540.871.522.03CY0菌株0.040.892.233.424.74實施例4:還原活性的鑒定電子供體為葡萄糖，電子受體為針鐵礦培養基配方每升去離子水中含針鐵礦9g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04.2H200.678g，KC10.1g，葡萄糖0.9008g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實施例l)，pH5.05.5;于121。C滅菌20分鐘，滅菌時葡萄糖和其它成分分開，滅菌后將葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)小時，接種C./冊W匿raCY01細菌懸浮液，使其菌數達到108/mL，于3CTC靜置厭氧培養，同時設置不加菌的對照。觀察培養液的顏色變化情況，每隔10天取4mL培養液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數)中180轉/分振蕩1.5小時。鄰菲羅林法測定Fe(II)的含量，計算Fe(ni)還原率。Fe(III)還原率二Fe(n)濃度/Fe(m)起始濃度xl00。/。。表3以葡萄糖為電子供體，針鐵礦為電子受體，驗證了C./^rz'M^ceraCY01菌株的鐵還原能力。表3.不同培養時間下的Fe(III)還原率(％)o天10天20天30天40天對照0.081.142.162.542.84CY0菌株0.091.743.365.426.74實施例5:還原活性的鑒定電子供體為蔗糖，電子受體為水鐵礦培養基配方每升去離子水中含水鐵礦10g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04.2H200.678g，KC1O.lg，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(配方同實施例1)，pH5.05.5;于121°C滅菌20分鐘，滅菌時蔗糖和其它成分分開，滅菌后將蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)21小時，接種C./e/77>^/wceraCY01細菌懸浮液，使其菌數達到108/mL，于3(TC靜置厭氧培養，同時設置不加菌的對照。觀察培養液的顏色變化情況，每隔5天取4mL培養液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數)中180轉/分振蕩1.5小時。鄰菲羅林法測定Fe(II)的含量，計算Fe(ni)還原率。Fe(III)還原率-Fe(II)濃度/Fe(III)起始濃度x100。/。。表4以蔗糖為電子供體，水鐵礦為電子受體，驗證了C./emVe血cmsCY01菌株的鐵還原能力。表4.不同培養時間下的Fe(III)還原率(％)o天5天10天15天20天對照0.031.171.222.163.24CYO菌株0.041.471.6113.4216.7411實施例6:還原活性的鑒定電子供體為蔗糖，電子受體為針鐵礦培養基配方每升去離子水中含針鐵礦9g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04-2H200.678g，KC1O.lg，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實施例l)，pH5.05.5;于12rC滅菌20分鐘，滅菌時蔗糖和其它成分分開，滅菌后將蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)21小日寸，接種C./wr/rc血ceraCYO1細菌懸浮液，使其菌數達到108/mL，于3(TC靜置厭氧培養，同時設置不加菌的對照。觀察培養液的顏色變化情況，每隔5天取4mL培養液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數)中180轉/分振蕩1.5小時。鄰菲羅林法測定Fe(II)的含量，計算Fe(III)還原率。Fe(III)還原率-Fe(II)濃度/Fe(III)起始濃度x100%。表5以葡萄糖為電子供體，水鐵礦為電子受體，驗證了C./em>WMcmsCY01菌株的鐵還原能力。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例7還原活性的鑒定電子供體為葡萄糖，電子受體為腐殖質模型物AQDS培養基配方每升去離子水中含AQDS0.0412g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g,NaH2P04.2H200.678g，KC1O.lg，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實施例l)，pH5.05.5;于12rC條件下滅菌20分鐘，滅菌時葡萄糖和其它成分分開，滅菌后將葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)21小時，接種C.ybr/wJw"wCY01細菌懸浮液，使其菌數達到108/mL，于3(TC靜置厭氧培養，同時設置不加菌的對照。觀察培養液的顏色變化情況，每隔1天取培養液用0.22pm細菌濾器把菌體等沉淀濾掉，用紫外分光光度計測定還原型AQDS的含量，計算AQDS的還原率。AQDS還原率=還原態AQDS濃度/AQDS起始濃度x100。/。。表6以葡萄糖為電子供體，AQDS為電子受體，驗證了C./e/77Ve血ceraCY01菌株的腐殖質還原能力。表6.不同培養時間下的AQDS還原率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例8:還原活性的鑒定電子供體為蔗糖，電子受體為腐殖質(購自美國Aldrich公司)培養基配方每升去離子水中含腐殖質0.5g，NaHC032.5g，NH4Cl0.25g，NaH2P04.2H200.678g，KC1O.lg，蔗糖3.423g，維生素溶液和微量元素溶液各lO.OmL(維生素溶液和微量元素溶液配方同實施例l)，pH5.05.5;于12rC滅菌20分鐘，滅菌時蔗糖和其它成分分開，滅菌后將蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)21小時，接種C.,m'^^ceraCY01細菌懸浮液，使其菌數達到108/mL，于3(TC靜置厭氧培養，同時設置不加菌的對照。每隔1天取培養液用0.22pm細菌濾器把菌體等沉淀濾掉，測定還原態腐殖質含量，計算腐殖質的還原率。腐殖質還原率=還原態腐殖質濃度/腐殖質起始濃度x100%。表7以蔗糖為電子供體，腐殖質為電子受體，驗證了C./emVec^ceraCY01菌株的腐殖質還原能力。表7.不同培養時間下的腐殖質還原率(％)o天l天2天3天4天對照0.100.100.130.120.14CYO菌株0.1740.20921.763.286.91權利要求1.一種鐵還原叢毛單胞菌，其特征在于其為革蘭氏陰性菌，長桿狀，于2007年3月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC1968。全文摘要本發明公開了一種鐵還原叢毛單胞菌及其應用。發明人經過大量的實驗研究，篩選出了鐵還原叢毛單胞菌，其具有腐殖質還原和鐵還原活性。此菌能還原檸檬酸鐵、氫氧化鐵、水鐵礦、針鐵礦等三價鐵；也能還原腐殖質與腐殖質模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)。鐵還原叢毛單胞菌兼性厭氧，電子供體利用譜較廣，此菌能在厭氧條件下能氧化的電子供體有丙三醇、葡萄糖、蔗糖。文檔編號C12N1/20GK101586092SQ20091014669公開日2009年11月25日申請日期2007年6月1日優先權日2007年6月1日發明者周順桂,李芳柏,武春媛,王弋博申請人:廣東省生態環境與土壤研究所