專利名稱：：應用醋酸桿菌催化還原生產(r)-4-取代基苯乙醇的方法
技術領域：
：本發明屬于生物催化手性化合物不對稱合成的
技術領域：
，特別涉及醋酸桿菌的應用催化芳香酮不對稱還原制備(及)-4-取代基苯乙醇。
背景技術：
：手性芳香醇是合成藥物、農業化學品和天然產物的重要中間體，酮的不對稱還原是制備對映體純手性醇最重要和實用的方法之一。對映體純l-(4-甲氧基)-苯基乙醇是一種重要的手性中間體,(及)-1-(4-甲氧基)-苯基乙醇可用來合成3-芳基-3-取代的丙酸類抗炎藥物,而(5)-1-(4-甲氧基)-苯基乙醇則是合成抗過敏藥的重要合成子。由于手性藥物的不同立體異構體在藥效、藥代及毒理等方面都可能存在差異，不同對映體必須區別對待。因此，研究對映體純l-(4-甲氧基)-苯基乙醇的兩種對映體的不對稱合成具有重要意義。用于制備對映體純手性芳香醇的不對稱還原反應的催化劑主要有純化的氧化還原酶和各種生物細胞。氧化還原酶催化的生物轉化過程具有高度的立體專一性，通常可使反應獲得很高的立體選擇性,但是反應時需要以化學計量的數量添加昂貴的還原型輔酶如NAD(P)H來提供電子，這樣使其生產成本過高，而且用離體酶作催化劑存在需要對酶進行分離、純化，酶在非生理環境中可能變性、失活，輔酶再生困難等問題。如果以微生物細胞作為生物催化劑，就能很好地解決以上問題。微生物細胞不僅能利用自身的代謝過程實現輔酶的原位再生，省去輔酶的添加，同時所有的酶和輔酶被保護在天然的細胞環境中，有利于生物催化反應的進行，而且若將微生物細胞進行固定化，不僅有利于產物的分離，還可回收細胞重復使用，大大簡化生產工序，降低了生產成本。因此，微生物細胞已成為不對稱還原潛手性酮制備對映體純手性醇的首選生物催化劑。目前，國內外有關利用生物催化劑不對稱還原對甲氧基苯乙酮來合成對映體純的(i)-1-(4-甲氧基)-苯基乙醇不對稱還原反應，底物濃度為2~3mmol/L，盡管都能獲得較高的產物對映體選擇性(e.e.〉9911/。)，但產率均較低(<40%)。其主要原因可能是催化劑的活性不高，且受底物、產物抑制等問題。但是產率很低，其主要原因可能是水相中存在將產物醇氧化為酮的逆反應以及嚴重的產物和底物抑制，而且游離微生物細胞容易受底物的毒害，導致細胞活性下降。采用新分離得到的醋酸桿菌能遵循反Prelog規則，高效、高立體選擇性催化4-取代基苯乙酮，生成(/)-4-取代基苯乙醇。
發明內容本發明的目的是為了解決現有技術存在的不足，提供利用篩選的醋酸桿菌細胞催化芳香酮(4-取代基苯乙酮)不對稱還原制備(及)-4-取代基苯乙醇的方法，絕對立體選擇性，其產率大于50%。本發明利用微生物細胞被固定化之后，由于受到固定化載體的保護與支撐作用，不僅有利于抵抗外界不良因素的影響，大大增加細胞的穩定性，還有利于細胞的循環利用，篩選能高效催化該不對稱還原反應的微生物菌種，在水相中采用固定化醋酸桿菌細胞催化對甲氧基苯乙酮的不對稱還原反應。本發明實現上述目的技術方案是醋酸桿菌菌株XZY00304ceto6fl"ersp.XZY003)首次從"中華開菲爾粒"分離出來(中華開菲爾粒即為西藏"雪蓮"發酵乳粒，源自西藏雪原特有珍稀菌種，是西藏土生土長的有生命的菌類)，已于2009年3月26日保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCCM，保藏號為M209061,保藏地址為中國湖北省武漢市武漢大學(郵編為430072)。醋酸桿菌^ceto6acto"sp.)XZY003在西紅柿液體培養基中3(TC培養24h觀察，細胞為短小桿狀，革蘭氏染色陰性，不運動。在西紅柿固體培養基中30'C培養48h后，菌落為乳白色，光滑，邊緣整齊。固體西紅柿培養基西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，pH6.0。醋酸桿菌C4ceto6"cto"sp.)XZY003可用普通的細菌培養基培養，如酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH5.0，無水酒精至20mL/L，需氧，培養溫度為30°C;可采用斜面、液體石蠟、凍干管法保藏。保藏用的培養基為西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，pH6.0。醋酸桿菌04cetok/""sp,)XZY003特性說明如下1、分子生物學鑒定提取50堆醋酸桿菌(乂c"otocto"sp.)XZY003的DNA(提取方法見[美]J薩姆布魯克《分子克隆實驗指南》27頁)，根據Kurtzman&Robnett的方法，用引物FD1(SEQ.ID.N02)(5'-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3')和FD2(SEQ.ID.N03)(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')PCR擴增醋酸桿菌(Xceto6""ersp.)XZY003的16SrRNA按下述反應條件進行35個循環94°C，5min;56°C，20s;68°C，40s。所得PCR產物送至上海英俊生物技術有限公司進行測序。醋酸桿菌04cetoZw"wsp.)XZY003的DNA序列為SEQ.ID.N01所示。選取酸球狀屬、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、尺ozafe'fl屬、乂《^屬、葡糖醋桿菌屬、酸單胞屬中與XZY003Blast結果顯示同源性較高的菌株和部分代表種，以i^wfo內/ag/o6z/wvw's為外類群，對選取的35個菌種作進化樹。從圖1的聚類結果可以看出，所選取的這幾個屬的菌株主要分為5類。醋桿菌屬的爿ceto6acto"g/w"aera!';y(EF030713)在與XZY003(FJ869877)比對的1396bp中，匹配率100%,rDNA差異堿基數為0;在進化樹中，Xceto6a"ergAawaera/s與XZY003顯示出較高的同源性(99.95%)，而與最近的^c"o6ac眇y^vg//(AB052712)、爿ce化6flcto"/ovam'erakLMG1617(AJ419837)比對的1396bp中，其同源性分別為99.7%和99.6%。根據Kurtzman&Robnett的理論"屬于同一種的菌株，其16SrRNA區堿基差異不超過1%，并預測若此差異超過1%則可以認為是屬于不同種，而如果只有0-3個堿基替代，就可以認為是屬于同一種或是相似種(Kurtzman&Robnett，1998)"，可以認為XZY003屬于Jc^o6(2cto"g/ww"ert5iy，或是其亞禾中。2、生理生化鑒定(1)產醋酸定性實驗將新鮮菌種接種于醋酸桿菌增殖培養基中，3(TC搖床培養2天后，取培養液5mL于試管內，氫氧化鈉溶液中和至pH7.0，加100g/L氯化鐵溶液23滴混勻，觀察液體顏色是否變為黃紅色，在火焰上煮沸，觀察有無紅褐色沉淀生成，清液是否變無色。增殖培養基酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH4.5，12rC滅菌20min后加入30mL/L無水酒精。(2)乙醇氧化實驗用新鮮菌種接種乙醇氧化培養基，培養23天后觀察，若培養基產酸變黃者為陽性反應。乙醇氧化培養基配方為酵母浸膏10g/L，20mL/L濃度為0.4g/L溴酚藍水溶液，pH6.8~7.0，121'C滅菌20min后加入40mL/L無水酒精。(3)乙酸氧化實驗用新鮮菌種接種乙酸氧化培養基平板，培養23天后，觀察菌落四周是否出現乳白色暈圈，有乳白色暈圈則為陽性反應。乙酸氧化培養基酵母浸膏10g/L,乙酸鈣10g/L，瓊脂20g/L%，pH7.0~7.2，12rC滅菌20min。(4)生酮實驗用新鮮菌種接種生酮實驗平板，培養23天之后，用菲林溶液注滿平板，菌落周圍出現明顯的紅色沉淀則為陽性。生酮實驗培養基酵母浸膏10g/L，甘油30mL/L,瓊脂20g/L，121。C滅菌20min后加入無水酒精至40mL/L。(5)乳酸利用實驗用新鮮菌種接種乳酸氧化培養基平板，培養23天后，觀察菌落四周是否出現乳白色暈圈，有乳白色暈圈則為陽性反應。乳酸氧化培養基酵母浸膏10g/L，乳酸鈣10g/L，瓊脂20g/L，pH7.(K7.2，12rC滅菌20min。(6)過氧化氫酶測定取一環生長于PYG瓊脂斜面的培養物，涂于干凈的載玻片上，然后在其上滴加5滴100mL/L的H202，若有氣泡產生則為陽性反應。PY基礎培養基:蛋白胨5g/L,胰酶解酪朊5g/L，酵母浸膏10g/L，鹽溶液40mL/L。PY鹽溶液成分無水氯化鈣0.2g/L，七水硫酸鎂0.48g/L，磷酸氫二鉀1.0g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，碳酸氫鈉10.0g/L，氯化鈉2.0g/L。PY鹽溶液制法將氯化鈣和七水硫酸鎂混合溶解于300mL蒸餾水中，再加500mL水，一邊攪拌一邊緩慢加入其他鹽類。繼續攪拌至全部溶解后加200mL蒸餾水，混合后貯備于4'C備用。PY基礎培養液內加入10g/L葡萄糖即為PYG培養基。(7)石蕊牛奶實驗用新鮮菌種接種石蕊牛奶培養基，于37'C培養1，3,7天后觀察石蕊牛奶產酸和凝固反應。石蕊牛奶培養基在100mL濃度為100g/L脫脂牛奶中加入4mL濃度為25g/L的石蕊，分裝試管，牛奶高度4-5cm。(8)明膠液化實驗用新鮮菌種接種明膠液化實驗培養基，置于37'C培養，用兩只未接種的試管培養基做對照。培養23天后，將已接種和對照管分別置于冰箱中，若對照管凝固，接種管液化記錄為陽性，同時液化或凝固則為陰性結果。明膠基礎培養基蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖lg/L，鹽溶液40mL/L(與PY基礎培養基同)，明膠120g/L，pH7.0，12rC滅菌20min。(9)產硫化氫實驗乙酸鉛試劑條的制備將普通濾紙條剪成約0.50.611寬的紙條，長度根據試管和培養基高度而定。用濃度為50100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，然后置于烘箱烘干，放入培養皿或試管內，滅菌后備用。將新鮮菌種接種產硫化氫實驗培養基試管后,用無菌鑷子夾取一乙酸鉛紙條懸掛于接種管內。下端接近培養基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。一支不接種的試管設為空白對照，也要懸掛乙酸鉛紙條，置于37'C培養，紙條變黑則為陽性反應。產硫化氫實驗培養基(半胱氨酸培養基)胰蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，半胱氨酸0.4g/L，葡萄糖2g/L，分裝試管，每管培養液高度4-5cm，pH7.2-7.4，12rC滅菌20min。(10)產吲哚實驗將新鮮菌種接種產吲哚實驗培養基，置于37'C培養。培養2-3天后，取培養液加入試管，沿管壁加入3-5mm高的試劑于培養液表面，若液層界面出現紅色則為陽性反應。試劑對二甲基氨基苯甲醛0.08g，無水乙醇7.6mL，濃HC11.6mL6產吲哚實驗培養基10g/L胰胨水溶液，調pH7.27.5，分裝試管，12rC滅菌20min。菌種的生理生化特性如表1所示，能產醋酸和硫化氫，接觸酶陽性，生酮實驗陽性，能氧化乙醇，不能進行明膠液化和利用乳酸，乙酸氧化和牛奶石蕊實驗陰性，不產吲哚。根據形態特征和生理生化特征，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》可鑒定菌種為醋桿菌屬，結合分子生物學鑒定結果，確定醋酸桿菌04cetoZwctersp.)XZY003為v4ceto6ac敏gte"aew5&，但是已知的Jc"o6acto"g/Km"e肌^不能利用葡萄糖生酮，因此，確定本發明XZY003菌種為爿ceto6a"erg/jfl("aera/i1的亞禾中或變禾中。表1醋酸桿菌XZY003生理生化鑒定實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"+":表示陽性，表示陰性。醋酸桿菌^ceto6acto"g/za"aem')XZY003能催化芳香酮(4-取代基苯乙酮)不對稱還原為(i)-4-取代基苯乙醇，其對映體過量值(e.e.)為99%以上，產率為55~95%。應用醋酸桿菌催化還原生產(及)-4-取代基苯乙醇的方法在三乙醇胺的鹽酸緩沖液中，加入底物4-取代基苯乙酮、異丙醇和濕菌體的醋酸桿菌04c加6ac敏sp.)XZY003的固定化細胞顆粒，形成混合物，調節pH值至4.0~7.0，在溫度為25~35'C，轉速為160-260r/min條件下，振蕩反應212h,進行微生物細胞催化的轉化，制得(及)-4-取代基苯乙醇；所述的三乙醇胺、鹽酸、4-取代基苯乙酮和異丙醇在混合物中的濃度分別為0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3-20mmol/L和43.6-200mmol/L;所述濕菌體的醋酸桿菌04"to6a"ersp.)XZY003的固定化細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.1-1.0g/mL;所述醋酸桿菌(Jceto6a故/"sp.)XZY003保藏號為CCTCCM209061。所述pH值優選為4.0~5.0;所述固定化醋酸桿菌細胞在混合物中濃度優選為0.3g/mL。所述異丙醇在混合物中濃度優選為130.6mmol/L261.2mmol/L。所述4-取代基苯乙酮在混合物中濃度優選為6mmol/L~10mmol/L。所述溫度優選為25°C~30°C。所述4-取代基苯乙酮優選為4-溴苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-氟苯乙酮、4-硝基苯乙酮或4-甲基苯乙酮。相對于現有技術本發明具有如下有點和有益效果現有技術中用微生物細胞不對稱還原芳香酮(4-取代基苯乙酮)能獲得較高的產物值，但是產率很低，其主要原因可能是水相中存在將產物芳香醇氧化為芳香酮的逆反應以及嚴重的產物和底物抑制，而且游離微生物細胞容易受底物的毒害，導致細胞活性下降。本發明利用醋酸桿菌催化合成(及)-4-取代基苯乙醇，與游離酶作為生物催化劑相比，省去了添加昂貴的還原型輔酶如NAD(P)H，降低了其生產成本；與其他細胞作為催化劑相比，其具有絕對的立體選擇性和較高的產率，同時不僅有利于產物的分離，還可回收細胞重復使用，大大簡化生產工序，降低了生產成本。圖1是以為外類群，XZY003對選取的35個菌種作的進化樹。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步描述，本發明的實施例不限如此。實施例分析儀器島津2010型氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器，安捷倫HP-Chiral手性柱(20%permethylatedy&-cyclodextrin30mx0.25mmx0.25pm)。GC分析條件汽化室溫度和檢測室溫度均為250'C;實施例1將2g中華開菲爾粒接入裝有100mL西紅柿培養基的250mL三角瓶中，28。C培養24h，以同樣的條件在西紅柿培養基連續轉接培養3次。菌液采用十倍稀釋法進行適當稀釋涂布于固體分離培養基上，28。C培養2436h，獲得單菌落，純化后斜面保藏，供鑒定用。西紅柿培養基西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH6.0。將鑒定為醋酸桿菌的菌株XZY003從斜面轉接入西紅柿培養基中，30。C，160r/min培養24h，離心(3500r/min，15min,4°C)，洗滌兩次，得到濕菌體。然后將濕菌體分散在等重的蒸餾水中，再加入4倍濕菌體重量濃度為20g/L海藻酸鈉，攪拌均勻，用5"針頭的注射器將上述懸浮液滴入200mL濃度為20g/L的CaCl2溶液中，4'C硬化4h，用蒸餾水將硬化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2-3mm)洗滌3次，再移入200mL含有CaCl2的葡萄糖溶液中，其終濃度為0.5g/LCaCl2、200g/L葡萄糖，放置于4'C冰箱中保存待用，得到的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒，其直徑大小為2-3mm，球形，機械強度較好，其醋酸桿菌細胞含量為107—8個/g，活性穩定。西紅柿培養基配方西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/L，pH6.0實施例2將鑒定為醋酸桿菌的菌株XZY003從斜面轉接入西紅柿培養基中，30°C,160r/min培養24h，離心(8000r/min，10min，4°C),洗滌兩次，得到濕菌體。然后將濕菌體分散在等重的蒸餾水中，再加入6倍濕菌體重量濃度為10g/L海藻酸鈉，攪拌均勻，用5#針頭的注射器將上述懸浮液滴入200mL濃度為20g/L的CaCl2溶液中，4"C硬化4h，用蒸餾水將硬化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2-3mm)洗滌3次，再移入200mL含有CaCl2的葡萄糖溶液中，其終濃度為0.5g/LCaCl2、200g/L葡萄糖，放置于4'C冰箱中保存待用，按實施例2得到的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒，其直徑大小為2-3mm，球形，機械強度一般，其細胞含量107'8個/g,活性穩定。西紅柿培養基西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH6.0。實施例3將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L，pH7.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例2制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒以及異丙醇和4-溴苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-溴苯乙酮在混合物中濃度分別為130.6mmol/L和6mmol/L，于30'C，180r/min，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為1.0g/mL，反應2h，得到(if)-4-溴苯乙醇，氣相檢測其產率為85.4%，(及)-4-溴苯乙醇對映體純度為99%以上^.。氣相檢測方法:色譜柱初始溫度為145'C，維持10min后，以1。C/min的速率升至150'C，維持6min。4-溴苯乙酮，(i)-4-溴苯乙醇和(S)-4-溴苯乙醇的保留時間分別為。.40,18.86和19.56min。實施例4將6mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.2mol/L，pH6.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例2制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞以及異丙醇和4-氟苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-氟苯乙酮在混合物中濃度分別為195.6mmol/L和12mmol/L，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.5g/mL，于30°C，200r/min，反應8h，得到(i)-4-氟苯乙醇，氣相檢測其產率為64.9%,(iM-氟苯乙醇對映體純度為99。/Q以上e.e.。氣相檢測方法色譜柱初始溫度為110'C，維持5min后，以1。C/min的速率升至120'C，維持3min。4-氟苯乙酮，(及)-4-氟苯乙醇和(S)-4-氯苯乙醇的保留時間分別為8.83，14.58和15.35min。實施例5將2mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.05mol/L，pH4.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例1制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒以及異丙醇和4-氯苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-氯苯乙酮在混合物中濃度分別為130.6mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.1g/mL，于25°C，180r/min，反應10h，得到(i)-4-氯苯乙醇，氣相檢測其產率為79.6%，(及)-4-氯苯乙醇對映體純度為99%以上e.e.。氣相檢測方法:色譜柱初始溫度為140。C,維持10min后，以1。C/min的速率升至145°C，維持4min。4-氯苯乙酮，(及)4-氯苯乙醇和(S)-4-氯苯乙醇的保留時間分別為9.12，14.32和14.90min。9實施例6將6mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L，pH7.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例2制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒以及異丙醇和4-硝基苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-硝基苯乙酮在混合物中濃度分別為43.6mmol/L和3mmol/L，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.40g/mL于35'C，160r/min,反應2h，得到(i)-4-硝基苯乙醇，氣相檢測其產率為69.6%，(及)-4-硝基苯乙醇對映體純度為99。/。以上e.e.。氣相檢測方法色譜柱初始溫度為175'C，維持23min。4-硝基苯乙酮，(i)-4-硝基苯乙醇和(S)-4-硝基苯乙醇的保留時間分別為10.74,20.89和21.70min。實施例7將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.05mol/L，pH4.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例1制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒以及異丙醇和4-甲氧基苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-甲氧基苯乙酮在混合物中濃度分別為261.2mmol/L和10mmol/L，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.30g/mL，于25'C，160r/min，反應8h，得到(/)-4-甲氧基苯乙醇，氣相檢測其產率為79.3%,(及)-4-甲氧基苯乙醇對映體純度為99W以上e.e.。氣相檢測方法:色譜柱初始溫度為140°C，維持10min后，以1°C/min的速率升至145°C，維持4min;載氣為氮氣，流速為3.0mL/min，分流比1:100;進樣量1#L。在該分析條件下，4-甲氧基苯乙酮、內標正壬烷、CR)-4-甲氧基苯乙醇和(S)-4-甲氧基苯乙醇的保留時間分別為2.00，16.00，16.90和17.20min。最大相對誤差小于1.0%。實施例8將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L,pH7.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例l制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒以及異丙醇和4-甲基苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-甲基苯乙酮在混合物中濃度分別為130.6mmol/L和20mmol/L，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.30g/mL，于30'C,180r/min，反應12h，得到(及)-4-甲基苯乙醇，氣相檢測其產率為55.4%，(i)-4-甲基苯乙醇對映體純度為99。/。以上e,e.。氣相檢測方法:色譜柱初始溫度為125°C，維持10min后，以1°C/min的速率升至130°C，維持5min。4-甲基苯乙酮，(及)-4-甲基苯乙醇和(5)-4-甲基苯乙醇的保留時間分別為10.49,17.15和18.11min。實施例9將6mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L,pH6.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實施例1制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒以及異丙醇和4-甲氧基苯乙酮形成混合物，異丙醇和4-甲氧基苯乙酮在混合物中濃度分別為130.6mmol/L和8mmol/L，固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.30g/mL，于30°C，180r/min，反應8h，得到(/)-4-甲氧基苯乙醇，氣相檢測(氣相檢測條件同實施例7)其產率為70.3%，(及)-4-甲氧基苯乙醇對映體純度為99%以上e.e.。序列列表SEQ.ID.N01:SEQUENCELISTING<110>華南理工大學<120>應用醋酸桿菌催化還原生產(R)-4-取代基苯乙醇的方法<130><160>3<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>1396<212>DNA<213>醋酸桿菌(Acetobactersp.)<400>1caagtcgcacgaacctttcggggttagtggcggacgggtgagtaacgcgtaggaatctgt60ccatgggtgggggataactctgggaaactggagctaataccgcatgatacctgagggtca120aaggcgcaagtcgcctgtggaggagcctgcgttcgattagctagttg魄gggtaaaggc180ctaccaaggcgatgatcgatagctggtttgagaggatgatcagccacactgggactgaga240cacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccct300gatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttcgacgggg360acgatgatgacggtacccgtagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggta420atacgaagggggctagcgttgctcggaatgactgggcgtaaagggcgtgtaggcggtttg480tacagtcagatgtgaaatccccgggcttaacctgggagctgcatttgatacgtgcagact540agagtgtgagagagggttgtggaattcccagtgtagaggtgaaattcgtagatattggga600agaacaccggtggcgaaggcggcaacctggctcattactgacgctgaggcgcgaaagcgt660ggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtgtgctagatg720ttgggtaactttgttattcagtgtcgcagttaacgcgttaagcacaccgcctggggagta780cggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgt840ggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagggcttgaatgtagaggctgtattca900gagatggatatttcccgcaagggacctctaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc960gtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatctttagttgccag1020cacgtttgggtg銘cactctagagagactgccggtgacaagccggaggaaggtggggatg1080acgtcaagtcctcatggcccttatgtcctgggctacacacgtgctacaatggcggtgaca1140gtgggaagctagatggtgacatcgtgctgatctctaaaagccgtctcagttcggattgca1200ctctgcaactcgagtgcatgaaggtggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcgg1260tgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtttgacct1320taagccggtgagcgaacccgcaaggggcgcagccgaccacggtcgggtcagcgactgggg1380tgaagtcgtaacaagg1396SEQ.ID.N02:<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>2ccgaattegtcgacaacagagtttgatcctggctcac37SEQ.ID.N03:<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3agagtttgatcctggctcag201權利要求1、應用醋酸桿菌催化還原生產(R)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于在三乙醇胺的鹽酸緩沖液中，加入底物4-取代基苯乙酮、異丙醇和濕菌體的醋酸桿菌(Acetobactersp.)XZY003的固定化細胞顆粒，形成混合物，調節pH值至4.0～7.0，在溫度為25～35℃，轉速為160～260r/min條件下，振蕩反應2～12h，進行微生物細胞催化的轉化，制得(R)-4-取代基苯乙醇；所述的三乙醇胺、鹽酸、4-取代基苯乙酮和異丙醇在混合物中的濃度分別為0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3-20mmol/L和43.6-200mmol/L；所述濕菌體的醋酸桿菌(Acetobactersp.)XZY003的固定化細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.1-1.0g/mL；所述醋酸桿菌(Acetobactersp.)XZY003保藏號為CCTCCM209061。2、根據權利要求1所述應用醋酸桿菌催化還原生產(及)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于所述pH值為4.0~5.0;所述固定化醋酸桿菌細胞在混合物中濃度為0.3g/mL。3、根據權利要求1所述應用醋酸桿菌催化還原生產(及)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于所述異丙醇在混合物中濃度為130.6mmol/L~261.2mmol/L。4、根據權利要求1所述應用醋酸桿菌催化還原生產(/)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于所述4-取代基苯乙酮在混合物中濃度為6mmol/L~10mmol/L。5、根據權利要求1所述應用醋酸桿菌催化還原生產(及)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于所述溫度為25°C~30°C。6、根據權利要求1-5任一項所述應用醋酸桿菌催化還原生產(及)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于所述4-取代基苯乙酮為4-溴苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-氟苯乙酮、4-硝基苯乙酮或4-甲基苯乙酮。全文摘要本發明公開應用醋酸桿菌催化還原生產(R)-4-取代基苯乙醇的方法，在三乙醇胺的鹽酸緩沖液中，加入底物4-取代基苯乙酮、異丙醇和濕菌體的醋酸桿菌的固定化細胞顆粒，形成混合物，調節pH值至4.0～7.0，在溫度為25～35℃，轉速為160～260r/min條件下，振蕩反應2～12h，制得(R)-4-取代基苯乙醇；濕菌體的固定化醋酸桿菌細胞顆粒與混合物的重量體積比為0.1-1.0g/mL；所述醋酸桿菌(Acetobactersp.)XZY003保藏號為CCTCCM209061。本發明得到對映體純(R)-4-取代基苯乙醇產物的對映體純度為99％以上e.e.，其產物的對映體純和收率均得到提高。文檔編號C12P7/22GK101586128SQ20091014626公開日2009年11月25日申請日期2009年6月19日優先權日2009年6月19日發明者婁文勇,宗敏華,肖仔君申請人:華南理工大學