孢子綱物種體外培養的方法及其用途的制作方法

專利名稱：孢子綱物種體外培養的方法及其用途的制作方法
孢子綱辦中體外培養的方&S其用途
5本申請是申請號為03811387.2,發明名稱為"孢子自種體外i歸的方法 及其用途"的發明專利申請的分案申請。 發明領域
本發明涉及孢子綱(Sporozoea)及期中屬的成孢預原生動^3^對歸的培 養體系和方法。本發明還涉朋本發明的i歸體系和方法制成的鵬子和卵毅 io相魏子綱生嫩段細胞，鵬苗、檢定和其4柳ii^用。
背景技術：
孢子綱原生^)^括鵬讀原生鵬其中許多是導致全世界人和^ 病的病源。其中有^t^的商業皿的是由孢子綱的球M纟岡(Coccidia) 、 蟲目(Eucoccidiida)和艾美球蟲亞目(Eimeriina)引起的疾病，以及由成孢， 15原生動物的^m^M (Cystoisospora)、艾美球蟲屬物種(Eimeria) 、 ■， 蟲屬(Isospora)、新孢子蟲屬(Neospora)、肉孢子^M (Sarcocystis)、弓勉 屬(Toxoplasma)、辦屬(Tyzzeria)禾口溫矛繊蟲屬(Wenyonella)引起的麵。 特別是，球，是由球AM、艾美球^M辦中原生動吻寄生蟲引起包括家 畜如家禽在內的動物所患的一種 。這些專性細胞內原生動物寄生蟲主要 20在腸上皮復制。此類寄生蟲具有輔主的生活周期并展現出髙度的宿主性禾離織
特異性。總的說來，由于球鵬和預防藥物費用的総損失，受其影響的:tt每
年蒙CT大的經濟損失。
家 ^傳染的經濟影響在養雞業中體現得尤為嚴峻，因為養雞業密集的 禽舍會加快疾病的傳播。球頓綱感染使得禽類例如家禽及其他別醉的鳥類生長 25纖和表皮色條而i^l圣游員失。另外，多數艾魏球蟲可以經由口腔途徑和/ 或從環境吸入傳染的微粒感染單宿主。一旦吸入，寄生蟲穿透并損害腸^^M1 而弓胞急隨病，例如，導致魏染的禽類生長緩慢和1^斗利用性陶氐。
艾美球蟲屬物種、^fe，^、 ^m^屬或隱孢子蟲屬(Cryptosporidium) 原生動物僅需要單宿主即可^它們的生劍盾環。在自^j牛下，從環境攝TO 30成孢子的卵囊開始生命周期。攝取成孢子的卵囊的細M被胃IHM破壞柳鵬酶消化而破碎。生物體感染期的孢子,孢子囊內。孢子體侵AM^膜M他， 的薄壁細胞。該感染隨跡包舒中屬的特征。
在宿主^的細胞內，孢子體發育成也被稱作,體的多核分，。各分裂 i^亥成^A被稱作裂殖子的感染體，也就Ji^A新的細胞并重復該娥呈。在無 5數的無性世代以后，,子發育成為小配子母細 ^配子。小配^細 育 成能依次使大配子受精的許多小配子。最終的^^1^^ ^的細 卜膜包在 囊內，然后被稱作卵默成孢子f繊雜排,中。頓當的環境下，卵歡育 成孢子并可以傳染。皿易感的動M專，后重復該循環。
球頓洲專染弓胞一禾術異性免疫。例如，有W中已知的球頓艦以感染
io嫩鳥，其中7^中被認為能^^普通狀態到急',病。
因此，在別薛的鳥類中，引入另夕卜的球頓綱或以前未出現的鳥類可以導致 i^的爆發。卵囊育撮大P艘防御PH、去垢劑、解朊、,、月旨肪儘酶、機 械破壞(盡管它們可以被實驗室的方法破壞)禾,如次氯,和重鉻,的化學 制品，并可在宿主外鵬活多個星期。例如，有W中已知的球頓艦以感鄉 15雞，其中7^中被認為能^^普通狀態到急1^病。
多種方法t^刺tt禽對球^M綱免疫。所有^J力的商業方法均是基于對被 包在囊內通常帶減毒株的活原生蟲給藥。盡管已經習慣^ffi其^i徑，但最常規 的接種途徑還是口服。在美國專利US3， 147, 186中，Edgar指出可以MM口服 給藥能存活的魏艾美球蟲(E. tenella)成孢子卵囊雌4^種疫苗。在美國專利 20 US4， 544， 548中，Davis等教導一種不管繊蟲藥物蹄 ^麵 ^ 給藥少，孢子的卵囊接種疫苗的方法。
在嫩鳥體內可以M3ii^賣傳f^;減毒.美國專利US5， 055, 292已經描述 了卵,期形成的球^3E^株系的選辦贓毒，i^^&lt引入作為參考。
口月齢藥孢子囊減Wl^鵬用于預防球鵬的效免疫性。 [ShMey的美國 25 專利US4,438， 097; McDonald的美國專利US5，055刀2和Schmatz等的PCT.WO 94/16725]。在Jenkins等AvianDis., 37 (1) : 74 82(1993)中公開了減毒的另一種
方法，它教導WS射M的孢子體口月隙藥以防止卵片發育。
接種疫苗的非腸道途徑包括皮下或腹腔注射脫囊的孢子體(見Bhogal US4，808,404; Bhogal等US5， 068， 104)和體內注射卵囊或孢子囊(見Evans等， 30 PCTWO96/40223; Watkins等，Poul Sci.， 4(10): 1597402 (1995)) 。 Thaxton，us 5,3ii，84i教導一種艦卵黃^il^e卵^^孢子條藥到剛孵出^D:鳥艦
球^M^種疫苗的方法。
需要對能存活的原生動物接種疫苗是當前所有接種疫苗方法中的一個共同 要素。因為需要預防臨床傳染，使不能存活的原生動物艦生^TO^具有高度
5免疫性的方法未能取得^I力。
艦以前，B^先絲被感染的活鳥處獲取能存活的活原生繊如卵囊。
然而，禾,活的動物或一辦頓綱種屬的雞卵*^#用于疫苗^的能存活的 球鵬R細胞的方法既昂貴又低效。
人們已經長時間尋求一種培養疫苗生產及其他目的所需大量球蟲亞綱的高
io效經濟的^f戈方法。B^^i^^M^體外歸，fiitMW限。B^有馬-達氏 牛腎(細胞)(MDBK)支持艾魏球蟲體外生長附隨，但是iMl^P艮在無隨 育的復制周期[D.M.Schmatz， Adv， Cell Culture, 5:241 (1987)]。當得自原始宿 主的I^I子用作接禾糊的時候，可以獲得來自E. acervulina [M. Nacri-Bontemps， Aim.rech. Vet, 7 : 223(1976)] 、 EmeleagrMtis[Augustin等，J.Protozool.， 25:
15 82, (1978)]禾卩E.bovisSpeer等，Z. Parasitenk-d， (1973)]的艾美球蟲屬頓中卵囊。 然而，如上所述，應用得自感染鵬組織的鵬子的必要剝牛限制了這些方式的 有效性。
美國專利US5， 846 ， 527指出鳥^皿 于支持，艾美球蟲和毒害艾 美球蟲(E.necatrix)生長的變態胚'幽織，但是復帝股被維持72小時。另一W章 20礙是如果用于制造活菌苗，得自維鳥的無限增殖l:^胞會產生出轉移腫瘤至l胸鳥 的風險。
鵬子的剤艮傳代已被獲知。例如，在美國專利US6， 500, 438中， <頓 D. J. Doran， J. Parasit57 :891-900， (1971)中蹈ij的一禾中M的方法，孢子體被 感染進入出生一天的雛雞腎細胞(PCK)，該細胞在作為細皿合體的:t，吻中 25生長。然而，Sm種方法產生的鵬h旦被釋放，i縛即被終止。5贓的意 見是，艾美屬球蟲會顯現出同步的生長發育，因此不獸娥導產^I子的無P艮增 殖系。即，在相對短的時鵬，在卵囊的釋^MI呈中，鵬子的無限增殖系不會 終止。
所以， 一種能獲得充足的球，綱細胞供疫苗^及其他的研究使用的高效 30經濟的方法還有著各種長期的需求。自子在無限增殖比哺乳自細胞上的體外生長的方法將令人期待。然而，如上所述，,適當宿主細胞的體內培養體系早 己用至賕蟲亞綱無性階段的無限繁殖中，即，鵬TO根據需要就能引起感染階 段的轉化。
此處對任何文獻的引用不應被理解為將這些參考文獻視為本申請可獲得的 5 "現有獄"。 發明
本發明皿提供一種用于在無性發育階段連續培養專性細胞內孢子綱原生 動物的方法來解決i^提出的問題以及其他問題。本發明的方跑括以下步驟-
提供包含適合孢子綱物種生長的無限增殖比宿主細胞的細胞i，體系， 效感
10染宿主細胞的條件下，將感染階段的孢子自中和宿主細胞撤蟲，引起在宿主細
胞內的IM子生長，其中宿主細胞^lii吞噬作用摻入該原生動物。
此處提供的本發明方法和培養體系用于生產以前不能獲得量的孢子綱原生
微的卵囊、鵬子與/和其ft^^l^段。如雌的鵬細胞具有多種用途，包括
提供包含在動物用活疫苗中存活的孢子綱細胞，和易于獲得經濟量的孢子綱蛋白
15質禾tV離亥酸、用于倒賄用目的的細胞，如用于診斷、蛋白質鄉、生物肝學
種或生物體基因研究，等等。
該細胞培養體系包括適合維持宿主細胞和培養物中的孢子綱物種的生長培 養基。可以j柳適于戶;M擇的宿主細鵬的樹可:t歸基。
在一4^的實驗案中，生長i歸敏艦原劑，戶;f^ias原劑呈例如能有 20效將孢子納物種在無限培養中保持在其中生殖是無性的生命周期階段的濃度。可
以4頓適于本:t歸體系的樹可還原抓例如，以徵于約0.01M).05mM的P-巰 基乙醇的濃度。
，的宿主細胞是源自哺乳動物網狀內皮細胞的保持吞噬細胞活性的無限 增殖比細胞，例如源自雜細麟的無限增殖tl^ffl鵬。 25采用本發明方法和培養體系培養的優選的生物體是僅自然感染單一，宿
物:例如，這些原生^^括感染鳥類的球蟲禾IV鄉B艾i球蟲屬辦中，織辦 ^M， ^M屬，隱孢子^及其組合。更tt^的是艾美球^物種。
自然感染兩種宿主細胞的孢子綱例如新孢子蟲屬、弓，屬、哈蒙德蟲屬 30(Hammondia) 、 #[侖克鵬(Freankelia)、貝諾孢子蟲屬(Besnoitia)和肉孢子
9鵬(Sarcocystis)通常對長期i綠更為敏感，雖然它們可以在本發明的細胞i歸 體系中生長，但3^S子綱不;iMii3^方法生長的im^物體。
動物的抗原生動物疫苗。anf共了鳥ii^^m子綱鄉生糊的鳥類接種的
5方法。
也衝共了包含m^發明培養體系和方法生產的生物體的疫苗組合吻，其中 包括例如一種或多種藥學上可接受的佐齊訴松矢鵬中的防腐劑、熟齊嘮。本
發明的疫麗以任意地與t娥7K、 ^WI4或口月隙藥的顆粒狀物混合。
Itl^卜，本發明提供了使用ilit^發明的方法和細胞i，體系產生的生物體接 io種的鳥類。
本發明i3^f共了一種篩選破壞誦鵬子綱原生鵬生長的活性齊啲方法， 包括在與^與戶;ff帝選的活性齊ij^蟲的情況下,iiiihM方法i^該孢子纟f^/種, 并檢測相對于不^該活性劑的生頓生誠生存能力的螩怖用。
發明詳述
15如前戶M，本發明提供了包括宿主細胞的培養體系和體外基對^孢子綱類 成孢子囊原生動物的方法。a^f共了il3tt發明i歸體系產生的原生^細胞， 例如孢子綱自子種或卵^TO^it原物質。這樣的物質可以被用于需要預防孢 子綱感染的,B人類、鳥類和包括家禽在內的家畜的抗孢子,種疫苗的生產。 因此，本發明衝共了能無P艮維鵬子綱細胞無性階段或充分延長體外期限的 20細胞i綺體系和方法，從而能^itb類的細胞的^經濟有效。
本發明的培養體系和方法可產生可存活的和有毒的即感染性的成孢子囊原 生動物的培養物群。這些方法通常可用于孢子綱的招可成孢子囊原生動物，尤其 是球蟲亞綱更具體而言是真球蟲目、還有艾美球蟲亞目、以^^fto屬、艾美 球蟲屬、舗子球蟲屬、新孢子鵬、肉孢子鵬、弓MAM、 屬和^ 25蟲屬的成孢，原生，。
本文^共的方法可考慮用于所有孢子綱并特別用于如感染艾美球^物種、
弓漿蟲屬、泰澤屬、隱孢，蟲屬、^e^t蟲屬、哈蒙德蟲屬、弗倫克蟲屬、
貝諾孢子，的所有鳥類的球蟲目卵囊i^。體外 方法可以#^柳或補， 于、赫物的生長稱或測定具有所 際的寄生蟲的宿主辦中。 30在一彿別雌的實 案中，例如，本發明對預如艾美球蟲屬、鞭子和其它需要相似單宿主細胞的原生動物的體外 培養是有用的。由于這些原生^^^，的宿主細胞有#^的受體，并且特
異性地不會感染其它細胞，因而斷歸這些細鵬加了鵬。如前面所超啲，
這些原生^tt異眺需要一個單一宿戰^^它們的生命周期。
5 相艦，其它孢子鵬需^M個宿主來^^它們的生命周期。例如，新孢子
蟲，弓漿蟲屬，弗倫克蟲屬、貝諾孢子鵬、線德鵬和肉孢子鵬需要兩個
宿主來完成它們的生命周期，并且已經證明這些在無限增殖y^胞,中維^
點,困難，例如，見Dame等.，美國專利申請No. 2002/0115828Al，其中描述 了神經元肉孢子蟲屬的，，所公開的內# 引入作為參考。 10 在體外長時期的i辯原生繊需要一個非常麟的單一鄉的宿主，此前這 已被證明是一個棘手的問題，特另提艾美球鵬、魏 鵬、^Ftel或 隱孢子蟲屬和其它僅需要一個單一宿主的#^孢子綱類。本發明方法解決了這個 問題，^f共能使這些生物體延長i歸的方法和細膨歸體系。 定義
15為了 ;1 本發明的范圍和本質，給出下列定義的術語。
術語"宿主細胞"指在本發明的培養體系所〗^的樹 乳^ 的無限增 殖比細胞。這些是將M51吞噬作用，摻入原生,的"吞噬細胞"， 艮P，這類細胞 取需要在土綠體系中供養的原生,，以致原生^^^入一 個吞噬體。例如，本發明考慮采用適合在體外:t錄并將維持目的原生,的樹可
20吞噬細胞系。這離括，例如，源自靴細mS其后代的細鵬，如巨噬細胞， 以及淋巴結網糊胞、鵬口髓、組織溯胞，如中央牛牦5系統的小臓陶卿、肺 泡巨噬細胞、肝巨噬細胞等等。無限增殖比細胞可以《趟自牛、豬、狗、猴、貓、 人、馬、羊、i^IV繊的來源，只舉出鵬糊來源的一，仔。無限增殖比細 胞與所謂"原生"細胞系的區別在于，它W旌體外無限生長，然而，原生細胞系
25和在體內的彭見一樣，但在體外卻不肖灘無P,復制。
術語"i歸"標卵S^i子定蹈賄主細胞并且傳避噺宿主細胞。優 ■，盡管這，量可以變化，在一個典型的培養體系中原生細胞的id^大 于106個，鵬其他實 案中繊大于109物胞。除非另有說明，本文中的術 語"連續培養"，無限繁殖的細胞培養。i^地，對艾美球蟲屬的培養而言，
30在無性階段增殖和持續生長的種系培養18 ^g長時間就^3^i音養。更,
ii地，遊彭繊在無性階段辦賣生長^^戰150 ^t更長時間，而且容易 被冷鵬冷凍保存，在再引A51宜宿主細鵬隨即恢貌性生長。
除非另有說明，術語"別薛的鳥類"在本劉旨的魏,鳥，燦，鴨，可 捕獵的鳥(包括但不局限于奄鸚，W瞞)禾魄禽(包括但不局限于駝鳥)。
5 術語"M的"^/于原生動物寄生蟲的卵 ^段。
術語"孢，"指在卵囊中^S子的囊。纖子化卵囊的MAIiJ鞭中卵 囊的出現的時間就定義為潛伏期。不同的艾美球蟲槲中有所不同。
除非另有說明，本文的術語"艾辦鵬辦中"恭^~個棘多個感染別養 的鳥類的艾美球蟲屬物種。艾美球AM槲袍括那些在嫩鳥中找到的，并且包括
10例如，魏艾美球蟲，堆型艾美球蟲(E. acervulina)，巨型艾美球蟲(E. maxima)， 毒害艾辦蟲，緩艾美球蟲(E. mitis)，早熟艾美球蟲(E. praecox)禾蹄氏艾美 球蟲(E. bmnetti)、也包括那些在力鳥中找至啲，并且包括力鳥和緩艾美球蟲(E. meleagrimitis)、腺艾美球蟲(E. adenoeides) 、 ^0(吼雀艾美球蟲(E. gallopavonis)、 分散艾美球蟲(E. disperea)、力鳥艾美球蟲(E. meleagridis),無害艾美球蟲(E.
15 Innocua)、和近圓艾美球蟲(E. Subrotunda)也指感染如以上定效的其它家禽的 艾美球蟲屬物種。術語"艾美球蟲屬物種"也包括先前所有艾，蟲屬頓中的所 有株系，包括但不局限于早 系和減辦，其中包括^^射S^t^其它鵬 的株系，致使它們不能完戯育。術語"艾美球鵬頓中"還包括樹可新發現的
株系鄉n以上定組的麟家禽的艾美球鵬物種。
20 除非另有說明，本文中的術語"卵囊"和"l^l子"^能存活的、即活的 艾美球蟲屬卵囊和鵬子，例如從環境、動物和根據本發明的無限增殖比麟中 獲得的。
本文中的"免疫"和"接種"是同義并可以魏4頓。除非另有說明，本文 中的術語"有效免疫劑量"彰^"定驢的卵^^l子，^i^混合時， 一定數 25量的卵囊和鵬子，足以引發接種的鳥類的免i&SiS,例如，抗艾美球AM頓中 抗體效價的提高禾IV自胞介導免疫的活化。更確切地，引發的免^SiSilf^^
性免疫，這能卩艮制或 >接種后的鳥類臨床彌艦、1 ^失、魏斜n/艦
亡率，這種接種的雜受了毒性齊懂的^^w的艾美球鵬頓中。 孢子綱來源
30本發明的i歸體系i錄的孢子綱題己矢P^品即感染鄉中辦尋，例如，取自血液、糞便、組織棘自環境污,。如果在樣品例如土,品^iM樣品中
呈現出的種群主要處于孢預階段，禾中辦品貝啦照在本:^; 描述的方法簡單地
被培養。如果該種群主要處于卵囊階段，該種群可以艦已知的環境艦方法被 誘導孢子形成，麟1鯛熟知的實驗室方法誘導取自該種群的樣本進行孢子形成。
5如果該種群辦本主要處于孢子化卵囊階段，另卩么孢，可以M3U見有獄的已
知方法很容易地獲得，例如用玻i^iaii破壞。 卵囊的來源
可以從感染動物的,自織、污染的，或水、土壤、圍欄垃圾、床上用 品或其它各種來源獲得卵囊。孢子囊的分離方法是已知的。用來分離卵囊的關鍵 io步驟是,卩，得卵囊的物質并m本領域的^人員將是顯而易見的。
以下簡要iW^—種應始環境的樣品中分離生物體的有用方式，簡言之， 第一步是W卜來的物質中分離卵囊。通常iMfflt餅啦7jc溶液制麟、棘^fch il^1灘物，并M液中分離孢子囊。例如,將被,的材料與最少2體積(W/V) t頓QNaCl水溶液混^iM^液。如果有必要，可以在攪拌|0^ 混合器中^ 液
15直到得到均勻的稠度。在4'C將漿液以約800 xg離心10併中。用鵬24x24紗布 過濾收祉清液。通常4頓的由樣品純化卵囊的其幼、鵬括Sheather ^!^魏 法和硫勝辛浮皿，例如，見LRAsh和TCOrihel， Parasites: A Guide to Laboratory Procedures and Identification, ASCP Press 1991, ^jlt引作參考。
過濾后的上清、OT兩1^只的tOT7j^^并在4'C以約1600 xg離心10併中。
20用7J^清微立狀沉淀的卵囊并如J^M另夕卜離心三次4Et沉淀。然后在2.5%重鉻酸 鉀中以相同的7K洗滌步驟淸洗卵囊三次。最終清洗后，把卵囊保#^4匸的2.5% 重鉻,溶液內棘轉移到用于孢子形成的織中。
棘，l續過濾可以用來根據尺寸卵囊。如剰頓過濾，可以按照前述，用 力《口 2.5。/。的重鉻^mt冼卵囊。
25 孢子形成
用公知駄方法可能弓撥卵翻子形成。例如，把卵^^在2.5%的重鉻, 溶液的容器中并在開口爐棉^^包沫^S就可以^a孢子形成。在28-30°C， 容器以25(hpm在,振娜上搖動48-72小時。蹄，可以不|1 動含有卵囊 的溶液，同時以每小時大約25到75立方M的逸變向溶液中ilA空氣J，泡。
30在孢子形成MI呈中，樣品蹄規律的間隔被取出并S31離卵囊確定它們是蹄
13有孢殊檢驗孢子形成。
或者，如果從環境中獲得樣品，例如地面垃圾，可以^t立W^引起孢子自
然形成(所需要)的適當的水分和、,條件。
在孢子形成后，iS3ia;濾、離心郝領域的獄人員公知的其它可接受的收 5集方絲收集成孢子的卵囊。例如，可以在4'C以約1600xg離心10併中收驗 孢子的卵囊并棄去上清液。濃縮后，成孢子的卵g4'C懸浮在5.25Q/。的次氯勝內 中10併中可以被消毒。消毒后將鵬子的卵驗4'C以1600xg離心或以其它適 合的方^A次氯酸鈉中移出。然后用蒸餾7K淸^W&子的卵囊4到6次。清洗后， 成孢子的卵囊可以保^ 2.5%的重鉻,，含有30ng/ml慶大霉素的磷Kk緩沖 10淑K(PBS)鄉它鋭的消毒劑中。
成孢子的卵，過公知技術的方法例如機械分裂和/戯卜膜蛋白消化可以被 斷裂以獲得無外膜的孢子。下面是一種簡歡法。簡而言之，例如，將如前戶腿 的那對瑰的從環境物質(土^ )中分離出來的成孢子的卵驗PBS中稀 釋至濃度約2x 106/mL把lml等你辦的這種PBS加至恰有125m!的0.5鵬鵬 15珠的1.51111'鵬離心管中。然后高3II定糊管5併中。之后在冰上辨P。渦方跪， 取出上清液荊呆留。然后用PBS清洗I^，，留上清液，將其與渦方跪獲得 的上清液合并。然后將上清液在約900 xg離心大約2 3併中并棄去上清液。含 孢預的顆粒沉淀! ^雜0.21111的PBS中。再il^頓血球計鵬它確定細 胞數目的方法確定每ml的孢T^度。 20 在宿主細鵬離#^#孢子綱
為方便描述，歸體系被描述定義為分 #體系。獄人員鵬楚該蹄 體系和相關方法易適用于在it^物中生長細胞的其它公知的方法，包括分J, 和遊彭歸體系在內。例如，繊細胞體外生長的^fi公知獄方法的詳述見R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Fourth Edition, John Wiley & Sons, Inc.(C) 2000， 25鵬l入作參考。
對于本發明的培養體系，開始的種群可以是自然存在或保持在實驗室的種 群。如果該種群主要包含卵囊或孢子化卵囊，且在吞噬^^中^^放的吞噬 細 ^^作宿主細胞，就沒有必要依照本發明使寄生，囊。
為使孢子形^/,卩 子的生長，樣品中的孢^11^宿主細 ^#—段
30時期，它在*宿主細胞內擴增。這段時期可以變化不同的宿主細鵬ni^l子種類，f跳艾美球AM辦中通常是大約72小時。
維辦歸基是如本W萬定義的一種i歸基，它不能被代割旦可每三天加Aff 鮮的培養基。培養的IM子發育成熟并生產卵囊或孢，。培養時間典型的^^勺 4 約30天。例如，產4^l子的典型的i錄時間是約10天，而產生卵囊的典型 5的時間是18天。
特別是如果沒有儲i纖，并且讓其增加密度，另卩么卵囊或孢^ ^大約 18天被釋鵬lji歸基中。另外，適當^fi^tl即定期M^細胞密度，i^/就 不斷產出l^l子。
艦離心從維搟歸基中獲娜豫并鵬令凍，臓^M冷凍千燥保 10存。移去^H辦培養細鵬^^I子，通常限于感染的宿主細胞^^H^只的 約1/20。然后將該^^H^WAfP胰蛋白酶化宿主細胞的亞鋪滿層。在實驗室 的*艱莫^中，鵬子的最佳鄉頻率典型的是大約每10天，盡W^將多少隨具
體的宿主細胞系、孢子纟,中，禾n/鄉歸體系的嫩IM變。如^l子在兩個細 胞系間艦以便肯灘強毒性劍新的宿主株系的毒性，最佳轉移時fsm^但不限 is于4天。然后M31樹可飽的她禾^r測^l的原生糊(例如，糊薩鵬)
1^測宿主細胞的感染。相關地，根據樣品中原生 的禾號可以估算原始種
群中的原生動物的生存能力。潛肖&t^借助活的鳥類測定可以涉^f性存能力。 活的鳥類測定可以確認體外潛育&^^有效以制^s苗。
在雌的實驗案中，本發明鄉在艾美球蟲屬槲中的遊對歸中能支持生
20長和脫囊的培養體系。培養體系 ^子種群保持其無性分娜5^萬需要長的時 間，同時當需要的時候，t歸體系可以誘^ i子麟，即終ih^l子作為卵囊 用于疫苗或其它用途。本發明的，體系的宿主細胞是樹可適當并經濟i^i用于 本發明方法的無限增殖化哺乳鵬細鵬。
在另一^t^的實旨案中，宿主細皿自支持艾美球AM頓中,卩生長
25并且肖嫩在連續培養中繁育的無P艮增殖比吞噬細胞，例如，源于如哺乳繊網狀 內皮細胞的無限增殖比細胞。這離括例如，靴細艦其后f^卩巨噬細胞，以 及淋巴結的網狀細胞，脾和髓，組織溯胞，中'W申經系統的小鵬細胞，月市泡 巨噬細胞，肝巨噬細胞，磐。無限增殖比細胞可以{瑰自那些源自牛、豬、狗 (例如，ATCC CRL 10389)，猴、貓、人(例如，ATCC TIB202)、馬、羊、
30鼠(如ATCCTB61)禾P/皿的來源，只舉出這樣的，來源的一徵仔。至于如何實w^發明并不意(^^會舒iH^ra論或假說的限制，但是據信， 吞噬細胞是培養孢子綱生物體最現想的物質，其中部分是歸功于它《i'鏘寄生蟲細 胞p鵬A^胞內吞噬體的能力。
然而在另一"1^的實 案中，本發明也衝共了一種肖調于鑒定在i歸體
5系中所用的^t的宿主細胞的篩選體系。簡而言之，^i的宿主細胞可這樣鑒定:
使用如下文所舉例的本發明的培養體系，用^1宿主細胞謝切陛實例的牛 細胞系，在替代培養體系中確^l子的相對于用牛靴細鵬鵬啲^^和生 長，其它所有參數是相同淑目似的。誠的宿主細胞如吞噬細胞^ 用于孢子 綱生物體的可用于長期培養無性生殖狀態的這數物體的^^和生長，例如，至
10少與作為例示的用于艾美球蟲屬辦中和相關生物體的牛靴細胞一樣獻力。
鄉一步優選的實船案中，在適于戶腿宿主細胞長時間培養、同時也包括
還原齊啲i^S^基中^^主細胞，例如，具有在功肖讓等同于約0.01 約0.5mM 的P - 乙醇的還原活性的一定濃度的還原劑。適當的還原劑是指在長期，中 能延長孢子綱生物體壽命的樹可一種還原劑，例如，所鵬子綱生物體包括艾美 15球蟲屬物種。
在一^t^的ffii的實船案中，依照沐發明，從雌的還原劑中排除二硫 繊瞰"DTT")。
在更WI的實IW案中，本發明提供了一種用于鑒^S用于:t，體系的還原 齊廿的篩選體系。簡而言之，^i的還原齊呵這^定^ffi如下^0 ，鵬本發
20明的t歸體系，用fl魏的還原齊附替那些實例的e -鵬乙醇，在^ftt薪體系中， 確^l子的相對于用和不用戸- 乙醇戶鵬啲^^和生長，例如在類似的還 原活性條件下，相對于那些淑力使用P-,乙S豬。適宜的還原齊iTOIf共用于孢 子囊生物體的可用于長期培養無性^l狀態的這類生物體的壽命和生長，例如， 對于艾美球蟲屬物種和相關生物體至少與P -巰基乙醇是一樣^c力的。
25 例如，簡單地作為實例，鵬的還原劑驗原二硫鍵的物質，包括e-麟乙 醇、巰基乙胺、2,3-二巰基琥珀酸、青霉胺、P-內鵬、N-乙酰半胱氨酸、抗壞 血艦其等效物種鄉組合。
為了確定最佳的i^l妒能力和絲，獄人員也可以鵬常挪也1頓例 示的細胞培養體系，同時^^擇的還原齊鵬度，荊呆持其它參數瞎^Wbg 30宜還原劑的濃度。例如，對于該還原劑，可以iiii^測增加的濃銜K^^確定在此濃JS;K平時，益處不再隨濃度增加而提高的7K平，或fflfc濃彭K平時還原劑的
樹可副作用^t^l的^力和壽命的益處的7jC平。
e-巰基乙醇是最優選的還原劑， 細胞^#基中的濃度為約(xoi 約0.5
mM鞭高，更雌大約0.055 mM的濃度。 5 如何實施本發明不受iif^論或假說的約束，但是據信，在4頓的濃艦常
小于lmM且雌小于O.lmM的隋況下，還原齊i鵬M干擾宿主細鵬R/^^及 寄M性別分化的寄生蟲信號種^^放的信號割牛。
如何實施本發明不受ttfSJ理論或假說的約束，可以假設，在《趟的實驗案 中，還原齊卿制吞噬性宿主細胞消^^死已摻AI摘主細胞吞噬體中的原生動 10物，因此有助于提高在吞噬性宿主細胞系中原生動物寄生蟲的生存力。
在更雌的實 案中，宿主細胞培養體系細無限增殖比吞噬細胞系禾咆 括飽還原劑，例如，e-麟乙醇鄉功育^^物，如^Jd^的濃度范圍在內的 土 基，例如用于艾美球^t^生物體的連纟彭咅養。
在最優選的實施方案中，宿主細胞是Speer等，1985， Infection and 15 Immunity50 : 566^571中的牛，細,咐旨BM617)， ^fc引入作為參考(Dr. Speer， College of Veterinaiy Medicine, College Station, Texas)。源自ATCCCRL 6017和ATCCCRL6057的牛，細胞也作為例證。
本發明i歸體系^^纟歸基、密度、任意的生長自^面、,和環^* 決定戶，的宿主細胞。<mtfe,宿主細胞生長 轉或 的; 中的懸浮液中。 20或者，例如，因為宿主細胞需要固體麟，細胞生長^f^面、在浸于i歸基 中的it^片上、i^皿中、禾0/^1#&培養基中的^^磁性的微自的表面上， ^i于所選宿主細胞的樹可其它公知的細胞生長載體上。
例如，1頓本文例示和以上蹈啲牛報細胞時，細胞雌以小于80%鋪滿 的密度接種到約150cm2組織i^^瓶中以用于i^。皿吔，在標自胞:t^,ij 25如Gibco的RPMI i:歸基中，在37°C、 5%002氣氛下讓宿主細胞生長，0M， 基補充抗微生物齊收晴霉歉 素和抑真菌劑。按實驗勢，，當宿主細胞的培 養MS^嘬大密度，例如80%到100%,滿，燒瓶中培#^1被分離或"分裂" 以^1>細胞密度例如繊|」1/6鋪滿密度。當然，當調^^賺以在商處妒用于 娜的原生,材料鄉它目的時，獄人員失Pit^^呈是可以變化的。 30 ^t于戶腿宿主細胞系的、皿實施:t歸體系。在約25 約45。C的溫度，更imtte約37 約41。C實施歸。最雌在37。C。 以艾美球鵬槲中i錄的鳥^S苗和疫苗接種
雖然生物體題活的鵬鄉睞源中得到的，但艾辦AM辦中鄉是已知 的，例如，McDonald等，美國專利5,055^292給出詳細方案， 引入作為參考 5通51^#體系得到的自子可以用樹可公矢坊法，屯化。簡，例而言，
但沒有限制，卵囊可以釋鵬膽歸基、種^iai已矢防法，的培養細胞中從而
得至ij^l子。例如，如J.入Olson， 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:1435-1439 所描述，可以移去細胞碎片。簡而言之，Olson的方、^^括收集含W^放的,子 的麟基、并以450 xg旋轉離心10併中以、鵬鵬子。將包含鵬子和宿主細 10胞碎片的顆粒沉能懸 雜0.1MNaCM).05MKCl-20Q/o牛血清白蛋白中，并施加到 于pH 8.2上平衡在75mM TriS"40 mM NaH2POr86mM NaCI-100mM葡,中的 D&52陰離子交換柱上。裂殖子過柱。根據A Kilejian, J. Biol. Chem. 249: 46504655， (1974)所述的電子顯微鏡法檢查從柱子收集到的,子的纟,。
用作鳥^m的孢子體^i子或它們的混，，^Kl卵內給藥i任
15何適宜的生理介質中注射至im中。^tk，將它們懸 ^￡生理平衡的&7乂中， 例如磷酸緩沖鹽水中。所選的介質可以ffi^包括一或多禾te^HJ，包括M:的生 趣嫩、明膠、水溶膠、辦隹素或多糖膠。
在一lim的實驗案中，例如包括鵬子柳或孢子體的這種活的生物體，
i^卵內給藥^射至iJ嫩鳥中^13i下列形式接種給藥以樹可3te的本領域已
20知第臍,J形式的非鵬、皮下、劃痕秋艦內給藥，例如，相容的緩沖液柳或生理
學上可接受的淑K， 4趟與佐齊訴n/或免疫增強齊i鄉臓劑組合(例如疫苗接種以 前或以后^i合藥或系列給藥)。
適當的免，臓齊抱括但不P艮于細胞因子、生長因子、趨化因子、淋巴細胞 細胞培養物的上清液、對亥細胞、淋巴器官的細胞、細胞制品鄉MI取物(例
25如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)鄉旨多麟躋ij) 、 U^ffl胞分翻喊包 括低分子量藥品在內的佐劑。免^賺劑可以在^#的樹可期間卵內給藥。
地，免鄉微劑在含有艾美球鵬槲中孢子體^l子或它們階混糊的驗基 中被卵內給藥。
對于口月膨藥的疫苗浪苗接種方法，可方^M鯛本領域已知的生理學戰 30宜的緩沖液或懸浮劑。另外，可以加A^溯，例如，混合至i化煳7滅噴霧到食物顆社，鵬噴^a^^它鄉上，等等。
用于疫苗接種的目的，給藥的齊懂或接種鵬括照中或多種艾美球蟲屬辦中 的鵬子、卵囊種或它們的組合的、翻鵬喊糊胞。
對于疫苗接種，iM本發明方法培養的艾美球蟲屬頓中細胞的^劑量為約 5 10 約106個卵囊^|子或它們的混^|，其中卵薪口^子的總量為約10 約105個。給藥后的細胞^MM3S宜的宿主細胞傳代、輻射、重組突變柳鄉 它公知t^方法減毒。
更，的齊懂范圍是約W 約105個的卵囊^1子或它們的混，，其中 卵囊和 子的總量為約103 105個。
io 財Km的齊懂范圍是大約i(^ io5個的卵囊^i子或它們的混糊，其
中卵囊和裂殖子的總量為lW l()S個。
樹可鳥類包括需要疫苗接種的別l^的鳥類在內，可以考慮接^^種艦。優 逝也，接^^樣疫苗接種的鳥類可以是與商業相關或非商業,的鳥類，例如， 在球蟲感染的條件下大量養殖鳥類是可能的但并不數火迎。這些鳥類包括，例如
15鴨科(Anatidae)如^1、鵝和鴨，鴿類(Columbidae)例如斑鳩和鵒子如家鴣， 雉科(Phasianidae)如鷓鴣、松雞和力鳥，Thesienidae如魏，鸚鵡科(Psittacines) 如長尾鸚鵡，麥皋和鸚鵡，例如，為寵物或il^t市^1^的。也可以考慮用原生 動物細胞或其它產自本發明方法的衍生 種3^^和走禽。艾美球蟲屬物種生物 體鄉給藥雌的受體繊鳥。
20樹可公知的給藥途^^苗接種都易于4頓。因此，可,鳥卵卵內tt^也 給予某一劑量。也可以通過^^^例如剛出生攜帶疫苗生物體^l雞的羽毛任 麯舒某—齊懂，^131噴竊 管用漸口月趙合藥。 3!5iJe藥物直接涂在 口腔、加A5收OT水、禾tV鵬羽社噴灑藥物然后借助用嘴整理麟口腔傳送， 從而實現口部釋藥。也可以M31將生物體用在或浪合到被嫩mA的顆粒鵬或
25 !^中來任意口月齢藥。
纟，鳥卵或出生一天,鳥卵內給藥的^^齊懂包括選自，艾美球蟲，堆 型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、毒害艾美球蟲、緩艾美球蟲、早熟艾美球蟲禾怖氏 艾美球蟲的兩種或多種艾美球蟲屬辦巾的卵囊^t子或它們的混^i。
給火雞卵或出生一天的雛雞卵內給藥的^t劑量包括選自力鳥和緩艾美球
30蟲、腺艾美球蟲、力鳥孔雀艾美球蟲、分散艾魏蟲、力鳥艾美球蟲、無害艾美球蟲和近圓艾美球蟲的兩種或多種艾美球A1頓中的卵囊^^子或它們的混合
物。對包括艦齊懂的^tt/f中，齊慢W^fe包括10 106個卵囊^|子或它們
的混嫩
任iM,疫苗被i^藥，例如，Mil^發明的i歸體系產生的艾，蟲屬 5物種迸行疫苗接種的同時、之前稱t后，j頓某一劑量范圍樹可適宜的公知抗 球蟲病化學治療劑或化學預防制厠以有效削 苗接種的，，而不會損害擬中 過的動物的免疫保護性應答的形成。化學治自抱括但不限于樹^效的抗原生 動物劑，例如，抗原生動物化溯例如抗敝物劑、抗生素、包括ii^鵬抗體
例如單克隆抗，n/^片段^s組衍生物的組^/。
l o本發明的齢治療也包括,舒禾fV^^同時舒樹可公知的免鄉微齊訴口 疫苗接種，禾0/^^<封可其它時候協同給藥。
—種優選的免自ij激劑給藥方法是在最后四分之一培養期或出生一天的雛
雞的時候，同時用某一劑量卵囊^i子鄉腐的卵囊^l子的混^t;卵內給 藥。
15 本發明的另一方面liiil冷藏、冷凍或冷凍干燥保存卵囊^M子、鋤腿
卵囊^H子的混，。例如，當冷凍由本發明i歸方法和i錄體系產生的活的 生物體時，可任選使用公知的冷凍防腐劑。這魏括，舉例而言，例如滲iff呆持 齊ij，如甘油、二甲基亞砜(DMSO)、糖如葡繊，半學IM，棉子糖)、蛋白質 如血清、禾fV或白蛋白和其^fil清成分,尿素或MS,^tl例如S^白7K解，，
20 例如，N-Z"AMINE A (Quest International, Hoffinan Estates, DMnois的IPL:5X59027)。 抗原生糊劑的篩選
本發明培養體系也提供一種篩選和鑒別抗原生^齊鵬別是抗艾美球^ 物種劑的高效有用的方法。篩選的活性齊'泡括潛在預防或治療的藥物話性齊收感 物離條
25簡而言之，i^^種孢子綱中將離:t^/。為了檢測預防作用，
單層細胞在卵囊麟之驗i歸基里引入檢測活性抓為了檢測治療艦，首次 分裂在正常維^i咅養基上的，體系中生長。在兩種方法中，第二次分裂在補充 有受試活性劑(呈現在溶^^浸滲在i^S^微圓盤中)的正常維辦歸基的培 養體系中生長，以刑古它殺^m賜生動物無性生殖階段的能力。
30為了篩選可替代的治療劑，可ffi^頓藥敏性原生糊或具有已知抗藥性的生物體。
在一個可選擇的策略中，^#~種孢子鄉,中^離^^0首次分裂在正
常維持培養基上的培養體系中生長。第二次分裂在補充有該受l^性劑(呈ij^ 溶液或浸滲在微或i微圓盤中)的正常維辦歸基的i歸體系中生長，以刑古 5它殺死或抑制原生動物無性生殖P介段的能力。為了篩選可割戈的治麵物，也考 慮在^^體系中^M藥敏性原生,^有已知抗藥性的生物體。 用于疫苗的艾美球^辦中減W^的i，
一種用于制備疫苗的眾所周知的減毒病毒的方法是在組織培養物中培養至 高傳代7K平。皿長期培養，生物體彭見出，^#^件的累積，并可以喪失 io毒性。這里描述的培養體系是用于艾美球A1物種的長期增殖，以培養用作活疫 苗的非病驗。該^t采用如實施例2中描述的有著50鞭多次傳代的鵬子培 糊專代。
，可以選#^于在牛,細1±生長的自子，選擇是根據，可^ 鵬例如取自各槲中(如狗，貓，牛戯它)的腎臟細肚生長的能力而作出的。 15在各種傳代水平，源自這^i^歸物的,子或卵囊可以通過接種到出生"^ ,鳥或實施例4中描述的劂臺化卵中來測試毒性。保留在i繊中復制的能力 卻在宿主±^現出毒性繊鵬高傳4 粉^^擇用于疫苗開發。
實施例
除非另有說明，下歹i偫定的實施例是為了鄉i脫明，而非想要限定本發明的 20范圍。
實施例1
制備用于接種的鄉鎌體系 3^i歸體系可按以下制備
將牛報宿主細胞的無限增殖比系傳代76次并發現不含支原體。牛^^細 25 ,JiiJ悉的Speereta1.， Id,中的細胞的衍生物。
將宿主細胞維持在補充轉霉素(100單你ml)、麟素 )、兩性霉 素(2.5 ^ml)、 P"鵬乙斷.055mM)和10%馬或牛血清(維^t歸基)的RPM 薩(Gibco)歸基中。
將宿主細胞以約6x 104個細膨ml和 15ml的量接種在150cm2組織^#瓶 30中，產生不鵬80%到100%鋪滿的密度。將細胞在37'C、 5Q/oCQz的i歸箱中用固定的M培養。每三天用15ml的 維^^#基對細胞補料^:天^~ 次。用0.25%的胰蛋白 壞單層而，:1:歸物，并使用相同培養凝Bi^:f牛 把1/6的培# 種在#^新的150cm2的培養瓶中。 實施例2
5 蹄艾美球螨物種原生微
將取自被感染的嫩鳥的糞便的堆型艾美球蟲卵囊按以下制備用于:t，。 MM 加入10份水到1 ^^喊糞H^液，并Mil撤^4 (類似于在LR Ash和TC Orihel, Parasites: A Guide to Laboratoiy Procedures and Identification, ASCP Presst 1991， pp.34-35所描述的Sheathed的糖浮集法)純化卵囊，在此引入作為參考。 10將卵囊離心來濃縮，再重懸浮在2.5%的重鉻酸鉀中，然后室溫下在空氣里暴露24 到72小時以利于孢子形成。^^皿4'C下^i^T^在約25'C下將形成孢子 的卵驗氯己定葡萄離溶^PerioguarcP^中懸浮1併中以殺死污染性細菌。通 過洗滌除去氯己定葡萄,。M31離^800 xg 6併中)使卵紫沉淀，丟棄上清夜， (如mJi清夜被丟棄，懷>| ￡懸有沉 粒)然后如實施例1所描述，在100體 15積的抗生素/抑真菌劑維搟歸基中使沉淀懸浮5l6a療冼滌。離心和塞懸浮再重復 進行2次。
在不艦80%鋪滿，胰蛋白,七接種后，立即4頓實施例1中制備的牛對亥 細胞的燒瓶。然后W^i洛的燒瓶以約1000個的卵囊接種在15ml維辦 基 中，該i歸基如i^M律恪，孢豫卵艱目對宿主細胞的密度為每宿主細胞io'3 20個寄生蟲。將i^J接種在約37。C的5。/oC02^^箱的固定M中。
用牛 細胞培養卵囊10天，每3効[]Ai i，基(15ml) 。 10天后，通 過以下方法收集培養物上清夜和感染的細胞，舌陬單層細鵬i扭歸液中，再如實 施例1戶腿以小于80%的鋪滿將1/20的:t^^種在,(未感皿)牛 細 胞的單層細^±0每^(見察i^/的,體，并觀^t主細,放的和^it培 25養基中的孢豫卵囊。ii51傾析上清夜i薪液收麟的孢豫卵囊，隨后以800 xg的速度離心6併+^濃縮寄生蟲。立即使用孢豫卵囊或^liS 2-7。C的培養 基中，鼓用于另夕卜的實驗。 ^1子的細胞被傳代總計180天，荊^:們 &1^^)中遊賣復制的能力。 實施例3 30 ^m^孢T^的生物體本發明也提供JMH察體外培養和無須對鳥進行接種的感染性來評估保存 的艾美球蟲屬辦中卵^^ ^生存能力的方法。
堆型艾美球蟲的卵紫孢子囊可iiai^^，浮集的方法從雛雞的糞便中獲
得或可從如實施例2臓的^t/中獲得。 5 卵藪孢子囊分為相等的個等傷，。其中四份用低溫冷藏劑(如Freezing
Media , Gibco)，在-20。C冷凍，而第五^H^2 7 。C。
艦與牛靴細胞中的感染,比，可以比較得自該i繊的四份冷凍樣品 與已冷藏的第五份樣品的生存能力。 生存能力比較按以下方、^tfi1。 10簡要地，采用實施例l的方法，寄生蟲接種之前(接種時^吁80%鋪滿)， 立即把牛報細胞以每孔1~2 乂105個細胞的密度移種在帶滅菌蓋玻片的24孑L培
養板內。在維辦咅養基汰自實施例o中制^^^的檢觀胂品(例如，io-1
104),并將O.lml擬中在24孑U^S的一式兩份孔中。在約37'C、 3 5%C02的 斜牛下將i歸板:t歸1到4天。ili!M微li^査檢測孔中堆型艾美球蟲感染階段 15的出現。或者，從 L移去蓋斷，并用魏薩她以便于堆型艾美球蟲寄生蟲的 觀察。當最高I^J見出50%^染性時}憎#^樣品的效價。根據相關的感染效
價比較樣品的生存能力。 實施例4
從i^l中收^l子 20通常在培糊(見實施例1和2)被活鵬復制時，例如在驗分裂(傳代 培養)的10天內收^M子。使用細胞刮取器獲,染的細MB^t/上清夜。 用t!M^式(用27辦頭的纟掛織取)溶鵬主細胞。然后,艦離心(450 xg， 歸中)繊鵬子并在維掛薪基中驟孚。再將最終的懸溯用TO^J物 的接種。 25 實施例5
從i^I中收獲卵囊
為了積聚更多的卵囊，在18 ^M長的時間里i^T、分鵬生長，然后從 (見實施例1和2)中收獲卵囊。如i^fi寸i做的，用Shealher浮驗收集 i^l上清夜并純化取自細胞碎片的卵囊。然后艦離心(405 xg, IO併中)濃 30縮卵囊。將沉淀的卵驗維搟^l中重懸浮并立即j頓。實施例6 鄉鳥的接種
本實施例可以證明用戰實施例2的麟方法生長的堆敏美球蟲和魏艾 美球蟲卵囊和,子作為傲戶性疫苗的可能性。 5 實驗A:以堆型艾美球蟲和^t美球蟲卵囊接禾t^(鳥
方法
M31傾附咅養19天的培，上清夜獲| 自培養牛單核細胞的 艾美球 蟲和堆型艾美球蟲卵囊。艦離心,卵囊，并將其Sl^雜濃度為每ml 100,000 個卵囊的培養基中，然后立即使用。 10 該i^^用三組Rhode Island Red出生~^的鄉鳥。實M^且1是接受堆型艾 美球蟲的源自組織i^l的卵囊的嫩，3);實驗組2是接^IK美球蟲的源 自組織培養物的卵囊的嫩^=3);實驗組3 Ji^照嫩鳥。無卵囊(n=2)。組1 和2分另,管坷法(每鄉鳥100 1000) 口月,卵囊。
結果
15 9天后在實驗組1的鄉鳥糞便中發現卵囊，而12天后在實驗組1和實驗組2 的糞便中都有發現。這，據證實了源自培養吻的卵te這Ml種府頁期的正常 潛伏期內在宿主中是存活的并SiS行了復制。
沒有舒卵囊的組3對照鄉敏其糞輕沒有脫落的卵囊。^ 證實在 微的鳥類中^ 斜牛下沒有艾美球鵬環境污染的證據。因此，組1和2中 20脫落的卵囊可以歸因于i^l接種。 組織病理學
舒魏艾美球蟲卵囊的鵬死于嚴重的腹灣。
顯微微見察取自死亡鄉鳥的鵬組織切片確認球鵬的診斷。這^ 表明
源自牛ffi細膨^/的卵囊可以對鳥類宿主維^t:們的奉性。
25 實驗B:堆型艾美球蟲和纖艾美球艦鄉鳥的攻擊
生物體的歸和傳代
在制備實驗中，將取自以上用于A部分的大量卵囊中的^H式樣的卵囊按實 施例2所述培養，以產^H子的連纟對咅養。在包含牛單核細胞的150 112 中 擬中100個卵囊。如實施例2戶腿將的培^^敏2次傳代以保證在培糊中沒 30有未脫囊的卵囊出現。接種
用培養的I^H出生一天的嫩^(一半為Rhode Island Red或Barred Rock 和Americana)口服接種。接受如上制備的100,000個源自J:^)的堆型艾美球蟲 ^t艾美球蟲的,子的鳥類出現旗瀉。而接受1000,5000和10,000個自子 5的出生1的^(鳥沒有出IJ1I渴。
在接種i歸的鵬子后14天，舒1000,5000和10,000個鵬子的鄉鳥和 沒有接種的1只未接種對照鄉鳥tP^至咖樣A部分脫落卵囊的鄉鳥先前駐留 過的環境中。當腿在這個污鄉的環雖時，沒有接^51子的出生~^的雛 雞死于球蟲病感染。然而，先前接種過少觀殖子,敏臨床上依然健康。這 10 ^表明亞臨床齊懂的,子可以誘導鳥類的免疫性，這傲戶它們可免于隨后 艾美球蟲屬物種致死齊懂的攻擊。
表一
汰鰣鵬子腿對攻繊l臓反 應
2B6060,雕糊亍
2B100,000100,000鵬
2B10,00010,000,雕無臓艦
2B5,0005,000鄉膽
2B1,0001,000鄉雕無W^
1B00,腯死預鵬
15 實驗C:用堆型艾美球蟲和，艾美球蟲接種10天的腳臺
將1000個源自牛,細膨，物的堆型艾美球蟲和^^美球蟲的裂殖子
(如實施例2) m^驗徑體夕碟種到io天大的胚i^鳥卵中，導致任,中
的裂殖子的胚胎死亡。在組織中沒有卵,成的證據。i^M表明在牛TO細 胞中i歸后兩種艾美球^頓中柳^t腳臺毒性。 20實施例7
篩繊原生,劑
25艦j頓實施例1和2的體系ifj古X^子綱中的推薦的抗原生微劑的 有效性。
A. f繊也;j^y (Diclazuri)
鵬包含Thermo腿^(Nalge Nunc International, N^ervffle， IL)的24孑IMH 5培養板，牛單核細胞被接種并在應用實施例1方法的維持培養基中生長到小于 80%的鋪滿。隨后，齡孔用堆型艾美球蟲和魏艾美球蟲接種。艦球蟲齊哋 娜IJ引入10個檢測孔的每一孔的i歸基中，而另IO個孔作為對照。在24、 48、 72小時i^tl中鵬生殖的出現，鯛來頓照 諷治療子Ut間比較、以iff古對式 活性劑的抗原生動物活性。MilM微ll^查和^l薩染色的蓋^觀察寄生蟲的 io生長。鵬生殖的出;貼樹照孔M^的百分比也，細來iff古藥物治療效果。
B. 篩選其他活性劑
采用24孑li且織i歸板，宿主細胞^i宜的維^t歸基、,和適于宿主細 胞的大，中生長到小于80%鋪滿，然后針孑調本發明孢B,種接種。將被 i微的一種或多種活性劑引AliJ 10個檢測力,L的每一孔的i歸基中，而其他 15 10個加樣 L作為對照。頓照加樣 L^治療加銜Lt間比較在i纖中約1-10天 后的生長，從而刑古i(銜式劑的抗原生^T活性。
可以用顯微鏡檢測或用吉姆薩染色法或觀察寄生蟲的適宜染色法染色的蓋 玻片^(見察寄生蟲的生長。
實施例8
20 ifj鵬制原生糊的方法
實施除去可傳播諸如球蟲亞綱的生物體到圈,特定位置的^中的物質 的^方法是M^家畜原生^)感染的方法之一。
釆用實施例1和2各自的方法和i，體系易于if(古這些，方法。 標準樣品(例如垃圾的樣^a)取自相關地區，并將^tS以分離可能雜的 25卵囊。鵬^f種到如實施例2戶腿的i歸體系中，并觀啶5-10琉的生長，同 0 具有已知^1:生物體的樣品麟繊，以確定與凈加臺樣品相關的生^7K平。
然后實tfi 的,方法，其后，在^a^作變4tet^定^g收集預定 量的標準樣品。然后培養新樣品'^e在5-io天時的生長與^s前樣品的生長相 比較，以確定在相關的環境中存活的原生動物的倒可減少。
權利要求
1.一種抗原生動物疫苗組合物，所述疫苗組合物包括通過下述方法增殖的裂殖子種群，所述方法包括(a)提供包含適合孢子綱物種生長的無限增殖比的吞噬哺乳動物宿主細胞的細胞培養體系；(b)將宿主細胞與感染階段的專性細胞內孢子綱原生動物相接觸，從而導致宿主細胞內能夠在無性階段連續生長的裂殖子種群的生長，其中所述接觸是在有效感染宿主細胞的條件下進行；和(c)以裂殖子種群的無性分裂形式增殖裂殖子種群；其中所述專性細胞內原生動物是屬于選自等孢子球蟲屬、囊等孢蟲屬、隱孢子蟲屬、艾美球蟲屬及其組合的屬的物種；并且其中當所述專性細胞內原生動物是屬于艾美球蟲屬的物種時，該艾美球蟲屬物種是能夠感染鳥類宿主的物種。
2. —種經分離的原生動物鵬子棘具有卵囊的鵬子的種群，其中原生動物選自柔嫩艾美球蟲、堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、毒害艾美球蟲、緩艾美球蟲、早熟艾美球蟲、和布氏艾美球蟲、力鳥和數美球蟲、腺艾美球蟲、M財L雀艾美球蟲、分散艾美球蟲、火雞艾美球蟲、無害艾美球蟲、近圓艾美球，其組合，戶服原生動物翻子棘具有卵囊的鵬子的種群JMa下述方法增殖的，臓方飽括(3)提供包含適合孢子,中生長的無限增殖比的吞 乳^1宿主細胞的細胞織體系；(b) 將宿主細胞與感染階段的專性細胞內孢子綱原生^l相接觸，從而導致宿主細胞內育灘在無性階s^賣生長的鵬子種群的生長，其中戶;M織蟲是在有效感染宿主細胞的斜牛下進行；禾卩(c) 以翻子種群的無性分娜微5I^I子種群；其中戶腐專性細胞內原生，是屬，自， ^、 ^to屬、隱孢子蟲屬、艾美球蟲屬及其組合的屬的頓中；并且其中當戶;M專性細胞內原生動物是屬于艾美球蟲屬的物種時，該艾魏^M頓中是肖嫩感染鳥類宿主的辦中。
3. 活生物體在制備用于在鳥類中引起抗原生動劍呆護性免疫的疫苗中的應用，其中所逾活生物體JiM;下述方法增殖的，戶微方飽括(3)衝共包含適合孢子綱中生長的無限增殖比的# 乳^/宿主細胞的細胞培養體系；(b)將宿主細胞與感染階段的專性細胞內孢子綱原生,相織蟲，從而導致宿主細胞內肖嫩在無性階段遊賣生長的鵬子種群的生長，其中所述織蟲是在5有效感染宿主細胞的^f牛下進行；和(C)以翻子種群的無性分娜微Ml^i子種群；其中所述專性細胞內原生動物是屬于選自，，蟲屬、^fto屬、隱孢子蟲屬、艾美球蟲屬及其組合的屬的物沐并且其中當戶脫專性細胞內原生，是屬于艾美球鵬的頓中時，該艾美球蟲屬辦中是肖灘感染鳥類宿主的辦中， 其中所述疫苗包括能有效弓i起鳥類的^i戶性免疫的ifa的活生物體。
4. 權利要求3戶艦的應用，其中戶腐鳥魏別養的鳥類，且該原生,是球蟲屬。
5. 權利要求3所述的應用，其中該鳥難自鴨科、雞臺駢斗、雉科、Thesienidae、鸚鵡科及^ft。
6.權利要求3所述的應用，其中該鳥類是力鳥或嫩鳥。
7. 權利要求3所述的應用，其中活生物體的縫包括翻子鄉嚷鄉混合物，其中所逾活生物體總的M范圍是10 106。
8. 權利要求3所述的應用，其中活生物體的M包括lW l()5個,子或卵囊。
9.權利要求3所述的應用，其中活生物體包括以選自口鵬合藥、繊^M羽毛、卵內 掛及其齢的給藥方式給藥的鵬子、卵囊鄉組合。
10. —種細胞培養體系，所^胞*^體系包括適于孢:^ 種生長的無限增殖比吞噬宿主細胞，并M9胞i，S^,原劑，該還原劑的量能有^l高無限細胞培養物中無性增殖生皿段的孢子,種的存活，其中所，高是相對于raS原劑時i，的孢子,巾的存活而言的。
11. 權利要求1所述的,組，，其中戶，疫苗組^^括藥學上可接受的佐劑。
12. 權利要求ll所述的疫苗組合吻，其中所述疫苗組^2包括混入的食品組倫^til包括下述步驟的方法歸該孢子,中(a) 衝共包含適合孢子自巾生長的無限增殖比的吞M乳^)宿主細胞的細胞歸體系；(b) 將宿主細胞與感染階段的專性細胞內孢子綱原生動物相撤蟲，從而導5致宿主細胞內獸灘在無性階l^生長的，子種群的生長，其中戶，^M是在有效感染宿主細胞的別牛下迸行；和(c) 以|^子種群的無性分 式增|||^1子種群；其中所述專性細胞內原生,，于選自， 蟲屬、H^Fto屬、隱孢子蟲屬、艾美球蟲屬及其組合的屬 種；并且其中當戶服專性細胞內原生動物10是屬于艾美球蟲屬的頓中時，該艾美球蟲屬物種是倉灘感染鳥^t主的物種，其中所述培養是在與和不與待篩選的活性齊l，蟲盼瞎況下進行的，并檢測相對于不郝該活性劑的生長的對生域生存能力的抑制乍用。
13.
14. 一種在無,育階I5^彰歸專性細胞內孢子綱原生動物的方法，所述方飾括 15 (a)提供包含無限增殖比牛 細胞的細胞^#體系；其中無限增殖比牛單核細胞育灘鵬吞噬作用與原生糊結合；其中細胞±歸體系包含適于無限增殖比牛單核細胞生長的培養基，和濃度范圍是0.01M).5mM的(5- 乙醇；(b)在有效感染宿主細胞的條件下使宿主細胞與感染階段的原生動,蟲，導致宿主細胞中的,子生長；和20 (c)以謝直子種群的無性分娜微5l^i子種群；其中所述專性細胞內原生動物^1于選自，，蟲屬、^ to屬、隱抱子蟲屬、艾美球蟲屬及其組合的屬的辦中；并且其中當戶皿專性細胞內原生動物是屬于艾美球蟲屬的辦中時，該艾美球鵬冊是獸辦感染鳥類宿主的辦中。
15. 權利要求14所述的方法，其中戶;MH生糊魏自以下的艾美球顛物25沐魏艾美球蟲、堆歡美球蟲、巨型艾美球蟲、毒害艾美球蟲、數^A、早熟艾美球蟲、禾卩布氏艾美球蟲、力鳥和數辯蟲、腺艾美球蟲、力財L雀艾美球蟲、分散艾美球蟲、M鳥艾美球蟲、無害艾美球蟲、近圓艾美球艦其組合。
16. 權利要求14所述的方法，期f征在于戶脫方法還包括陶fefc歸體系中宿主細胞濃度的步驟，只要生"feii到至少80%鋪滿。
17. —種使雛雞或力鳥對于一種或多種原生動物艾美球蟲屬物種免疫的疫苗，所述疫苗包括鳥數美球鵬辦中的鵬子、產自鵬子的卵囊鄉混糊;其中,子已在無限增殖比哺乳,吞噬細胞的連彰^#吻中增殖。
18. 權利要求17戶腿的疫苗，其中戶/f^哺乳鵬鵬細胞是靴細胞。
19. 權利要求18所述的疫苗，其中戶服報細胞是牛靴細胞。
全文摘要
本發明涉及孢子綱物種體外培養的方法及其用途，特別是通過導致產生裂殖子連續培養的體外組織培養而使原生動物的卵囊脫囊和生長的方法。本發明也提供一種經濟又可靠的，用于疫苗生產、測定和研究的培養的艾美球蟲屬物種。還提供已用所給出的艾美球蟲屬物種接種的馴養的鳥類。
文檔編號C12Q1/02GK101596312SQ20091013953
公開日2009年12月9日 申請日期2003年5月20日 優先權日2002年5月21日
發明者S·P·埃利森 申請人:先靈-普勞有限公司;病原體研究公司