轉基因構建體和轉基因植物的制作方法

專利名稱：轉基因構建體和轉基因植物的制作方法
技術領域：
一般地，本發明涉及分子生物學和轉基因植物領域。具體地，本發明涉及用于在植 物細胞中表達草苷膦(glyphosate)耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpy rul-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)的轉基因構建體、包含所述轉基因構建體 的重組載體、以及用所述轉基因構建體或重組載體轉化的宿主細胞、轉基因植物細胞和轉 基因植物及其制備方法。本發明還涉及賦予植物以草苷膦耐藥性的方法。
背景技術：
EPSPS是芳香族氨基酸合成途徑中的關鍵酶，存在于植物和細菌中。草苷膦，即 N-膦酰甲基甘氨酸，是一種廣譜、高效的發芽后除草劑。它是EPSPS合成底物磷酸烯醇式 丙酮酸(PEP)的競爭性抑制劑，可阻斷PEP和3-磷酸莽草酸這兩種底物在EPSPS催化下向 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的轉化，從而阻斷芳香族氨基酸合成前體_莽草酸的 合成途徑，導致植物和細菌死亡。植株對草苷膦的耐藥性可通過向它們的基因組穩定引入草苷膦耐受型EPSPS 編碼基因而獲得。目前已知的草苷膦耐受型EPSPS基因主要有兩大類1類(例如US 4，971，908 ；US 5，310，667 ；US 5，866，775 等)和 II 類(例如 US5, 627，061 ；US 5，633，435 等)，它們都已成功導入植物基因組中，獲得了具有草苷膦耐受性的植物細胞，以及完整的 植株。本發明的目的是穩定或提高EPSPS轉基因在植物細胞中的表達，從而獲得能耐受 草苷膦的轉基因植物。

發明內容
本發明提供了一種分離的多核苷酸，其以從5’到3’的方向包含編碼葉綠體轉運 肽(chloroplast transfer peptide, CTP)的核苷酸序列和編碼草苷膦耐受型EPSPS的核 苷酸序列。在一個實施方案中，所述編碼CTP的核苷酸序列是編碼擬南芥EPSPS CTP的核 苷酸序列，例如序列表中序列7所示序列。在另一個實施方案中，所述編碼草苷膦耐受型 EPSPS的核苷酸序列是編碼惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) EPSPS即AroA的核苷酸序 列，例如序列9或10所示序列。或者，可以對編碼CTP的核苷酸序列和/或編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序 列進行修飾，例如一個或幾個密碼子(即核苷酸三聯體)的缺失和/或添加和/或替代。在 一個實施方案中，所述修飾是沉默的，例如經過修飾的編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸 序列編碼氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列相同的EPSPS。在一個具體的 實施方案中，所述修飾是為了植物密碼子偏愛性和/或減少核酸二級結構而進行的密碼子 優化。在另一個實施方案中，所述修飾是保守的，例如經過修飾的編碼草苷膦耐受型EPSPS 的核苷酸序列編碼氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS變體， 且所述EPSPS變體具有與天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草苷膦耐受性。本發明還涵蓋非沉默的或非保守的修飾。又或者，可以對編碼CTP的核苷酸序列和/或編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸 序列進行修飾，例如一個或幾個密碼子(即核苷酸三聯體)的缺失和/或添加和/或替 代。在一個實施方案中，對編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列進行修飾，經過修飾的核 苷酸序列與編碼草苷膦耐受型EPSPS的天然核苷酸序列具有約50%、約60%、約70%、約 75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的核苷酸序列 同源性或同一性。在一 個具體的實施方案，所述經過修飾的核苷酸序列編碼氨基酸序列與 草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列相同的EPSPS。在另一個具體的實施方案中，所述經過 修飾的核苷酸序列編碼氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS變 體，且所述EPSPS變體具有與天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草苷膦耐受性。在另 一個實施方案中，對編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列進行修飾，經過修飾的核苷酸 序列編碼氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS變體，所述EPSPS 變體的氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS的天然氨基酸序列具有約50 %、約60 %、約70 %、 約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的氨基酸序 列同源性或同一性，且所述EPSPS變體具有與天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草苷 膦耐受性。又或者，可以對編碼CTP的核苷酸序列和/或編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸 序列進行修飾，例如一個或幾個密碼子(即核苷酸三聯體)的缺失和/或添加和/或替代。 在一個實施方案中，對編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列進行修飾，經過修飾的核苷 酸序列與編碼草苷膦耐受型EPSPS的天然核苷酸序列的片段(例如至少約10個、約15個、 約20個、約25個、約50個、約75個、約100個、約125個、約150個、約175個、約200個、 約250個、約300個、約350個、約400個、約450個、約500個或更多連續核苷酸的片段)在 嚴格條件(例如很低的、低的、中等的、高的、或很高的嚴格條件)下發生雜交。在一個具體 的實施方案，所述經過修飾的核苷酸序列編碼氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基 酸序列相同的EPSPS。在另一個具體的實施方案中，所述經過修飾的核苷酸序列編碼氨基酸 序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS變體，且所述EPSPS變體具有與 天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草苷膦耐受性。在另一個實施方案中，對編碼草苷 膦耐受型EPSPS的核苷酸序列進行修飾，經過修飾的核苷酸序列編碼氨基酸序列與草苷膦 耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS變體，所述EPSPS變體的氨基酸序列與草苷膦 耐受型EPSPS的天然氨基酸序列具有約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、 約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的氨基酸序列同源性或同一性，且所述 EPSPS變體具有與天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草苷膦耐受性。本發明提供了一種融合蛋白，其以從N端到C端的方向包含CTP和草苷膦耐受型 EPSPS。在一個實施方案中，所述CTP是擬南芥EPSPS CTP，例如序列表中序列6所示序列。 在另一個實施方案中，所述草苷膦耐受型EPSPS是惡臭假單胞菌EPSPS即AroA的氨基酸序 列，例如序列8所示序列。或者，可以對CTP的氨基酸序列和/或草苷膦耐受型EPSPS的氨基酸序列進行修 飾，例如一個或幾個氨基酸殘基的缺失和/或添加和/或替代。在一個實施方案中，所述 修飾是保守的，例如經過修飾的草苷膦耐受型EPSPS的氨基酸序列與草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同，且所述EPSPS變體具有與天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草 苷膦耐受性。在一個具體的實施方案中，所述EPSPS變體的氨基酸序列與草苷膦耐受型 EPSPS的天然氨基酸序列具有約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、 約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的氨基酸序列同源性或同一性，且所述EPSPS變 體具有與天然EPSPS相同或相當的EPSPS活性和草苷膦耐受性。本發明還涵蓋非保守的修 飾。 本發明還提供了一種核酸構建體，其包含本發明的分離的多核苷酸。在一個實施 方案中，所述核酸構建體是表達盒。本發明還提供了一種重組載體，其包含本發明的分離的 多核苷酸，或包含本發明的核酸構建體。在一個實施方案中，所述重組載體是重組克隆質粒 或重組表達質粒。本發明還提供了一種宿主細胞，其包含本發明的分離的多核苷酸，或包含 本發明的核酸構建體，或包含本發明的重組載體。在一個實施方案中，所述宿主細胞是原核 宿主細胞，例如細菌宿主細胞。在一個具體的實施方案中，所述細菌宿主細胞是大腸桿菌 (Escherichia coli)宿主細胞。在另一個具體的實施方案中，所述細菌宿主細胞是農桿菌 宿主細胞，諸如根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主細胞。本發明還提供了一種轉基因植物細胞和轉基因植物，其包含本發明的分離的多 核苷酸，或包含本發明的核酸構建體，或包含本發明的重組載體，或包含本發明的宿主細 胞。在一個實施方案中，本發明的分離的多核苷酸整合在所述轉基因植物細胞的基因組中。 在一個實施方案中，所述植物或所述植物細胞是農作物，包括糧食作物和經濟作物。在一 個實施方案中，所述植物或所述植物細胞是例如選自下組的植物或植物細胞稻(Oryza， 包括 Oryza sativa L·)、小米(Setaria italica L·)、小麥(Triticum, ^ll Triticum sestivum L.)、大麥(Hordeum,包括 Hordeum vulgare L.)、燕麥(Avena,包括 Avena sativa L.) > Μ^ (Sorghum, ^ll Sorghum bicolor L.) > ΞΕ^: (Zea, ^ll Zea may L.) > 馬鈴薯(Solanum tuberosum L·)、大豆(Glycine,包括 Glycine maxL·)、花生(Arachis, 包括 Arachis hypogaea L.)、向日葵(Helianthus,包括 Helianthus annuus L·)、棉花 (Gossypium, ^ll Gossypium hirsutum L·)、苜猜(Medicago, 'll Medicago sativa L.)、 煙草(Nicotiana, ^ll Nicotiana tabacum L·)、油菜(Brassica campestris L·)、青菜 (Brassica chinensis L. ) >1ξ["Μ (Brassica oleracea L· )、^E 胃(Brassica oleracea var. botrytis L. )(Brassica oleracea var. capitata L.)等。$一yIv^IfeTj^ 中，所述轉基因植物細胞和轉基因植物具有對草苷膦的耐受性。本發明還提供了制備本發明的轉基因植物細胞和轉基因植物的方法，其包括將本 發明的分離的多核苷酸、核酸構建體、重組載體或重組宿主細胞導入植物細胞的步驟。在一 個實施方案中，本發明的分離的多核苷酸整合在所述轉基因植物細胞的基因組中。在一個 實施方案中，所述轉基因植物細胞和轉基因植物具有對草苷膦的耐受性。本發明還提供了賦予植物細胞或植物以草苷膦耐受性的方法，其包括將本發明的 分離的多核苷酸、核酸構建體、重組載體或重組宿主細胞導入植物細胞的步驟。在一個實施 方案中，本發明的分離的多核苷酸整合在所述轉基因植物細胞的基因組中。


圖1是轉基因表達盒的示意圖。LB，T-DNA的左邊界；RB，T-DNA的右邊界；Pnos，胭脂堿合成酶基因Nos的啟動子；P35S，煙草花葉病毒的35S啟動子，即CaMV35S啟動子； Tnos，胭脂堿合成酶基因Nos的啟動子；Nptll，新霉素磷酸轉移酶II基因；CTP，來源于擬 南芥的EPSP合酶的葉綠體前導肽的編碼序列；n-EPSPS，來源于惡臭假單胞菌的EPSP合酶 的編碼序列；o-EPSPS，密碼子優化后的EPSP合酶的編碼序列(根據雙子葉植物的密碼子偏 愛性而設計的人工合成序列)。圖2顯 示了轉基因煙草與野生型煙草噴灑草苷膦除草劑后的生長狀況。A 轉基因 煙草，B:野生型煙草。圖3顯示了轉基因煙草的PCR檢測。泳道1-6 依次為2323-4/5/15/16Λ0/23 ；泳 道M =DNA標志物DL2000 ；泳道WT 野生型對照煙草。圖4顯示了轉基因煙草的Southern印跡檢測。泳道1-4 依次為2323-4/5/15/16 ； 泳道5:野生型對照煙草。圖5顯示了轉基因煙草的RT-PCR檢測。泳道M :DNA標志物DL2000 ；泳道WT 野 生型對照煙草；泳道1-6 依次為2323-4/5/15/16/20/23。圖6顯示了轉基因煙草的密碼子優化前后的RT-PCR檢測。泳道1 密碼子優化的 轉基因煙草2323-4 ；泳道2 密碼子優化的轉基因煙草2323-4中的肌動蛋白內參；泳道3 密碼子未優化的轉基因煙草2349-2中的肌動蛋白內參；泳道4 密碼子未優化的轉基因煙 草 2349-2。圖7顯示了轉基因煙草的EPSPS蛋白的Western印跡檢測。泳道1 惡臭假單胞菌 的EPSPS ；泳道2-7 依次為2323-4/5/15/16/20/23 ；泳道8 非轉基因煙草對照；泳道M 蛋 白質標志物。圖8顯示了野生型煙草的草苷膦耐受性測定。野生型煙草種子在含有不同濃度 草苷膦的平板上的萌芽情況從左到右，草苷膦的濃度依次為0mM，0. 05mM,0. lmM,0. 2mM和 0. 5mM。圖9顯示了轉基因煙草TO代種子萌發測定。A 不含草苷膦的MS平板上的種子萌 芽情況；B 含ImM草苷膦的MS平板上的種子萌芽情況。每塊平板的左半邊為空載體對照煙 草，右半邊為耐受草苷膦的轉基因煙草。圖10顯示了轉基因煙草TO代種子萌發測定a.草苷膦濃度為OmM時，轉基因煙 草的幼苗均能萌芽生長b.草苷膦濃度為IOmM時，轉基因煙草的部分幼苗耐受草苷膦。圖11顯示了轉基因煙草Tl代的PCR檢測。泳道1_10 轉基因煙草的Tl代植株； 泳道M :DNA標志物DL2000 ；泳道12 非轉基因煙草對照；泳道13 質粒陽性對照。發明詳述定義本文中“序列同源性或同一性％”是指通過序列對比，并且必要時插入空隙以獲得 同源性或同一性的最大百分比(而且，在計算序列同一性％時不考慮任何保守替代)，候選 序列中相同于目標序列的氨基酸殘基的百分數。此處所述序列包括氨基酸序列和核苷酸序 列。可使用本領域已知的各種方法測定序列同源性或同一性百分比，例如，使用公眾可得到 的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)。本領域技術人員 可以確定用于序列對比的具體參數，以及全長序列的最大比較所需的任何算法。雜交反應的“嚴格性”可以由本領域普通技術人員容易的確定，而且通常根據探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經驗計算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退火， 而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環境 中時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同一性程度越高，可使用的 相對溫度也越高。結果是，推斷出較高相對溫度將趨向于使反應條件更為嚴格，而較低溫 度也就較不嚴格。關于雜交反應嚴格性的其它細節和解釋，參見Ausubel et al. ,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers(1995)。“高嚴格性條件”通過如下各項定義(1)采用低離子強度和高溫進行清洗；0.015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 十二烷基硫酸鈉，于50°C ； (2)在雜交過程中采 用變性劑；50% (ν/ν)甲酰胺及0. 牛血清清蛋白/0. l%Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷 酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42°C ；或(3)采用50% 甲酰胺，5x SSC(0. 75MNaCl，0. 075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6. 8)，0. 1 %焦磷酸鈉， 5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50 μ g/ml)，0. 1% SDSjP 10%硫酸右旋糖苷， 于42°C，及于42°C在0. 2x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中清洗，接著于55°C在 含EDTA的0. Ix SSC中進行高嚴格性清洗。“ 中等嚴格條件”可以如 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press (1989)中所述鑒定，包括于 37°C在含 20% 甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM 檸檬酸三鈉)，50mM 磷酸鈉(pH 7. 6)，5x Denhardt 氏 溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過夜，接著于約 37-50°C在Ix SSC中清洗濾膜。技術人員將認識到如何在必要時調整溫度、離子強度等以 適應諸如探針長度等因素。本文中“核酸構建體”與“轉基因構建體”同義，指單鏈或雙鏈核酸分子，這些分子 分離自天然基因或已經過改變而含有以自然界不存在的方式而結合和并列的核酸片段。當 核酸構建體含有表達本發明EPSPS所需的所有調控序列時，術語“核酸構建體”與“表達盒” 是同義詞。本文中“調控序列”包括表達本發明多肽所必需的或有利的所有元件。每一種調 控序列既可以是編碼該多肽的核酸序列天然具有的，也可以是外來的。這種調控序列包括， 但不限于，前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、和轉錄終止子。調控序列最少應 包括啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號。為了導入特異的限制性酶切位點以有助于調控序 列和編碼異源多肽的核酸序列的編碼區進行連接，可以制備帶有接頭的調控序列。本文中“可操作地連接”定義為使本發明的分離的核酸序列與相對于該序列同源 或異源的任何其它序列相連，從而使它們作為一個整體能編碼一種產物。需要時，可通過一 定方式，如通過限制性內切酶的酶切而使它們分離。這里所述的同源或異源序列可以是任 何序列，如能指導本發明所述分離的核酸序列在特定宿主細胞中表達的任何調控序列，或 與本發明所述分離的核酸序列共同編碼一種融合蛋白的序列，等等。本文中“宿主細胞”包括任何能接受本發明所述分離的核酸序列，或能接受含有該 序列的構建體或載體，并使該序列穩定維持在細胞內的細胞。宿主細胞包含了本發明所述 分離的核酸序列后，能獲得由該序列編碼的性狀或特征。EPSPS本發明的一個方面涉及耐受草苷膦且具有EPSPS活性的蛋白質，例如惡臭假單胞菌的EPSPS，即AroA，例如序列表中的序列8。本發明還涉及上述蛋白質的變體或突變體，其中所述變體或突變體的氨基酸序列 相對于本文所述氨基酸序列有一個或幾個氨基酸的取代、缺失和/或添加，但該變體或突 變體仍 耐受草苷膦且具有EPSPS活性。所述氨基酸的取代、缺失和/或添加都是本領域常 規技術可以完成的。優選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/ 或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延 伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。保守取代的實例是在下列氨基酸組內發生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨 酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、 疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨 酸)、以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定 活性的那些氨基酸取代在本領域內是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill 在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的Protein中進行了描述。最常見的 互換有 Ala/Ser，Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, S er/ Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Iys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu,和 Asp/Gly，以及它 們相反的互換。對于本領域的技術人員而言很明顯，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區 域之外發生，而且仍產生活性多肽。對于由本發明的分離的核酸序列編碼的多肽，其活性必 需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨 酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells，1989，Science 244:1081—1085)。后 一技術是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的草苷膦耐受型 EPSPS活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以 通過其三維結構的分析來測定，這種三維結構可由核磁共振分析、結晶學或光親合標記等 技術測定(參見，如 de Vos 等，1992，Science 255 :306_312 ;Smith 等，1992，J. Mol. Biol 224 899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBS Letters 309 59-64)。本發明還涉及與本文所述氨基酸序列(例如序列8所示氨基酸序列)具有一定 同源性或同一性的氨基酸序列，如同源性或同一性為至少約50%，優選至少約60%，優選 至少約65 %，優選至少約66 %，優選至少約67 %，優選至少約68 %，優選至少約69 %，優選 至少約70%，優選至少約71 %，優選至少約72%，優選至少約73%，優選至少約74%，優選 至少約75 %，優選至少約76 %，優選至少約77 %，優選至少約78 %，優選至少約79 %，更優 選至少約80 %，更優選至少約81 %，更優選至少約82 %，更優選至少約83 %，更優選至少約 84%，更優選至少約85 %，更優選至少約86 %，更優選至少約87 %，更優選至少約88 %，更 優選至少約89 %，更優選至少約90 %，更優選至少約91 %，更優選至少約92 %，更優選至少 約93%，更優選至少約94%，最優選至少約95%，最優選至少約96%，最優選至少約97%， 最優選至少約98%，最優選至少約99%，只要具有所述氨基酸序列的蛋白為草苷膦耐受型 EPSPS蛋白，該序列就屬于本發明的范圍。本發明還涉及如下的蛋白質，其具有含本文所述氨基酸序列(例如序列8所示氨 基酸序列)之EPSPS的活性的至少20 %，優選至少40 %，更優選至少60 %，甚至更優選至少 80 %，甚至更優選至少90 %，最優選至少100 %。
本發明的另一方面涉及編碼耐受草苷膦且具有EPSPS活性的蛋白質(例如惡臭假 單胞菌的EPSPS，即AroA)的多核苷酸，例如序列表中的序列9或10。本發明還涉及上述多核苷酸的變體或突變體，其中所述變體或突變體的核苷酸序 列相對于本文所述核苷酸序列有一個或幾個三聯體密碼子的取代、缺失和/或添加，但該 變體或突變體仍編碼耐受草苷膦且具有EPSPS活性的蛋白質。所述三聯體密碼子的取代、 缺失和/或添加都是本領域常規技術可以完成的。優選這種三聯體密碼子變化導致如下的 氨基酸變化小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的 缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基 或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨 酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。本發明還涉及與本文所述核苷酸序列(例如序列9或10所示核苷酸序列)具有 一定同源性或同一性的核苷酸序列，如同源性或同一性為至少約65%，優選至少約66%， 優選至少約67 %，優選至少約68 %，優選至少約69 %，優選至少約70 %，優選至少約71 %， 優選至少約72%，優選至少約73%，優選至少約74%，優選至少約75%，優選至少約76%， 優選至少約77%，優選至少約78%，優選至少約79%，更優選至少約80%，更優選至少約 81%,更優選至少約82%，更優選至少約83%，更優選至少約84%，更優選至少約85%，更 優選至少約86 %，更優選至少約87 %，更優選至少約88 %，更優選至少約89 %，更優選至少 約90%，更優選至少約91 %，更優選至少約92%，更優選至少約93%，更優選至少約94%， 最優選至少約95 %，最優選至少約96 %，最優選至少約97 %，最優選至少約98 %，最優選至 少約99%，只要具有所述核苷酸序列的多核苷酸編碼草苷膦耐受型EPSPS蛋白，該序列就 屬于本發明的范圍。本發明還涉及如下的多核苷酸，其編碼的蛋白質具有含本文所述氨基酸序列(例 如序列8所示氨基酸序列)之EPSPS的活性的至少20 %，優選至少40 %，更優選至少60 %， 甚至更優選至少80 %，甚至更優選至少90 %，最優選至少100 %。本發明所述分離的多核苷酸可按照本領域眾所周知的方法從自然界克隆而獲得。 克隆方法可包括限制酶切割并分離含有編碼目標蛋白的核酸序列的預期核酸片段，將該 片段插入載體分子中，將該重組載體摻入到宿主細胞中，從而使該核酸序列的多個拷貝或 克隆在該宿主細胞中復制。但是，更簡便的方法是，根據在此公開的核苷酸序列，用自動核 苷酸合成儀(如Applied Biosystems公司的ABI394 DNA合成儀)合成所述序列，或參照 2000年10月4日公開的中國專利申請99103472. 4的方法，分別合成上述核酸序列的片段， 然后用常規連接酶和載體將這些片段連接成完整序列。本發明的核酸序列可以是基因組序列、cDNA序列、RNA序列、半合成的序列、完全 人工合成的序列或其任何組合物。當合適時，可以優化編碼EPSPS的核苷酸序列，以提高在植物中的表達。換言 之，可以使用植物偏愛的密碼子來合成編碼EPSPS的核苷酸序列，以提高表達。參見例如 Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol. 92 =I-Il0合成植物偏愛型基因的方法是本領域 公知的。參見例如美國專利號 5，380，831 ；5，436，391 ；及Murray 等，(1989)Nucleic Acids Res. 17 :477-498。還可以為了降低核酸的二級結構而優化編碼EPSPS的核苷酸序列，從而提高基因 的表達。
核酸構建體或轉基因構建體本發明的另一方面涉及核酸構建體。在一個實施方案中，所述核酸構建體用于在植物細胞中表達草苷膦耐受型EPSPS 并將所表達的草苷膦耐受型EPSPS定位于葉綠體。當目標基因不是在葉綠體中表達時，核 酸構 建體將額外包含編碼葉綠體轉運肽的核苷酸序列，以指導目標基因產物到達葉綠體。 此類葉綠體轉運肽是本領域已知的。參見例如von Heijne等，(1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9 104-126 ；Clark 等，(1989) J. Biol. Chem. 264 17544-17550 ；Della-Cioppa 等， (1987)Plant Physiol. 84 :965_968 ；Romer 等，(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 1414-1421 ；及Shah等，(1986) Science 233:478-481。其它轉運肽包括美國申請號 20020073443和美國申請號20020178467中所述的轉運膚。在其它實施方案中，目標基因可 以被靶向定位到細胞外或其它的細胞內組分處，例如核、線粒體或內質網。靶向葉綠體的序列是本領域已知的，包括核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶 (Rubisco)的葉綠體小亞基(de Castro Silva Filho 等，(1996)Plant Mol. Biol. 30 769-780 ；Schnell 等，(1991) J. Biol. Chem. 266 (5) :3335_3342) ；EPSPS (Archer 等， (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6) :789_810)；色氨酸合酶(Zhao 等，(1995) J. Biol. Chem. 270(11) :6081_6087)；質體藍素(Lawrence 等，(1997) J. Biol. Chem. 272(33) 20357-20363)；和捕光葉綠素 a/b 結合蛋白(LHBP) (Lamppa 等，(1988) J. Biol. Chem. 263 14996-14999)。還參見 von Heijne 等，(1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9 104-126 ；Clark 等，(1989) J. Biol. Chem. 264 17544-17550 ;Della-Cioppa 等，(1987) Plant Physiol. 84 965-968 ；Romer 等，(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 1414-1421 ；及 Shah 等， (1986)Science233 :478_481。轉化葉綠體的方法是本領域已知的。參見例如Svab等，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 8526-8530 ；Svab 和 Maliga，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :913_917 ； Svab 禾口 Maliga，(1993)EMBO J. 12 :601_606。在一個實施方案中，本發明的核酸構建體以從5’到3’的方向包含編碼CTP的核 苷酸序列和編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列。例如，所述編碼CTP的核苷酸序列可 以是編碼擬南芥EPSPS CTP的核苷酸序列，例如序列表中的序列6。例如，所述編碼草苷膦 耐受型EPSPS的核苷酸序列可以是編碼惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA的核苷酸序列，例如 序列表中的序列9或10。本發明的核酸構建體還可含有能使上述序列在所選宿主細胞中表達所必需的調 控序列。所述調控序列與上述分離的核酸序列在核酸構建體中可操作地連接。調控序列可以是啟動子序列，包括介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以 是在細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的、及雜合的啟動子，而且可 以從編碼細胞外或細胞內多肽的基因中得到，這些多肽可以與該細胞同源或不同源。眾多 用于原核細胞的啟動子為本領域所熟知。調控序列也可以是適當的轉錄終止序列，即被本文所述的宿主細胞識別以終止轉 錄的序列。該終止序列與編碼多肽的核酸序列的3’端可操作地連接。任何在宿主細胞中 有功能的終止子都可以在本發明中使用。調控序列可以是適當的前導序列，即mRNA上對細胞的翻譯很重要的非翻譯區。前導序列與編碼多肽的核酸序列的5’端可操作地連接。任何在宿主細胞中有功能的前導序 列都可以在本發明中使用。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列。該序列與核酸序列的3’端可操作地連接，而 且當轉錄時，被細胞作為信號來識別，從而將聚腺苷酸殘基加到轉錄出的mRNA上。任何在 該細胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可以在本發明中使用。核酸構建體還可以包括一個或幾個這樣的核酸序列，這些核酸序列編碼一個或幾個有利于指導異源多肽表達的因子，例如，轉錄激活因子(如反式作用因子)、伴侶蛋白和 加工型蛋白酶。任何在宿主細胞特別是細菌細胞和植物細胞中有效的因子都可以在本發明 中使用。編碼一個或幾個這些因子的核酸不一定與編碼異源多肽的核酸序列串聯。重組載體或重組表達載體可以將上述各種核酸和調控序列連接在質粒或病毒等常規載體上，產生本發明的 “重組表達載體”，所用方法是本領域技術人員所熟知的(可參見J. Sambrook，Ε. F. Fritsch 禾口 Τ· Maniatus,1989, Molecullar Cloning, laboratory mannual,第 2 版，Cold Spring, NY)。所述載體可以包含一個或幾個便利的限制性內切酶位點。載體的選擇通常取決于載 體與所用宿主細胞的兼容性。所述載體可以是線性或閉合環狀質粒。這樣的載體可以是自 主復制型載體，即，以染色體外實體的形式存在的載體，其復制獨立于染色體的復制，如質 粒(一種染色體外元件)，微型染色體，或人工染色體。載體可以包含確保自我復制的任何 手段。或者，所述載體也可在導入細胞后，整合到基因組中并隨染色體一起復制。載體系統 可以是單一載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒(它們共同包含目標核酸序列)，或是 轉座子。在載體向細胞基因組整合的情況中，該載體可以包含指導該載體通過同源重組整 合入細胞基因組的附加核酸序列。這些附加的核酸序列能夠使該載體在染色體的精確位置 整合入基因組中。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優選包含足夠數量的 核酸，例如100至1500個堿基對，優選400至1500個堿基對，最優選800至1500個堿基對， 它們與其相應的靶序列高度同源以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與細胞基 因組中靶序列同源的任何序列。而且，這些整合元件可以是非編碼或編碼型核酸序列。另 一方面，該載體可以通過非同源重組整合入細胞的基因組中。在自主復制的情況中，該載體可以進一步包含使該載體能在細菌細胞和植物細胞 中自主復制的復制起始點。宿主細胞本發明還涉及含有本發明核酸序列的重組“宿主細胞”。可將含有本發明核酸序列 的核酸構建體或載體引入宿主細胞中，使本發明的核酸序列整合至染色體上或使載體自主 復制，從而本發明的核酸序列得以在該宿主細胞中穩定表達，導致賦予該宿主細胞抗草苷 膦的抗性。宿主細胞可以是原核生物如細菌的細胞，但更優選真核生物如植物的細胞。常用的細菌細胞有革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌的細胞，或革蘭氏陰性細菌如大腸 桿菌和假單胞菌的細胞。在一個優選的實施方案中，細菌宿主細胞大腸桿菌的細胞。將表達載體引入細菌宿主細胞可通過原生質體轉化(如Chang和Cohen， 1979，分子普通遺傳學168 :111-115)，利用感受態細胞(如Young和Spizizin, 1961,J.Bacteriol.81 :823_829，或 Dubnau 禾口 Davidoff-Abelson，1971， J. Mol. Biol. 56 209-221)，通過電穿孔(如 Shigekawa 和 Dower，1988，Biotech. 6 :742_751)，或通過接合作 用(如 Koehler 和 Thorne, 1987，J. Bacteriol. 169 :5771_5278)而實現。轉基因植物
將異源DNA導入植物細胞后，可以通過本領域已知的多種方法來確認異源基因在 植物基因組中的整合。PCR測定法可以使用對目標基因或土壤桿菌載體背景等特異性的寡核甘酸引物 來進行PCR，用以篩選植物細胞中是否存在所整合的基因的。Southern測定法可以通過基因組DNA的Southern印跡測定法來確認植物轉化。 一般而言，從轉化體中提取總DNA，用合適的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠上分開，并轉移到硝 酸纖維素或尼龍膜上。然后根據標準技術，用例如放射標記的靶DNA片段探查膜或印跡，以 確認所導入的外源基因在植物基因組中的整合。RT-PCR測定法可以通過總RNA的RT-PCR測定法來確認異源基因在轉基因植物 中的轉錄。Western印跡測定法可以對轉基因植物進行Western印跡，其中使用能結合草苷 膦抗性蛋白上的一個或幾個表位的抗體。
實施例實施例1 惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA的克隆、表達和純化本實施例中使用了已經在申請號為02117991. 3的中國專利申請中公開的質粒 PKU2002，它是包含惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA野生型核苷酸序列(SEQ ID NO 9)的 PUC18衍生質粒。根據質粒pKU2002上EPSPS基因aroA的核苷酸序列，設計并合成了 5，端引物 1(5，-cat Rcc atR rAA GTA ACA ATA CAG CCC GGA G_3，，SEQ ID NO 1)和 3，端引物 2(5，-gtt act CRa rTG AGA AAT TAA ATT GAT GGT TT-3，，SEQ ID NO 2)(其中下劃線 標示了在aroA核苷酸序列的側翼添加的供克隆用的NcoI和XhoI限制性位點)。以質粒 PKU2002為模板，用引物1和引物2通過PCR擴增aroA核苷酸序列。PCR條件為94°C預 變性10分鐘；然后是30個循環的94°C 1分鐘、50°C 1分鐘、72°C 2分鐘；最后是72°C再 延伸10分鐘。將所得PCR產物用限制性內切核酸酶NcoI和XhoI消化后連接入表達載體 pET-28a(+) (Novagen)，所得質粒命名為 pKU2364。 將質粒pKU2364通過氯化鈣法轉化入大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen)。將攜帶質粒 PKU2364的大腸桿菌BL21 (DE3)接種入300mL補充有25mg/L卡那霉素的LB液體培養基，于 37°C振蕩培養至0D_達到約0. 8。加入IPTG至終濃度為ImM，繼續培養3小時。將培養物于室溫以SOOOrpm離心10分鐘，丟棄上清液，并將菌體沉淀物重懸于 30mL 含 0. ImM DTT 的 Tris-HCl pH 7. O。超聲處理后，使用 HisTrap HP 試劑盒(Amersham Biosciences)依照制造商的說明書分離和純化蛋白質。所得蛋白質即為惡臭假單胞菌 EPSPS。實施例2 針對惡臭假單胞菌EPSPS的多克隆抗體的制備給家兔免疫接種如實施例1所述制備的惡臭假單胞菌EPSPS蛋白。4次免疫(第一次使用弗氏完全佐劑，其余使用弗氏不完全佐劑)和1次加強免疫(使用弗氏不完全佐 劑)(各次免疫的時間間隔為10天)后，采集血液并制備抗血清。實施例3 轉基因構建體的構建為了在植物中表達EPSPS基因aroA，設計并構建了轉基因構建體(見圖1)。一方 面，根據植物密碼子偏好性以及核酸二級結構預測，對EPSPS基因aroA的核苷酸序列進行 了密碼子優化，用以提高EPSPS基因aroA在植物中的表達水平和消除可能的核酸二級結 構。另一方面，為了將在細胞中生成的AroA蛋白質引導至葉綠體，將擬南芥EPSPS CTP編 碼序列(SEQ ID NO 7)連接在經過密碼子優化的AroA編碼序列(SEQ ID NO 10)的5，端。將人工合成的全長編碼序列(包含擬南芥EPSPS CTP核苷酸序列和經過密碼子優 化的惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA核苷酸序列)通過限制性位點BamHI和SacI連接入植 物表達載體PBI121 (Clontech)，所得質粒命名為pKU2323。包含擬南芥EPSPS CTP核苷酸 序列和未經優化的惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA核苷酸序列(SEQ ID NO 9)的質粒命名 為 pKU2349。
實施例4 轉基因植物的構建1.制備感受態根瘤農桿菌將根瘤農桿菌LBA4404(Life Technologies)在補充有 50mg/L 鏈霉素和 50mg/L 利福平的LB板上于28°C活化培養48小時。挑取單菌落，接種入3mL補充有50mg/L鏈霉素 和50mg/L利福平的LB液體培養基，于28°C振蕩培養過夜。將培養物按照1 100的比例 接種入20mL補充有50mg/L鏈霉素和50mg/L利福平的LB液體培養基，于28°C振蕩培養至 OD600達到約0. 6。將培養物在冰上放置10分鐘，然后于4°C以5000rpm離心10分鐘，丟棄 上清液，將菌體沉淀物重懸于預冷的2mL 0. 2M CaCl2和2mL 0. IM MgS04。將細菌懸浮液在 冰上放置30分鐘，然后于4°C以5000rpm離心10分鐘，丟棄上清液，將菌體沉淀物重懸于預 冷的0. 5mL 0. 2M CaCl2和0. 5mL 0. IM MgSO4,即得感受態細胞。2.用重組質粒轉化感受態農桿菌將2ul pKU2323質粒DNA (lug/ul)添加至200ul感受態細胞，輕輕混勻，在冰上放 置30分鐘。將細菌懸浮液在液氮中冷激1分鐘，然后立即在42°C水浴中熱激90秒，再然 后立即在冰上放置5分鐘。將細菌懸浮液接種入SOOul未補充抗生素的LB液體培養基， 于28V復蘇4-6小時。取適量細菌懸浮液涂布到補充有50mg/L鏈霉素、50mg/L利福平和 25mg/L卡那霉素的LB板上，將板于28°C溫育2天。從平板上挑取單菌落，接種入ImL補充有50mg/L鏈霉素、50mg/L利福平和25mg/ L卡那霉素的LB液體培養基，于28°C振蕩培養過夜。將培養物接種入50ml上述培養基，并 培養至OD6tltl達到約0. 5 (大約3-4小時)。將培養物以5000rpm離心10分鐘，丟棄上清液， 將菌體沉淀物重懸于適量MS培養基(Gibco BRL ；還可參見Murashige和Skoog，1962)，使 得 OD6tltl 為 0. 2-0. 3。3.用轉化農桿菌葉盤法感染煙草取煙草(Nicotiana tabacum L. cv. W38)(由北京大學林忠平教授饋贈)顏色鮮綠 的幼嫩葉片，將其剪成0.8cm χ 0.8cm的碎片，并在上述細菌懸浮液中浸泡15分鐘。將浸 泡過的葉片擺放在MS1培養基(MS培養基補加lmg/L 6-芐基腺嘌呤和0. lmg/L萘乙酸) 上，于25°C在黑暗中溫育60小時。然后，清洗煙草葉片，并轉移到MS2培養基(MS培養基補加lmg/L 6-芐基腺嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、300mg/L頭孢霉素和200mg/L卡那霉素)上，于 25°C在光照下溫育16小時。2周后可見愈傷組織形成，3周后可見分化芽長出。待芽長到 Icm左右時，將其切下，并轉移到MS培養基1/2 (MS培養基補加0. lmg/L萘乙酸、300mg/L頭 孢霉素和200mg/L卡那霉素)上進行生根培養，約1-2周后生出不定根。等根系發達后，將 植株取出，用無菌水洗去附著的固體培養基，移入栽培土(北京凱茵有機肥有限責任公司) 中，在溫室(25°C，16小時 光照/8小時黑暗)中培養。實施例5 轉基因植物的草甘膦抗性測定法_葉片噴灑測定法溫室中栽培的轉基因煙草長到6-8片葉期時，噴灑草苷膦除草劑。本實驗所用 的草苷膦除草劑為Roundup，即41%草苷膦異丙胺鹽水劑(由美國孟山都公司贈送)。將 Roundup稀釋100倍，均勻噴灑于煙草葉片上(噴藥量為每公頃使用Roundup 3L左右)。此 后觀察煙草生長情況。1-3天后野生型對照植株(η = 5)表現出受害癥狀，莖尖和部分葉片開始萎蔫；之 后嚴重萎蔫并失去綠色，表現出枯黃，一周后全部死亡(見圖2)。經空載體ΡΒΙ121轉化的 空白對照植株的生長情況出與野生型對照植株類似。32株轉基因植株中有6株(編號為 2323-4，2323-5，2323-15，2323-16，2323-20，2323-23)正常生長，其余逐漸死亡。通過包含經過密碼子優化的pKU2323的農桿菌介導的轉化得到的轉基因植株為 2323系列；而通過包含未經密碼子優化的PKU2349的農桿菌介導的轉化得到的轉基因植株 為2349系列。實施例6 轉基因植物的PCR測定法、Southern印跡測定法和RT-PCR測定法1.煙草葉片基因組DNA的提取遵循Murray和Thompson (1980)修改而成的CTAB法自煙草葉片提取基因組DNA。 將植物材料在黑暗中放置24小時，以降低淀粉含量。剪取大約IOOmg葉片，置于研缽中。 倒入液氮，將葉片研成粉末。將葉片粉末轉移至1. 5ml離心管中，添加600ul含2%巰基乙 醇的CTAB提取緩沖液，混勻。將管在65°C水浴中溫育1-1. 5小時。待冷卻至室溫后，添加 600ul 24 1混合的氯仿異戊醇，混勻，直到葉片粉末由綠轉白。于室溫以13，OOOrpm離 心10分鐘，取出上層水相。將水相再用等體積的24 1混合的氯仿異戊醇抽提一次后， 以13，OOOrpm離心6分鐘。取出上層水相，添加2倍體積的無水乙醇以沉淀DNA。將DNA沉 淀物用70%乙醇洗滌，晾干。添加適量的含RNA酶的無菌去離子水以溶解DNA沉淀物。2. PCR 測定法根據密碼子優化后的EPSPS基因aroA的核苷酸序列(包括擬南芥EPSPS CTP的 核苷酸序歹Ij )設計了 5，端引物 3(5，-ATG GCG CAA GTT AGC AGA ATC-3，，SEQ ID NO 3) 和 3，端引物 4 (5，-TCA TGA GAA GTT GAA TTG ATG_3，，SEQ ID NO :4)。以如上制備的煙草 葉片基因組DNA為模板，用引物3和4實施PCR。PCR條件如下94°C預變性5分鐘；然后 是30個循環的94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、72°C 1. 5分鐘；最后是72°C再延伸10分鐘。通過 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。如圖3所示，6株耐受草苷膦的轉基因煙草(編號為2323-4、2323-5、2323-15、 2323-16、2323-20、和2323-23)都得到了長度約為1. 5kb的PCR擴增產物，表明轉基因構建 體ctp: :aroA已經整合到煙草基因組中。3. Southern 印跡測定法
取50ug PCR陽性轉基因煙草的基因組DNA，用限制性內切核酸酶EcoRI消化。將 酶切后的DNA進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，并通過毛細管法轉移到HyboncT-N+膜上。以 pKU2323 質粒 DNA 為模板，用引物 3 和引物 5 (5，-CAA ATG TGG AAG AAT TTC ATC-3，，SEQ ID NO 5)實施PCR，得到了 615bp的擴增產物，具體包括整個CTP和AroA前 130個氨基酸的編碼序列。使用高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒(DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I) (Roche)依照制造商的說明書給PCR產物標記上 地高辛，并依照常規方法于42°C進行雜交反應。如圖4所示，在耐受草苷膦的轉基因煙草中，目的基因在煙草基因組中只有一個 拷貝，而在WT對照煙草植株中未雜交到目的基因。4. RT-PCR 測定法
選取IOOmg新鮮葉片，使用RNApr印純植物總RNA提取試劑盒(Tiangen)依照制造 商的說明書提取RNA。使用M-MLV逆轉錄酶(Promega)依照制造商的說明書制備cDNA后， 用引物3和4實施PCR。PCR條件如下94°C預變性5分鐘；然后是30個循環的94°C 1分 鐘、55°C 1分鐘、72°C 1. 5分鐘；最后是72°C再延伸10分鐘。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢 測PCR產物。如圖5所示，6株耐受草苷膦的轉基因煙草(編號為2323-4、2323-5、2323-15、 2323-16、2323-20、和2323-23)都得到了長度約為1. 5kb的RT-PCR擴增產物，表明轉基因 在轉基因煙草中進行了有效地轉錄。如圖6所示，RT-PCR測定法還還表明，經過密碼子優化的轉基因顯著地提高了該 轉基因的mRNA在轉基因煙草中的穩定性。實施例7 轉基因植物的Western印跡測定法取IOOmg新鮮的煙草葉片，加入液氮充分研磨，將粉末轉移入2ml離心管。待液氮 完全揮發后，加入200ul蛋白質提取緩沖液(0. 25M Tris-HCl pH 6. 8，8%巰基乙醇，20%甘 油，8% SDS)，振蕩混勻后于100°C溫育8分鐘。將混合物以12000rpm離心15分鐘，取出上 清液，即為葉片蛋白質粗品。依照常規技術制備SDS-PAGE凝膠，其中上層濃縮膠濃度為5%，下層分離膠濃度 為16%。將蛋白質進行SDS-PAGE后，轉印跡至硝酸纖維素膜上。將膜與1 2000稀釋的家 兔抗EPSPS多克隆抗血清雜交。然后，將抗體_抗原復合物與1 3000稀釋的偶聯有辣根 過氧化物酶的山羊抗家兔IgG(Promega)反應以形成三元復合物。添加DAB溶液(PIERCE) 以顯色。如圖7所示，EPSPS蛋白的分子量為大約47kDa。在耐受草苷膦的轉基因煙草中檢 測到了 EPSPS蛋白。在不耐受草苷膦的轉基因煙草中，雖然通過PCR檢測到了 aroA基因的 存在，但是通過Western檢測不到EPSPS蛋白(結果未顯示)。實施例8 轉基因植物Tl代幼苗的草甘膦抗性測定法_種子萌發測定法為了檢測EPSPS基因aroA在傳代過程中的可遺傳性和穩定性，對TO代植株的種 子進行了種子萌發測定法，檢測Tl代幼苗對草苷膦的耐受性。如圖8所示，預實驗確定了使野生型煙草完全白化死亡的最低草苷膦濃度為 0. 5mM。將轉基因煙草TO代植株的種子表面滅菌(70%乙醇30秒，20%次氯酸鈉溶液30分 鐘，無菌水洗滌數次)，接種于含不同濃度(0、0. ImM和ImM)草苷膦(Sigma)的MS培養基上，于25°C在黑暗中培養3天以萌發，再轉為光照條件培養，3-4周后觀察幼苗生長情況。如圖9所示，當草苷膦濃度為ImM時，多數2323系轉基因煙草的種子很好地萌芽 和生長；而空載體對照煙草的種子萌芽但不能存活，慢慢白化死亡。當草苷膦濃度為OmM 時，2323系轉基因煙草和空載體對照煙草的種子均很好地萌芽和生長。如圖10所示，當草 苷膦濃度為IOmM時，Tl代幼苗仍能夠萌芽生長。另外，在含有草苷膦的平板上，耐受草苷膦的轉基因植株種子的萌發表現出兩種 情況除了多數種子能夠很好的萌發和生長；還有少數種子表現出類似空對照植株種子的 狀況，即能發芽但不能生長而是慢慢地白化死亡。表1是對6株耐受草苷膦的轉基因煙草 的種子萌芽和生長的數學統計結果。其中，同一植株的Tl幼苗對草苷膦表現出耐受性與敏 感性的比例接近3 1，符合孟德爾遺傳定律(Mendelian Law) 0表1 轉基因植株的Tl代幼苗對草苷膦的耐受性和敏感性
2323-15183632.9:10.009
2323-16 206603.4:10.159
2323-20 75253:10
2323-23198702.8:1_0.034對Tl代幼苗長成的植株如上所述進行了 PCR檢測。如圖10所示，PCR結果表明 對草苷膦耐受的幼苗中能檢測到目的片段的存在；對草苷膦敏感的幼苗中則未檢測到目的 片段的存在。序列表<110>北京大學<120>轉基因構建體和轉基因植物<160>10<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>1CAT GCC ATG GAA GTA ACA ATA CAG CCC GGA G<210>2
<211>32<212>DNA
<213>人工序列<220><223> 引物<400>2GTT ACT CGA GTG AGA AAT TAA ATT GAT GGT TT<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>3ATG GCG CAA GTT AGC AGA ATC<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>4TCA TGA GAA GTT GAA TTG ATG<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>5CAA ATG TGG AAG AAT TTC ATC<210>6<211>75<212>PRT<213> 擬南芥<220><223>擬南芥EPSPS葉綠體轉運肽的氨基酸序列<400>6MAQVSRICNG VQNPSLISNL SKSSQRKSPL SVSLKTQQHP RAYPISSSffG LKKSGMTLIG
SELRPLKVMS SVSTA<210>7<211>225<212>DNA<213> 擬南芥<220> <223>擬南芥EPSPS葉綠體轉運肽的核苷酸序列<400>7ATGGCGCAAG TTAGCAGAAT CTGCAATGGT GTGCAGAACC CATCTCTTAT CTCCAATCTCTCGAAATCCA GTCAACGCAA ATCTCCCTTA TCGGTTTCTC TGAAGACGCA GCAGCATCCACGAGCTTATC CGATTTCGTC GTCGTGGGGA TTGAAGAAGA GTGGGATGAC GTTAATTGGCTCTGAGCTTC GTCCTCTTAA GGTCATGTCT TCTGTTTCCA CGGCG<210>8<211>431<212>PRT<213>惡臭假單胞菌<220><223>惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA編碼的氨基酸序列<400>8EKVTIQP⑶L TGIIQSPASK SSMQRACAAA LVAKGISEII NPGHSNDDKA ARDIVSRLGARLEDQPDGSL QITSEGVKPV APFIDCGESG LSIRMFTPIV ALSKEEVTIK GSGSLVTRPMDFFDEILPHL GVKVKSNQGK LPLVIQGPLK PADVTVDGSL SSQFLTGLLL AYAAADASDVAIKVTNLKSR PYIDLTLDVM KRFGLKTPEN RNYEEFYFKA GNVYDETKMQ RYTVEGDffSGGAFLLVAGAI AGPITVRGLD IASTQADKAI VQALMSANAG IAIDAKEIKL HPADLNAFEFDATDCPDLFP PLVALASYCK GETKIKGVSR LAHKESDRGL TLQDEFGKMG VEIHLE⑶LMRVIGGKGVKG AEVSSRHDHR IAMACAVAAL KAVGETTIEH AEAVNKSYPD FYSDLKQLGGVVSLNHQFNF S<210>9<211>1293<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220><223>惡臭假單胞菌EPSPS基因aroA的野生型核苷酸序列<400>9ATGCAAGTAA CAATACAGCC CGGAGATCTG ACTGGAATTA TCCAGTCACC CGCTTCAAAAAGTTCGATGC AGCGAGCTTG TGCTGCTGCA CTGGTTGCAA AAGGAATAAG TGAGATCATTAATCCCGGTC ATAGCAATGA TGATAAAGCT GCCAGGGATA TTGTAAGCCG GCTTGGTGCCAGGCTTGAAG ATCAGCCTGA TGGTTCTTTG CAGATAACAA GTGAAGGCGT AAAACCTGTCGCTCCTTTTA TTGACTGCGG TGAATCTGGT TTAAGTATCC GGATGTTTAC TCCGATTGTT
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權利要求
一種分離的多核苷酸，其以從5’到3’的方向包含編碼CTP的核苷酸序列和編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列，其中所述編碼CTP的核苷酸序列是編碼擬南芥EPSPS CTP的核苷酸序列，且所述編碼草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列是編碼惡臭假單胞菌EPSPS的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的多核苷酸，其中所述編碼惡臭假單胞菌EPSPS的核苷酸序列是經 過密碼子優化的編碼惡臭假單胞菌EPSPS的核苷酸序列。
3.—種核酸構建體，其包含權利要求1或2所述分離的多核苷酸。
4.一種重組載體，其包含權利要求1或2所述分離的多核苷酸，或包含權利要求2所述 的核酸構建體。
5.一種重組宿主細胞，其包含權利要求1或2所述分離的多核苷酸，或包含權利要求3 所述的核酸構建體，或包含權利要求4所述的重組載體。
6.一種轉基因植物細胞和轉基因植物，其包含權利要求1或2所述分離的多核苷酸，或 包含權利要求3所述的核酸構建體，其包含權利要求4所述的重組載體、或包含權利要求5 所述的重組宿主細胞。
7.制備權利要求6所述轉基因植物細胞和轉基因植物的方法，其包括將權利要求1或 2所述分離的多核苷酸、權利要求3所述的核酸構建體、權利要求4所述的重組載體、或權利 要求5所述的重組宿主細胞導入植物細胞的步驟。
8.賦予植物細胞或植物以草苷膦耐受性的方法，其包括將權利要求1或2所述分離的 多核苷酸、權利要求3所述的核酸構建體、權利要求4所述的重組載體、或權利要求5所述 的重組宿主細胞導入植物細胞的步驟。
9.一種融合蛋白，其以從N端到C端的方向包含CTP和草苷膦耐受型EPSPS，其中所述 CTP是擬南芥EPSPS CTP，且所述草苷膦耐受型EPSPS是惡臭假單胞菌EPSPS。
全文摘要
本發明涉及轉基因構建體和轉基因植物。所述轉基因構建體用于在植物中表達草苷膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，所得轉基因植物表現出草苷膦耐受性。
文檔編號C12R1/01GK101886088SQ200910139099
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月15日 優先權日2009年5月15日
發明者嚴海芹, 孫義成, 李燕, 王憶平 申請人:北京大學