專利名稱：一種低分子量ec-sod重組酶及其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學與生物化學領域，具體地說是涉及利用 DNA重組技術，構建一種低分子量EC-SOD重組酶基因并與合適的表 達載體體外重組，以及該重組質粒的轉化，目的蛋白的表達純化及其 應用。
背景技術：
人細胞外超氧化物歧化酶EC-SOD: EC 1.15丄1是一種分泌型糖 蛋白，分子量為135KD，由四個相同亞基組成，每個亞基含有一個Cu 原子和一個Zn原子。人EC-SOD基因定位于第4染色體上4^q21 ， 含有兩個內含子和三個外顯子，其編碼基因全部位于第三外顯子內。 于1987年得到其cDNA，共編碼240個氨基酸，包括18個氨基酸的信 號肽和222個氨基酸的成熟蛋白。在人體中主要分布在各組織的組織 外基質和細胞表面上，同時還存在于血漿，淋巴液和腦脊液中。它的 主要生物學作用是清除氧自由基02'-，生成h202和02。通過對ec-SOD
轉基因小鼠的研究發現，EC-SOD可以顯著降低高血壓，動脈硬化和冠 心病等心腦血管疾病的發病率，在預防老年癡呆癥，關節炎等疾病方 面也有明顯效果，還可以減緩器官老化和機體衰老。
由于EC-SOD的重要生理功能，其在人體中的生理意義和在醫藥 中的應用受到人們的重視，并且有可能成為預防和治療多種人類疾病的新型藥物，還有可能成為減緩人類衰老，提高人類生活質量的特效
藥物。但是野生型EC-SOD在人體內含量較低，無法利用分離提純的 方法大量制得；用動物來源提取的SOD則易造成人體免疫排斥反應。 因此有研究者利用基因工程表達EC-SOD。 1987年，Tibell等人在動物 細胞內表達EC-SOD，但是其產量過低，成本太高，只適合于研究使用。 其后，又有研究者在原核細胞中對其進行表達，但是EC-SOD本身分 子量較大，易形成包涵體；且由于原核細胞無法進行翻譯后修飾，失 去糖基的蛋白溶解性極差，因此無法進行大規模生產。2006年，研究 者將其轉入畢赤酵母中進行表達，但是其存在成本高，生產周期過長 等缺點，不利于大規模生產應用。
1999年，Stenlund和Tibell對EC-SOD進行了改造重組，將EC-SOD 的7V-末端與C-末端連接在了人銅鋅超氧化物歧化酶CuZnSOD的兩端， 并在原核細胞中獲得表達。但是其重組蛋白的分子量過大，不利于臨 床的應用。
相關的文獻表明，對于EC-SOD的表達應用，國外多采用在真核 細胞的表達，雖然可以保證EC-SOD的結構與翻譯后的修飾，但是其 生產成本高，生產周期長，只限于在實驗室內研究使用，不適于大規 模的生產制備；國內的研究則多集中于原核細胞的表達及其表達后包 涵體變性復性，其成本高，且無法進行大規模穩定生產。
研究表明，EC-SOD分子量過大的主要原因是由于其形成四聚體， 并且在Asn89位還會形成糖基化。對其一級結構進行分析發現，TV-末 端結構域是其形成四聚體的主要因素。
發明內容
本發明提供一種低分子量EC-SOD重組酶及其制備方法及其用途， 以解決野生型EC-SOD在其宿主菌中的表達純化困難、制備成本高、 生產周期長、不適合大規模生產應用的問題。本發明采取的技術方案 是包括EC-SOD活性中心和C-端結構域，核苷酸序列為SEQIDNO: 1所述。
本發明低分子量EC-SOD重組酶基因的制備方法，包括下列步驟 (一)全基因的獲得 (1).引物設計
Primer I 5 ， -GGAATTCCATATGTCCAGCCGCGCC-3 ，其中劃線部
分為7WM的酶切位點；
Primer III 5 ，-CACGCCCACCACGCCGCAGGCCAG-3 ，其中劃線部 分為Cys---Gly的突變位點；
Primer II 5，- ATTGGATCCTTAGGCGGCCTTCTTCTCGCTC-3， 其中劃單線部分為^^HI的酶切位點，劃雙線部分為Cys…Lys的突變 位點；
Primer W 5，- GTGGTGGGCGTGTCCGGGCCCGG-3，其中劃線部 分為195 Cy s---Ser的突變位點； (2).片段A的制備
以EC-SOD基因(GenBank NCBI， GI: 6649)為模板，利用引物 Primer I禾口 Primer III釣取片斷A，擴增條件為94。C變性lmin， 50 。C退火30sec， 72。C延伸lmin，循環30次；(3) .片段B的制備
以EC-SOD基因為模板，利用引物Primer II和Primer IV釣取片斷 B，擴增條件為94。C變性lmin， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin，循 環30次；
(4) .制備全長重組EC-SOD基因 將前面所獲得大片段A和小片段B分別稀釋150倍和200倍，用
作PCR的模板，利用引物Primer I和Primer II進行PCR反應得到全 長的重組EC-SOD基因；
(二)重組質粒的構建，轉化
(1) 重組酶的全長基因經用AWel和B"mffl雙酶切后，酶切產物 經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA回收試劑盒回收目的基因，溶 于10nl的TE中；
(2) 提取質粒pET-28a(+)，經進一步純化后，產物用SawHI和 AWeI雙酶切，經純化后，溶于30)il的TE中；
(3) 目的基因與pET-28a(+)連接，連接產物轉化至 BL21(DE3)中，涂布于含有100嗎/ml AmpicillinLB平板上，37。C培養 過夜；
(4) 次日，挑取單菌落，接種于3ml含5(^g/ml氨芐青霉素的LB 培養基中，37。C培養過夜；提質粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小； 選取大于pET-28a(+)的重組質粒，并以^W2HI和MM雙酶切鑒定，電 泳檢測；
(5) 挑取陽性克隆菌落，接種于1L含有50嗎/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37。C培養至OD6(M)=0.4-0.6，每升菌液中加入濃度為0.8MIPTG 500^1, 0.3mol/L CuS04和0.03mol/L ZnS04 lOOjal， 37°C ， 170rpm，誘導表達四個小時后，收集菌體；
(6)將誘導后的菌體破碎后，經Ni柱層析，肝素親和層析和離子交換層析純化。
本發明目的基因與pET-28a(+)連接，連接產物轉化還可在酵母細胞或真核細胞中表達。
本發明所述低分子量EC-SOD重組酶在制備清除自由基的藥物中的應用。
本發明將EC-SOD的iV-末端和糖基化位點刪除，既能保有其清除自由基的功能，還使其僅能形成單體，同時減少了分子量，這都有利于其在宿主菌中的表達及純化。
本發明的意義在于能夠提供一種高活性，低成本，生產周期短的低分子量EC-SOD重組酶的制備方法。本發明以人源EC-SOD為原料，采用基因工程技術，獲得低分子量EC-SOD的活性中心基因，并將其連入表達載體，并在原核細胞中獲得表達。該重組酶分子量小，可以有效清除自由基，并可以在心腦血管疾病和抗衰老等方面獲得應用；同時其制備成本低廉，生產周期短，適合于大規模生產應用。
圖1是本發明制備工藝流程圖。
圖2、低分子量EC-SOD重組酶基因的瓊脂糖電泳圖譜，圖中1.0%瓊脂糖電泳，樣品自左到右為Marker: DL2000; Lane 1, 2: 箭頭所示處為雙酶切后純化的低分子量EC-SOD重組酶基因。
圖3、低分子量EC-SOD重組酶的SDS-PAGE電泳圖譜，圖中12%分離膠，5%濃縮膠，考馬斯亮藍染色，樣品從左至右為Marker: Unstained Protein Molecular Weight Marker;箭頭所示為低分子量EC-SOD重組酶。
圖4、低分子量EC-SOD重組酶的活性電泳圖譜，圖中亮帶為SOD的活性條帶。
具體實施例方式
本發明實施例1和2所涉及到的試劑及材料
試齊U:異丙基硫代^-D-半乳糖苷(IPTG)、十二垸基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、Tris-HCl、 N,N，N，,N，-四甲基二乙胺(TEMED)，過硫酸銨，氯化硝基四氮唑藍(NBT)，核黃素購自上海生工公司；胰化蛋白胨、酵母提取物(購自英國OXOID公司)；瓊脂糖(Agarose)購自Genetech公司；ATP購自Promega公司。
酶試劑本實驗所用的限制性內切酶5amHI、 AWeI、 T4DNA連接酶、T^DNA聚合酶等購于寶生物工程(大連)有限公司。
Marker: Unstained Protein Molecular Weight Marker,購自 Fementas公司；DL2000DNAMarker購于寶生物工程(大連)有限公司。
抗生素卡那霉素，氨芐青霉素均購于上海生工生物技術服務有限公司。
質粒pET28a(+) Novagen公司。菌株￡.co"BL21 (DE3) Novagen公司。
10其它所用化學試劑均為分析純。本發明實施例所使用到的儀器
1. 低溫層析柜(瑞典LKB)
2. 加熱磁力攪拌器(德國IKA)
3. PCR儀(英國TECHNE)
4. HX-1050恒溫循環器(北京博醫康技術公司)
5. BDS1電熱三用水箱(北京市醫療設備廠)
6. 動感豪華陳列展示柜(4'C)(白雪電器)
7. JYT-5架盤藥物天平(上海醫用激光儀器廠)
8. Sartorius電子天平(德國賽多利斯儀器系統有限公司)
9. TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)
10. 新飛冰箱(中國河南新鄉)
11. HimacCR21G高速離心機(日本日立)
12. Model J2-21M高速離心機(美國BECKMAN)
13. UV-1700紫外分光光度計(日本島津)
14. UV-2550紫外分光光度計(日本島津)
15. GL-21M高速冷凍離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)
16. PB-10普及型PH計(德國賽多利斯儀器系統有限公司)
17. 超凈工作臺(杭州恒宇凈化設備廠)
18. 恒溫搖床(美國Fo薩Scientific)
19. 超低溫冰箱(美國NUAIRE )
20. DYY-4C型電泳儀(北京六一儀器廠)21. DYCP31D型電泳槽(北京六一儀器廠)
22. DHP060恒溫培養箱(上海實驗儀器廠)
23. 電子分析天平(杭州博日科技有限公司)
24. RVC2-18真空旋轉蒸發儀(德國賽多利斯儀器系統有限公司)
25. sim-F24制冰機(日本SANYO)
26. 超聲破碎儀(美國Cole Parmer)
27. 恒溫、低溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)
實施例l:低分子量EC-SOD重組酶的全基因的獲得
參見圖h本實施例中所涉及的分子生物學實驗操作均參照《分子克隆實驗指南》第三版[美]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著。科學出版社出版。(1).引物設計
Primer I 5 ， -GGAATTCCATATGTCCAGCCGCGCC-3,其中戈機部分為A^M的酶切位點。
Primer III 5 ， -CACGCCCACCACGCCGCAGGCCAG-3 ，其中劃線部分為Cys---Gly的突變位點。
Primer II 5，- ATTGGATCCTTAGGCGGCCTTCTTCTCGCTC-3，其中劃單線部分為^^HI的酶切位點，劃雙線部分為Cys…Lys的突變位點。
Primer IV 5，- GTGGTGGGCGTGTCCGGGCCCGG-3，其中劃線部分為195Cys--Ser的突變位點。
12(2) .片段A的制備
以EC-SOD基因(GenBank NCBI, GI: 6649)為模板，利用引物Primer I和Primer III釣取片斷A，擴增條件為94。C變性lmin， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin，循環30次。
(3) .片段B的制備
以EC-SOD基因為模板，利用引物Primer II和Primer IV釣取片斷B，擴增條件為94。C變性lmin， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin，循環30次。
(4) .全長重組EC-SOD基因的制備
將前面所獲得大片段A和小片段B分別稀釋150倍和200倍，用作PCR的模板，利用引物Primer I和Primer II進行PCR反應得到全長的重組SOD基因。并利用1.0%瓊脂糖電泳驗證全長基因大小，結果見附圖2。
實施例2:重組質粒的構建，轉化及檢驗
本實施例中所涉及的質粒提取、酶切、連接、感受態細胞的制備和轉化等分子生物學實驗操作均參照《分子克隆實驗指南》第三版[美]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著。科學出版社出版。
(1) 重組酶的全長基因經用MfeI和SamHI雙酶切后，酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA回收試劑盒回收目的基因，溶于10pl的TE中。
(2) 提取質粒pET-28a(+)，經進一步純化后，產物用BawHI和Mfel雙酶切，經純化后，溶于30(il的TE中。(3) 目的基因與pET-28a(+)連接。連接產物轉化至 BL21(DE3)中，涂布于含有100pg/ml AmpicillinLB平板上，37。C培養 過夜。
(4) 次日，挑取單菌落，接種于3ml含50pg/ml氨芐青霉素的LB 培養基中，37。C培養過夜。提質粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小。 選取大于pET-28a(+)的重組質粒，并以^^HI和M/el雙酶切鑒定，電 泳檢測。可見經雙酶切后，成為兩個片斷，分子量與理論設計相符， 委托上海生工生物技術服務有限公司測定重組EC-SOD全基因DNA序 列，結果正確。
(5) 挑取陽性克隆菌落，接種于1L含有50|ig/ml氨芐青霉素的 LB培養基中，37。C培養至OD6。。=0.4-0.6，每升菌液中加入濃度為0.8M IPTG 50(^1， O.3mol/L CuS04和0.03mol/L ZnS04 lOOjil， 37°C ， 170rpm， 誘導表達四個小時后，收集菌體。
(6) 將誘導后的菌體破碎后，經Ni柱層析，肝素親和層析和離 子交換層析純化，得到的樣品經SDS-PAGE檢驗，分子量為16.7KDa 與理論設計分子量相同，見附圖3。
實施例3:本發明重組酶清除自由基活性的檢驗
原理核黃素在有氧條件下能產生超氧自由基負離子02"—，當加 入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應還原生成甲臜，它是一 種藍紫色物質，在560nm波長下有最大吸收。當加入SOD時，可以使 超氧自由基與If結合生成H202和02，從而抑制了 NBT光還原的進行。 1.試劑1) 洗脫液A:異丙醇醋酸水=5:12:13，取15mL異丙醇加 入36mL冰醋酸，加入ddH20定溶至90mL。
2) 洗脫液B:取25mL異丙醇，加入ddH20定溶至100mL。
3) 溶液A:稱取O.lgNBT定溶于lOOmL的ddH20中。
4) 溶液B:稱取0.325g的TEMED和lOmg的核黃素定溶于 100mL的pH7.8， 50mM的磷酸鉀緩沖液中。此試劑須現用現配。
5) 溶液C: pH7.8， 50mM的磷酸鉀緩沖液。
2.操作將樣品加入Loading Buffer后，不經煮沸，直接進行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后，
1) 脫SDS:用洗脫液A洗凝膠四次，每次5分鐘，輕微振蕩， 然后用洗脫液B洗一次，5分鐘，輕微振蕩；
2) 將凝膠浸泡在溶液A中，避光放置15-20min;
3) 取出凝膠，用ddH20沖洗干凈，放入含有溶液B中，避光靜 置15-20min;
4) 將凝膠轉移至含有溶液C中，光照30 40min，觀察活性亮 帶出現。
結果顯示，重組酶具有清除自由基的活性，見附圖4。
15序列表
<110>吉林大學
<120> —種低分子量EC-SOD重組酶及其制備方法及其用途 <130>幾UWXP200卯1 <160> 1
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> human
<400> 1
atgtccagcc gcgccatcca cgtgcaccag ttcggggacc tgagccaggg ctgcgagtcc 60
accgggcccc actacaaccc gctggccgtg ccgcacccgc agcacccggg cgacttcggc 120
aacttcgcgg tccgcgacgg cagcctctgg aggtaccgcg ccggcctggc cgcctcgctc 180
gcgggcccgc actccatcgt gggccgggcc gtggtcgtcc acgctggcga ggacgacctg 240
ggccgcggcg gcaaccaggc cagcgtggag aacgggaacg cgggccggcg gctggcctgc 300 ggcgtggtgg gcgtgtccgg gcccgggctc tgggagcgcc aggcgcggga gcactcagag 360 cgcaagaagc ggcggcgcga gagcgagaag aaggccgcct aa 40權利要求
1、一種低分子量EC-SOD重組酶，其特征在于，包括EC-SOD活性中心和C-端結構域，核苷酸序列為SEQ ID NO1所述。
2、 一種如權利要求1所述低分子量EC-SOD重組酶基因的制備方法包括下列步驟(一)全基因的獲得 (1).引物設計Primer I 5'-GGAATTCCATATGTCCAGCCGCGCC-3，其中劃線部分為MM的酶切位點；Primer III 5 ，-CACGCCCACCACGCCGCAGGCCAG-3 ，其中劃線部 分為Cys---Gly的突變位點；Primer II 5，- ATTGGATCCTTAGGCGGCCTTCTTCTCGCTC-3， 其中劃單線部分為5awHI的酶切位點，劃雙線部分為Cys---Lys的突變 位點；Primer IV 5，- GTGGTGGGCGTGTCCGGGCCCGG-3 ，其中劃線部 分為195Cys--Ser的突變位點；(2) .片段A的制備以EC-SOD基因(GenBank NCBI, GI: 6649)為模板，利用引物 Primer I和Primer III釣取片斷A，擴增條件為94。C變性lmin， 50 。C退火30sec， 72。C延伸lmin，循環30次；(3) .片段B的制備以EC-SOD基因為模板，利用引物PrimerII和Primer IV釣取片斷B，擴增條件為94"C變性lmin， 50。C退火30sec， 72。C延伸lmin，循 環30次；(4) .制備全長重組EC-SOD基因 將前面所獲得大片段A和小片段B分別稀釋150倍和200倍，用作PCR的模板，利用引物Primer I和Primer II進行PCR反應得到全 長的重組EC-SOD基因；(二)重組質粒的構建，轉化(1) 重組酶的全長基因經用A^el和SflwHI雙酶切后，酶切產物 經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA回收試劑盒回收目的基因，溶于10|ll的TE中；(2) 提取質粒pET-28a(+)，經進一步純化后，產物用SflmHI和 AWeI雙酶切，經純化后，溶于30iil的TE中；(3) 目的基因與pET-28a(+)連接，連接產物轉化至Eco// BL21(DE3)中，涂布于含有100嗎/ml AmpicillinLB平板上，37。C培養 過夜；(4) 次日，挑取單菌落，接種于3ml含50pg/ml氨芐青霉素的LB 培養基中，37'C培養過夜；提質粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小； 選取大于pET-28a(+)的重組質粒，并以&mHI和A^I雙酶切鑒定，電 泳檢測；；(5) 挑取陽性克隆菌落，接種于1L含有50嗎/ml氨芐青霉素的 LB培養基中，37'C培養至OD6Q()=0.4-0.6，每升菌液中加入濃度為0.8M IPTG 500jal， 0.3mol/L CuS04和0.03mol/L ZnS04 100^1， 37°C ， 170rpm，誘導表達四個小時后，收集菌體；(6)將誘導后的菌體破碎后，經Ni柱層析，肝素親和層析和離 子交換層析純化。
3、 一種如權利要求1所述低分子量EC-SOD重組酶基因的制備 方法其特征在于目的基因與pET-28a(+)連接，連接產物還可轉化入 酵母細胞或真核細胞中并獲得表達。
4、 如權利要求1所述的低分子量EC-SOD重組酶在制備清除自 由基的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種低分子量EC-SOD重組酶及其制備方法及其用途，屬于分子生物學與生物化學領域。包括EC-SOD活性中心和C-端結構域，核苷酸序列為SEQ ID NO1所述。本發明在制備清除自由基的藥物中的應用。優點在于能夠提供一種高活性，低成本，生產周期短的低分子量EC-SOD重組酶的制備方法。本發明以人源EC-SOD為原料，采用基因工程技術，獲得低分子量EC-SOD的活性中心基因，并將其連入表達載體，并在原核細胞中獲得表達。該重組酶分子量小，可以有效清除自由基，并可以在心腦血管疾病和抗衰老等方面獲得應用；同時其制備成本低廉，生產周期短，適合于大規模生產應用。
文檔編號C12N9/02GK101643722SQ20091013887
公開日2010年2月10日 申請日期2009年5月15日 優先權日2009年5月15日
發明者曉 宋, 偉 張, 曲和之, 朔 楊, 智 柴, 王曉平, 郝東云 申請人:吉林大學