基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

專利名稱：：基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：目前對單核增生李斯特菌有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒定、形態學鑒定和自動生化鑒定為主的國家標準(GB/T4789.7_2003)，到特異蛋白的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應(PCR)技術等分子生物學檢測方法[食品安全檢測與現代生物技術，化學工業出版社，2004年]。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術試圖突破傳統的形態學、生化反應等微生物學檢測舊模式，不需要對微生物進行分離提純，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產物進行快速檢測，并且與分子生物學技術及生物信息學手段相結合，向準確、快速、靈敏和自動化的方向發展。以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實際應用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(realtimePCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此不適用于現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的成本較髙，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫擴增(IsothermalAmplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術(LAMP)具有很多的優越性，且目前也未見有用環介導等溫擴增技術檢測單核增生李斯特的基因快速診斷試劑盒。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測成本低、使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒，該試劑盒是基于環介導等溫擴增技術來檢測單核增生李斯特菌的。本發明的另一個目的是提供上述單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒的檢測方法。本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的一、本發明的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、BWDNA聚合酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上六種液體分別置于容器中，其中所述兩對引物為外引物F3:ACAAGACTTCACCAATCCA，如SEQIDNO:l所示；外引物B3:GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT，如SEQIDNO:2所示；內弓I物FIP:TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG，如SEQIDNO:3所示；內引物BIP:CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG，如SEQIDNO:4所示；上述反應液含有1.62mmol/LdNTP、2025mmol/LTris-HCl、1012.5mmol/L氯化鉀、1012.5mmol/L硫酸銨、810mmol/L硫酸鎂、0.10.125%TritonX-100、0.8lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.62mol/L和外引物F3/B3各0.20.25mol/L。優選的比例是反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。(0.10.125^TritonX-100是TritonX-100占反應液的體積百分比為0.10.125%)上述樣品預處理液含有1020mmol/LpHS.O的Tris-HC1、12mmol/LEDTA和11.2%TritonX-100。優選的比例是樣品預處理液含有20mmol/LpH8.0的Tris-HC1、2mmol/LEDTA和1.20/。TritonX畫100。(11.2%TritonX-100是TritonX-100占樣品預處理液的體積百分比為11.2%)上述陽性對照為單核增生李斯特菌基因組DNA。上述顯色液優選為SYBRGreenI。上述穩定液優選為石蠟油。二、本發明基因快速診斷試劑盒的生產工藝1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質檢；2、將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；3、將穩定液無菌分裝，抽樣質檢；4、將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；5、組裝試劑盒。三、本發明基因快速診斷試劑盒的檢測方法1、樣品處理將待測樣品于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為待用的樣品模板DNA;2、環介導等溫擴增技術反應過程在反應管中加入反應液3840體積％、BstDNA聚合酶0.91.8體積％、穩定液5254.5體積％、樣品模板DNA4.59體積％，6365。C恒溫反應4590min。所述體積百分比是指占四個組分總體積的體積百分比。3、反應后處理在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。本發明所說的基于環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisotherma1amplicationofDNA,簡稱LAMP)快速檢測單核增生李斯特菌的方法，是利用DNA聚合酶和根據耙基因序列設計的兩對特殊的內、外引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg^結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恒溫(6365°C)條件下4590分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增技術與PCR技術(包括熒光實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優于PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術。國內目前尚未有這方面的試劑盒出售。目前國家標準中以微生物分離培養和形態學鑒定為主、結合生化分析和血清學分型鑒定的通行方法，初步鑒定需23天，完成鑒定報告需1015天；采用本發明的基因快速診斷試劑盒僅需2小時。并且，本發明的反應液中加入了顯色液，鑒定結果更為直觀清晰。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果l.本發明的基因快速診斷試劑盒只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；2.本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷耙標物質的存在與否，因此具有高特異性；3.本發明的基因快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到l小時即可完成擴增，且產率高；4.本發明的基因快速診斷試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg^結合，產生副產物一焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。圖1為細菌及細菌DNA混合液LAMP結果圖1中，l為陽性對照；2為陰性對照；3-9分別為英諾克李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌、威爾斯李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157、金黃色葡萄球菌；10-30為21例單增李斯特菌;31為細菌DNA混合液。圖2為單增李斯特氏菌不同稀釋濃度LAMP檢測結果；圖2中，l為細菌原液；2-ll分別為10、10^稀釋倍數；12為陽性對照；13為陰性對照。圖3為單增李斯特氏菌不同稀釋濃度LAMP檢測結果；圖3中，M為Marker;1為陽性對照；2為陰性對照；3為細菌原液，4-13分別為10'-l(^稀釋倍數。具體實施例方式實施例l試劑盒的制備(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:ACAAGACTTCACCAATCCA，如SEQIDNO:l所示；外引物B3:GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT，如SEQIDNO:2所示；內引物FIP:TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG，如SEQIDNO:3所示；內引物BIP:CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG，如SEQIDNO:4所示；(2)購置DNA聚合酶BWDNA聚合酶置于容器。(3)配制反應液反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125體積XTritonX-100、lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。(4)配制樣品預處理液樣品預處理液含有20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA禾口1.2體積0/0TritonX畫100，置于容器。(5)購置穩定液石蠟油，置于容器。(6)購置顯色液SYBRGreenI，置于容器。(7)提取陽性對照單核增生李斯特菌基因組DNA，置于容器。(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質檢；2、將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；3、將穩定液分裝，抽樣質檢；4、將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；5、組裝試劑盒。實施例2試劑盒的制備反應液的配方為反應液含有1.8mmol/LdNTP、20mmol/LTris-Cl、10mmol/L氯化鉀、10mmol/L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0.1體積^TritonX-100、0.8mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6mol/L和外引物F3/B3各0.2mol/L。樣品預處理液的配方為樣品預處理液含有10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、lmmol/LEDTA和1體積。/oTritonX-100。其他同實施例1。實施例3單增李斯特菌基因快速診斷試劑盒的應用1材料與方法1.1材料1.1.1菌株ii本公司用菌株有28株，主要來源于美國標準生物品收藏中心、臨床分離菌株和環境分離菌株。詳見表l。表1菌株名稱及來源<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>l丄2主要儀器和試劑1.2分離菌株的鑒定1.2.1單增李斯特菌的培養單增李斯特菌穿刺培養的菌種用營養肉湯復蘇，30°C，培養24-48小時。于普通營養瓊脂平板3(TC培養24-48小時分離出單菌落。1.2.2臨床分離株的分離鑒定臨床分離株增菌后，于牛津平板上分離出單菌落，接種于三糖鐵(TSI)斜面培養基觀察是否產酸、產氣和產硫化氫等項目，同時接種于硫化氫-靛基質-動力(SIM)瓊脂試驗，培養于25°C，觀察是否有動力且成傘形狀或月牙狀生長。挑可疑單菌落作革蘭氏染色，采用廣東環凱微生物科技有限公司的單核增生性李斯特菌生化鑒定盒進行生化確認。1.3樣品處理(模板DNA提取)1.3.1取lmL液體培養的菌液樣品，10000rpm離心2分鐘，獲得菌體沉淀；1.3.2在上述菌體沉淀中加入100^iL樣品預處理液混合均勻，沸水中煮20分鐘后立即置于冰上冷卻IO分鐘，10000rpm離心2分鐘，上清即為樣品模板DNA。1.4環介導等溫擴增技術的反應過程1.4.1在200^L反應管配制反應體系反應液22(iL，SwDNA聚合酶0.5iiL(4U)，穩定液30iiL，模板DNA2.5pL。1.4.2將配制好的反應管于65X:恒溫反應1小時。1.5反應后處理向上述反應產物中加入2iiLSYBRGreenI，混勻，同時也向陽性對照管(單增李斯特氏菌基因組DNA)和陰性對照管(去離子水)中加入SYBRGreenI混勻，若反應管與陽性對照管一樣顯現綠色則為陽性，若反應管與陰性對照管一樣顯現橙色則為陰性。1.6電泳配制0.2%瓊脂糖凝膠電泳。以SYBRGreenI作為染料進行顯色反應觀察結果。1.7特異度試驗1.7.1純菌株LAMP檢測用LAMP方法對28株細菌進行擴增，根據顯色反應觀察結果，綠色為陽性，橙色陰性，驗證方法特異性。1.7.2幾種菌株混合DNA檢測用LAMP對單增李斯特氏菌及沙門氏、大腸桿菌0157、金黃色葡萄球菌的DNA等體積混合液取2ul作LAMP檢測。1.8靈敏度試驗將單增李斯特氏菌(7466)于普通營養瓊脂平板上純培養24-48小時后，挑兩滿環菌落混懸于5mL無菌生理鹽水中，用生理鹽水10倍倍比稀釋至10—1()。選擇適宜的3個濃度級取lOOul平鋪于普通營養瓊脂平板上，分別作3個平板，3(TC培養48h，取菌落數在30300之間的平板作平板計數，該濃度級的3個平板的菌落數的均數推算細菌濃度，為菌落平均數x稀釋倍數xlO;同時，各濃度級取lmL，提取DNA，作LAMP檢測。1.9重復性試驗特異度試驗和靈敏度試驗分別重復2次。2結果2.1單增李斯特氏菌LAMP檢測方法的建立2.2特異度試驗單增李斯特氏菌(7466)檢測結果陽性，7株非單增李斯特氏菌均陰性，單增李斯特氏菌及沙門氏菌、大腸桿菌0157、金黃色葡萄球菌4種細菌DNA混合液為陽性，如圖l。結果顯示試劑盒具有高特異性。2.3靈敏度試驗經菌落平板計數，選擇第6個稀釋度進行讀數，平均菌落數為181cfii，推算細菌原液濃度為1.81xl08cfu/mL，LAMP方法可檢測到第5個稀釋度，為1.81xl03cf\i/mL。如圖2。2.4電泳觀察對上述LAMP產物進行電泳觀察，產物梯狀條帶清晰，符合正常擴增的條帶模式，如圖3所示。2.5重復性試驗特異度試驗重復兩次，結果一致。靈敏度試驗重復兩次，數量級一致。<110>廣州華峰生物科技有限公司〈120〉基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基閑快速診斷試劑盒及其檢測方法<130><160>4<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>19<212〉DNA<213>人工序列<400〉1外引物F3:ACAAGACTTCACCAATCCA<210>2<211>23〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>2外引物B3:GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT〈210〉3<211〉47<212>DNA<213>人工序列〈400>3內引物FIP:TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG<210〉4<211〉47<212>DNA<213〉人工序列<400〉4內引物BIP:CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG1權利要求1、一種單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對引物、BstDNA聚合酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上七種液體分別置于容器中，上述兩對引物為外引物F3ACAAGACTTCACCAATCCA；外引物B3GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT；內引物FIPTAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG；內引物BIPCCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG；上述反應液含有1.6～2mmol/LdNTP、20～25mmol/LTris-Cl、10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；上述樣品預處理液含有10～20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2％TritonX-100；上述陽性對照為單核增生李斯特菌基因組DNA。2、根據權利要求l所述試劑盒，其特征在于所述顯色液為SYBRGreenL3、根據權利要求l所述試劑盒，其特征在于所述樣品預處理液含有20mmol/LpH8.0的Tris畫HC1、2mmol/LEDTA和1.20/。TritonX-IOO。4、根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。5、一種檢測單核增生李斯特菌的方法，其特征是使用權利要求l所述試劑盒，按下列步驟進行(1)將待測樣品于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為待用的樣品模板DNA;(2)在反應管中加入反應液3840體積％、BstDNA聚合酶0.91.8體積％、穩定液5254.5體積％、樣品模板DNA4.59體積％，恒溫反應；(3)在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。6、根據權利要求5所述檢測方法，其特征在于步驟(2)中，恒溫反應的反應條件為溫度6365。C，反應時間45卯min。7、根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于所述穩定液為石蠟油。全文摘要本發明提供一種基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法，該試劑盒由兩對引物、DNA聚合酶、反應液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上六種液體分別置于容器中。本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性。本發明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備。本發明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg²⁺結合，產生副產物—焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，更加明顯可靠。文檔編號C12R1/01GK101555529SQ200910138319公開日2009年10月14日申請日期2009年4月28日優先權日2008年4月29日發明者曹以誠,李心暉,李志勇,杜正平,柯昌文,王志強,譚慧媚,鄧小玲,洵陳,高東微申請人:廣州華峰生物科技有限公司