一種適合工業化生產雙歧桿菌的培養基及其配制方法

專利名稱：一種適合工業化生產雙歧桿菌的培養基及其配制方法
技術領域：
本發明涉及一種雙歧桿菌的培養基及其制備方法，特別涉及一種適合工業化的雙l技桿菌培養基。。
背景技術：
雙歧桿菌(Bifidobactemim)是人畜等溫rflL動物腸道內重要的生理性細菌之一，是人體健康的重要指 標菌之一，它在腸道菌群中所占比例直接影響著宿主的健康狀況，與其它正常菌群一起構成了阻止外來菌 入侵的定植阻力，具有一定的生物拮抗作用，同時雙歧桿菌體內含有大量的消化酶，能消化一些機體內依 靠本身的酶系不能消化的營養物質，促進體內營養物質的吸收，雙歧桿菌及其表面結豐勾成分可作為生物應 答劑經口服或非胃腸途徑增強宿主的免疫監視功能，可增強各種細胞因子和抗體的產生，提高NK和巨噬 細胞活性，提高局部或全身的防御功能，發揮自穩調節、抗感染、抗腫瘤效應。目前2又歧桿菌多作為益生 菌添加在乳品中，在歐美、日本等國家的功能性食品市場占統治地位，僅2005年就有379種益生菌產品 上市。
目前，雙歧桿菌較常用的培養基有MRS、 NPNL、 TPY、 PTYG等。TPY和PTYG培養基緩沖能力較 弱，不適合大規模使用；MRS和NPNL營養成分豐富，緩沖能力強，但目前MRS和NPNL培養基存在如 下問題價格較高(NPNL13元/L、 MRS3元/L;緩沖體系中磷酸鹽易造成乳酸桿菌由耐凍的短棒變成不 耐凍的纖棒狀；較多無機鹽成分對人體和動物健康具有潛在有害影響；L-十胱氨酸鹽酸鹽經高溫滅菌產生 不愉快氣味等問題限制其在工業上的應用。為了降低成本研究人員所篩選雙歧桿菌培養基多是在生化培養 基的基礎上添加一定比例的具有雙歧增長因子的天然物質，如番茄汁、菊芋汁、胡蘿卜汁等，也達到了提 高活菌數的目的，但是此類培養基配制步驟較多，操作繁瑣，不適宜用于工業化。

發明內容
為克服現有技術中的上述不足，木發明提供了一種以玉米漿干粉為主要原料的雙歧桿菌培養基。其具 有成本經濟和易于配制的特點。
1雙歧桿菌模板培養基篩選
為了對雙歧桿菌的生長特性有一個初步的了解，選擇了耐酸耐膽鹽等性能較好的長雙歧桿菌為實驗菌 株，測定了長雙歧桿菌在四種不同培養基下的生長曲線。采用25mL厭氧螺口試管，NPNL、 MRS、 TPY、 PTYG培養基，接種量1%, 37'C靜置培養，每三小時取樣，測定活菌數，對比菌株在不同培養基中的生 長速度和活菌數量。實驗結果如附圖1所示。由SAS統計分析可知，長雙歧桿菌在NPNL培養基中的培養12h進入穩定期以后活菌數與其他培養 基相比均有顯著性差異，因此選擇NPNL為模板進行工業化培養基篩選。
NPNL培養基成分為蛋白胨10g，胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉10g，葡萄糖10g，牛肝 粉15g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，吐溫一80 1ml，可溶性淀粉0.5g，牛肉膏3g，溶液A10ml，溶液B5ml。(其 中，A液K2HP04-25g, KH2P04 25g,蒸餾水250ml; B液MgS04'7H205g， FeS04'7H20 0.5g， NaCl 0.5g, MnS04'H20 0.337g，蒸餾水250ml) pH7.2。
2限制NPNL培養基工業化應用的因素
NPNL培養基組成成分包括碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肝 粉)、緩沖體系(K2HP04, KH2P(D4)、抗氧化劑(L-半胱氨酸鹽酸鹽)、微量元素(MgSO+7H20 、 FeS04-7H20、 NaCl 、 MnS04.H20)。
NPNL培養基中不同種類的營養素所占比例差別較大，如附圖2。氮源成本占到全部成本的93%,碳 源占到2.5%，抗氧化劑占4.0%，緩沖體系、微量元素、乳化劑共占0.5%。由附圖2可知，氮源成本較高 影響了NLNL培養基工業化應用。此外，磷酸鹽緩沖液對菌體、較多無機鹽成分對人和動物健康的有害影 響，以及L-半胱氨酸鹽酸鹽滅菌產生的不良風味均是限制NPNL培養基工業化應用的肉素。
3工業化培養基選擇
針對NPNL的缺點進行工業培養基的篩選，在不降低雙歧桿菌生物發酵量的前提下對模板NPNL培養 基進行迠當修改。
3.1氮源的確定
NPNL中氮源的成本占總成本的90%以上，因此降低培養基成本主要是降低氮源的成本。 選用較為常見且成本較低的脫脂奶粉、乳清蚩白、玉米漿等氮源進行研究，其他營養成分及用量均按
照模板NPNL培養基中的成分及用量進行添加。脫脂奶粉、乳清蛋白、玉米漿干粉等氮源的添加量為模板
NPNL培養基中粗蛋白質含量(25g/L)，測定長雙歧桿菌在各種培養基中的活菌數，結果如附圖3所示 在蛋白質含量均為25g/L的條件下，長雙歧桿菌在9h進入穩定期，在玉米漿干粉中的活菌數比脫脂奶
粉和乳清蛋白屮的活菌數有顯著性差異，和模板培養基NPNL沒有顯著性差異，因此選用玉米漿干粉作為氮源。
在碳源、抗氧化劑、乳化劑等其他條件都不變的情況下，選用不同玉米漿干粉蛋白質含量的培養基， 1%接種，12h進行活菌數測定，結果如附圖4所示。
由SAS統計分析可知，長雙歧桿菌在蛋Q質含量為22g/L和25g/L的培養基中活菌數均比其他含量的 培養基中活菌數有顯著性差異，這兩者沒有顯著性差異，因此在以玉米槳干粉作為培養基氮源時，優選培 養基的蛋白質含量為22 25g/L。可選擇不同蛋白含量的玉米槳干粉作為氮源，并根據所需的培養基蛋白含量調節玉米槳干粉的添加 量。玉米漿干粉的蛋白含量優選為40重量％，其添加量可以為55~63g/L。
3.2緩沖體系的確定
玉米漿干粉培養基中具有較多的固形物，是一種良好的緩沖體系。設想可以取代磷酸鹽緩沖體系起到 緩沖作用，并進行驗證。在3.1篩選的培養基基礎上分別添加和不'添加磷酸鹽緩沖體系，1%接種，在12h 達到穩定期時分別取樣，測定活菌數，添加磷酸鹽緩沖體系的培養基活菌數對數值為9.61±0.03，不添加磷 酸鹽緩沖體系的培養基活菌數對數值為9.65±0.05,經SAS統計分析可知兩者沒有顯著性差異。
由結果可知，添加或者不添加磷酸鹽緩沖體系對玉米漿培養基的pH及活菌數變化沒有顯著影響，能 起到緩沖的作用。因此可以剔除模板NPNL培養基中磷酸鹽緩沖液，以避免其對菌體凍干存活率的影響。
3.3無機鹽溶液的確定
有研究表明，在含有玉米漿成分的培養基中添加或者不添加外來無機鹽成分對鼠李糖乳桿菌產乳酸能 力沒有顯著性差異，表明玉米漿中的無機鹽含量可以滿足乳酸菌對礦物鹽的需求，可以略去NPNL培養基 中的無機鹽溶液，并進行實驗驗證是否對雙歧桿菌的生長有影響。在3.2篩選的培養基基礎上分別添加和 不添加NPNL中的無機鹽溶液，1%接種，12h達到穩定期是取樣測定活菌數，添加NPNL中無機鹽溶液的 培養基活臠數對數值為9.73±0.03，不添加NPNL中無機鹽溶液的培養基活菌數為9.60±0.07。
經SAS統計分析可知兩者沒有顯著性差異，即玉米漿中的無機鹽成分已經能夠滿足雙歧桿菌的生長， 因此在所選的玉米漿培養基中不必添加NPNL中的無機鹽溶液。
3.4抗氧化劑的確定
有研究表明，抗壞血酸作為一種抗氧化劑也具有消除氧對雙歧桿菌的脅迫作用且其在膜過濾除菌和雙 歧桿菌培養過程中沒有不良氣味產生，因此可以考慮取代L-半胱氨酸鹽酸鹽，選用抗壞血酸作為抗氧化劑 添加到3.3所篩選的培養基中，1%接種，12h時取樣測定活菌數，結果如附圖5所示
其中，0表示不添加任何抗氧化劑。結果表明，添加不同量的抗壞血酸對雙歧桿菌在玉米漿培養基中 的生長沒有顯著性影響，肉此可以不添加任何抗氧化劑.究其原因可能為，玉米漿中含有約0.39% (下物質 含量)的胱氨酸，而胱氨酸可以與半胱氨酸相互轉化，在雙歧桿菌發酵的過程中可以起到去除氧對菌體的 化學脅迫作用。
本發明以玉米槳作為雙歧桿菌培養基的氮源。具有以下優勢
玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、氨基酸、維生素、無機鹽等，含大約70%同體物質，蛋白質含量約 40%,氨基酸含量約20%，其營養結構很適合乳酸菌生長繁殖的需要。
其來源廣泛，且經噴霧干燥制得的玉米漿干粉，儲運方便，適應工業化大規模生產的需要。近年玉米淀粉生產增長較快，玉米漿的出路也成了問題，特別是玉米淀粉廠比較集中的產區，很多小 廠均將玉米浸泡水直接排放，浪費資源，且造成環境的污染。本發明開拓了玉米漿的使用范圍。
其成本低廉，顯著地降低了培養基的成分，相比NPNL培養基價格下降95。/。，相比MRS培養基價格 下降80%。
其制作過程簡單，適合雙歧桿菌的工業化規模生產。


附圖1:雙歧桿菌在四種雙歧培養基中的生長曲線。 附圖2: NPNL培養基中個營養成分的成本。
附圖3:替換的三種氮源培養基培養雙歧桿菌的結果。
附圖4:不同衛米漿干粉蛋白質濃度培養基培養雙歧桿菌的結果。
附圖5:添加不同抗氧化劑的玉米漿干粉培養基中培養雙歧桿菌的對比。
具體實施例方式
實施例1:
(1) 制備玉米漿稱重玉米漿干粉后，補足水至55 63g/L，紗布過濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，10 20g/L;吐溫-80, 0 1g/L;
(3) 調節pH值至6.5 7.2;
(4) 110。C 12rC， 10 15min滅菌備用。 實施例2:
(1) 制備玉米槳選擇經過噴霧干燥加工的精制玉米漿干粉，稱重后，補足水至63g/L，調節pH值 到7.2， 8層紗布過濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，10g/L;
(3) 調節pH值至6.5;
(4) 分裝，110'C 121'C， 10 15min滅菌備用。
實施例3:
(1)制備玉米漿選擇經過噴霧干燥加工的精制玉米漿干粉，稱重后，補足水至58g/L，調節pH值到7.2， 8層紗布過濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，15g/L;吐溫-80, 0.5g/L;
(3) 調節pH值至7.0;
(4) 分裝，110°C 121°C， 10 15min滅菌備用。 實施例4:
(1) 制備玉米漿選擇經過噴霧千燥加T的精制玉米漿干粉，稱重后，補足水至55g/L，調節pH值 到7.2， 8層紗布過濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，20g/L;吐溫-80， lg/L;
(3) 調節pH值至7.2;
(4) 分裝，110'C 12rC， 10 15min滅菌備用。
權利要求
1.一種適合工業化生產雙歧桿菌的培養基，其特征在于由以下成分組成以玉米漿干粉為氮源使培養基蛋白質含量為22～25g/L；葡萄糖，10～20g/L；吐溫-80，0～1g/L；初始pH 6.5～7.2，余量為水。
2. 如權利要求1所述的培養基，其特征在于其中玉米漿千粉的蛋白質重量含量為40%。
3. 根據權利要求書1或2所述的適合工業化生產雙歧桿菌培養基，其特征在于所述玉米漿干粉是經 過噴霧下燥加工的精制玉米漿千粉。
4. 根據權利要求書1或2所述的適合工業化生產雙歧桿菌培養基，其特征在于所述葡萄糖是分析純葡萄糖。
5. 根據權利要求書1或2所述的適合「.業化生產雙歧桿菌培養基，其特征在于所述吐溫-80是分析純 吐溫-80。
6. 根據權利要求書l一5所述的適合工業化生產雙歧桿菌培養基的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 制備玉米漿稱重玉米漿干粉后，補足水至規定濃度，紗布過濾后，備用；(2) 在步驟(O的玉米漿中添加規定量的葡萄糖和/或吐溫-80;(3) 調節pH值至6.5 7.2;(4) 110。C 12rC，滅菌10 15min即得。
全文摘要
本發明公開了一種適合工業化生產雙歧桿菌的培養基及其配制方法。所述培養基由以下成分組成玉米漿干粉(蛋白含量40％)，55～63g/L；葡萄糖，5～10g/L；吐溫-80，0～1g/L；初始pH 6.5～7.2。長雙歧桿菌BBMN68及BB12在該培養基中生長良好，最大生長量達到10⁹cfu/ml，優于經典雙歧桿菌培養基MRS及NPNL。該培養基成本低廉(相比NPNL培養基價格下降95％，相比MRS培養基價格下降80％)，制作過程簡單，適合雙歧桿菌的工業化規模生產。
文檔編號C12R1/01GK101597585SQ20091013651
公開日2009年12月9日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者任發政, 劉松玲, 劉愛萍, 張丁丁, 楊海鶯, 田寒友, 蔣菁莉, 亮 趙 申請人:任發政