專利名稱：：通過在發酵罐中高密度培養真核微生物來增加含有多烯脂肪酸的脂質的產生的制作方法
技術領域：
：本發明涉及培養微生物和回收微生物脂質的新方法。具體地，本發明涉及生產微生物多不飽和脂。
背景技術：
：在真核微生物中生產多烯脂肪酸(含有2個或更多個不飽和碳碳鍵的脂肪酸)一般認為需要分子氧的參與(即需氧條件)。這是因為據認為在所有非寄生性真核微生物的脂肪酸中形成的順式(cis)雙鍵參與直接的氧依賴型去飽和反應(氧化微生物去飽和酶系統)。其它已知需要分子氧的真核微生物脂質包括真菌甾醇和植物甾醇，羥基類胡蘿卜素(oxycarotenoids)(即葉黃素)，泛醌，和從任一種這類脂質制備的化合物(如次級代謝產物)。已證實某些真核微生物(如藻類；真菌，包括酵母；和原生生物)在發酵罐中可以很好地生產多烯脂肪酸。但是，極高密度培養(微生物的生物量大于100g/L,特別是商業規模的)會降低多烯脂肪酸的含量，這樣會降低多烯脂肪酸的生產力(productivity)。這可能部分是由于幾種因素，包括由于微生物的高濃度造成對氧的高需求，而難于維持發酵液中的溶氧水平。保持較高溶氧水平的方法包括提高通氣速率和/或采用純氧替代空氣通氣和/或提高發酵罐的攪拌速度。這些解決方法一般提高脂質生產的成本和發酵設備的資金成本，而且會產生其它的問題。例如，在高細胞密度時增加通氣容易在發酵罐中產生嚴重的起泡問題，加強攪拌會由于發酵液中剪切力增加而導致微生物細胞破碎(這會導致脂質釋放到發酵液中，從而被氧化和/或被酶降解)。對于正處于氮受限或耗盡以誘導產生脂質從而細胞壁較弱的細胞，細胞破碎問題更為突出。結果，當以極高細胞密度培養生產脂質的真核微生物時，它們的脂質通常都只含有極少量的多烯脂肪酸。例如，以醇為碳源培養斯達氏油脂質酵母(丄^om少c"Warfey/)在140小時到153g/L的密度，產生的脂質濃度為83g/L。但是在濃度大于100g/L時酵母的多烯脂肪酸含量平均只有總脂肪酸的4.2%(在細胞密度為20-30g/L時其含量從占總脂肪酸的11.5%開始減少)。Yamauchi等,J.Ferment.Technol.,1983，61,275-280。這樣產生的多烯脂肪酸濃度只有約3.5g/L,平均多烯脂肪酸生產力只有約0.025g/L/hr。此外，在酵母脂質中唯一報導的多烯脂肪酸是C18:2。已證實另一酵母，A/zocfotorw/flg/w"m^，具有的平均脂質生產力約為0.49g/L/hr，但其脂質中多烯脂肪酸含量也較低(占全部脂肪酸的15.8%,14.7%C18:2和1.2%C18:3)，導致在補料分批培養中多烯脂肪酸生產力只有約0.047g/L/hr，在連續培養中是0.077g/L/hr。本發明人之一以前已證實破嚢壺菌(Thraustochytriales)目的某些海洋微藻類在發酵罐中是極好的多烯脂肪酸生產者，特別是在低鹽，特別是極低氯化物水平培養時。其它有人描述了Thraustochytrids在培養120小時，細胞密度為59g/L時的平均多烯脂肪酸(DHA，C22:6n-3;和DHA，C22:5n-6)生產力約為0.158g/L/hr。但是這樣的生產力只能在約50%的海水鹽度下達到，這樣的濃度會嚴重腐蝕傳統的不銹鋼發酵罐。生產含多烯脂肪酸的微生物脂質，特別是高度不飽和脂肪酸，如C18:4n-3，C20:4n-6，C20:5n3，C22:5n-3，C22:5n-6和C22:6n-3,的費用一直較高，部分原因是含高水平多烯脂肪酸的真核微生物培養密度的限制和在這樣的高細胞濃度下的氧限制以及獲到高生產力所需的較高溫度的限制。因此，需要高濃度培養微生物，并同時利于提高含多烯脂肪酸的脂質的產量。本發明提供了培養真核微生物的方法，所述微生物能產生至少約20%的生物量的脂質，本發明還提供生產這樣的脂質的方法。優選這些脂質包含一或多種多烯脂肪酸。此方法包括向含有真核微生物的發酵培養基加入發明概述碳源，優選是非醇碳源，和限制性營養源。優選地，所述碳源和營養源的添加速度足以提高發酵培養基的生物量密度到至少約100g/L。本發明的一方面，發酵條件包括生物量密度提高階段和脂質生產階段，其中所述生物量密度提高階段包括加入碳源和限制性營養源，所述脂質生產階段包括添加碳源但不加入限制性營養源，以形成誘導脂質產生的條件。本發明的另一方面，在脂質生產階段的發酵培養基中的溶氧量低于在生物量密度提高階段的發酵培養基中的溶氧量。本發明的另一方面，微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。本發明特別有用的微生物是能在發酵培養基中氧水平低于約3%的飽和度的情況下生產脂質的真核微生物。本發明的另一方面，以補料分批培養方式培養微生物。本發明的另一方面還提供了在此發酵工藝的后半部分保持發酵培養基中氧水平低于約3%飽和度。本發明的另一方面提供了生產真核微生物脂質的方法，包括(a)在發酵培養基中培養真核微生物，以便將該發酵培養基的生物量密度提高到至少約100g/L;(b)提供足以使所述^f鼓生物生產所述脂質的發酵條件；和(c)回收所述脂質，其中所述脂質的多于15%是多不飽和脂。本發明的另一方面提供了回收脂質的方法，包括(d)除去所述發酵培養基中的水，得到干的微生物；和(e)從所述干的微生物分離所述脂質。優選地，所述除去水的步驟包括將所述發酵培養基不經預先離心而直接與轉鼓式干燥機接觸。本發明的另一方面提供了回收脂質的步驟，包括(d)處理發酵液以透化，溶解，或石皮裂樣吏生物細胞；和(e)在有或沒有水溶性試劑幫助裂解脂質/水乳劑的情況下，通過重力分離，優選離心，回收發酵液中的脂質。優選地，步驟(c)中是在發酵罐或類似容器中處理微生物細胞。本發明的另一方面提供了富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法。所述方法包括存溶氧水平低于10%的生長培養基中發酵微生物。本發明的又一方面是生產產品和微生物的異養方法。該方法包括在生長培養基中培養含有聚酮化合物合成酶基因的微生物并保持培養液中的溶氧水平低于10%。本發明還涉及1.一種從真核微生物生產含有多烯脂肪酸的脂質的方法，所述微生物能產生至少占其生物量約20%的脂質，該方法包括向含有所述微生物的發酵培養基中以足以提高該發酵培養基生物量密度到至少約100g/L的速率加入非醇碳源和限制性營養源。2.項1的方法，其中該方法包含一個生物量密度提高階段和一個生產階段，其中該生物量密度提高階段包括添加所述碳源和所述限制性營養源，該生產階段包括添加所述碳源，不加或很少加入所述限制性營養源以誘導產生營養源限制性條件，該條件可誘導產生脂質。3.項2的方法，其中在該生產階段發酵培養基中的溶氧量低于在該生物量密度提高階段的發酵培養基中溶氧量。4.項3的方法，其中在該生物量密度提高階段發酵培養基中溶氧量是至少約4。/0。5.項4的方法，其中在該生產階段發酵培養基中溶氧量是不到約1%。6.項1的方法，其中該非醇碳源包含一種碳水化合物。7.項1的方法，其中該限制性營養源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B^源，泛酸鹽源，碌^胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，4丐源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。8.項7的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS04*7H20;MnCl2'4H20;ZnS04'7H20;CoCl2*6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiSO,6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。9.項1的方法，其中所述限制性營養源包括氮源。10.項9的方法，其中所述氮源包括無機銨鹽。11.項9的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。12.項10的方法，其中所述發酵培養基的pH由該限制性營養源控制。13.項1的方法，其中所述發酵培養基的溫度至少為約2(TC。14.項1的方法，其中該方法以至少約0.5g/L/hr的速率產生脂質。15.項14的方法，其中所述脂質的至少約15%是多不飽和脂。16.項14的方法，其中co-3和co-6脂肪酸的總量是所述脂質的至少約20%。17.項14的方法，其中所述脂質的至少約25%是二十二碳六烯酸。18.項1的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。19.項18的方法，其中所述微生物能在發酵培養基氧水平低于約3%的飽和度下產生脂質。20.項18的方法，其中對所述微生物進行補料分批培養。21.項20的方法，還包括在該發酵方法的生產階段發酵培養基維持低于約3%飽和度的氧水平。22.項1的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。23.項1的方法，其中所述微生物是Stmmenopiles。24.項1的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。25.項1的方法，其中所述孩i生物選自破嚢壺菌屬，Sc/z/zoc/^n'wm或其混合物。26.培養能生產占其生物量的20%為脂質的真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發酵培養基中添加碳源和限制性營養源，添加的速率足以提高該發酵培養基的生物量密度到至少約100g/L，其中該方法生產脂質的速度至少平均約為0.5g/L/hr，所述微生物產生的總脂質中至少約15%是多不飽和脂。27.項26的方法，其中該方法還包括(a)生物量密度提高階段，其中發酵培養基的溶氧水平至少約為4%;和(b)脂質高產階段，其中發酵培養基中的溶氧水平低于約1%。28.項26的方法，其中所述碳源是非醇碳源。29.項26的方法，其中所述限制性營養源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B!2源，泛酸鹽源，硫胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，釣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。30.項29的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS(V7H20;MnCl2'4H20;ZnS04'7H20;CoCl2*6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。31.項26的方法，其中所述限制性營養源包含氮源。32.項31的方法，其中該氮源包含無機銨鹽。33.項26的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。34.項26的方法，其中所述微生物是Stramen叩iles。35.項26的方法，其中所述微生物是微藻類。36.項26的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。37.項26的方法，其中所述孩史生物選自破嚢壺菌屬，&/z/zoc/z>^/wm或其混合物。38.項26的方法，其中所述脂質的至少約20%是0>3和co-6脂肪酸。39.項26的方法，其中所述脂質的至少約25%是二十二碳六烯酸。40.培養真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發酵培養基中添加碳源和限制性營養源，添加的速率足以提高該發酵培養基的生物量密度到至少約100g/L,其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能生產占其生物量至少約20%的包含多烯脂肪酸的脂質。41.項40的方法，其中該方法以至少約為0.5g/L/hr的平均速度產生微生物脂質。42.項41的方法，其中多于約15%的所述脂質是多不飽和脂。43.項41的方法，其中co-3和co-6多不飽和脂肪酸的總量是所述脂質的至少約20%。44.項41的方法，其中所述脂質的至少約25%是二十二碳六烯酸。45.項40的方法，其中該方法以至少約0.2g/L/hr的平均速度產生二十二碳六烯酸。46.項40的方法，其中所述碳源不是一種醇。47.項46的方法，其中所述碳源是碳水化合物。48.項40的方法，其中所述限制性營養源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B,2源，泛酸鹽源，>琉胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，鈣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。49.項48的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS04*7H20;MnCl2*4H20;ZnS04'7H20;CoCl2*6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiSCV6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。50.項40的方法，其中限制性營養源包括氮源。51.項50的方法，其中所述氮源包括無機銨鹽。52.項40的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。53.項40的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。54.項40的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。55.項40的方法，其中所述微生物是Stramenopiles。56.—種生產真核微生物脂質的方法，包括(a)在發酵培養基中培養真核微生物以便將該發酵培養基的生物量密度提高到100g/L;(b)提供足以使所述微生物生產所述脂質的發酵條件；和(c)回收所述脂質，其中所述脂質的多于約15%是多不飽和脂。57.項56的方法，其中在所述微生物的生長階段所述發酵培養基中的溶氧水平高于生產所述脂質的階段的發酵培養基中的溶氧水平。58.項56的方法，其中在微生物生長階段的發酵培養基中溶氧水平至少約為4%。59.項56的方法，其中在生產脂質階段的發酵培養基中溶氧水平低于約1%。60.項56的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。61.項56的方法，其中所述樣么生物是Stramenopiles。62.項56的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。63.項56的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。64.項56的方法，其中所述微生物選自石皮囊壺菌屬，5b/2/zoc/z盧n'w"或其混合物。65.項56的方法，其中是co-3和(D-6脂肪酸的總量是所述微生物脂質的至少約20%。66.項56的方法，其中所述微生物脂質的至少約25%是二十二碳六烯酸。67.項56的方法，其中所述方法產生二十二碳六烯酸的平均速度至少約為0.2g/L/hr。68.項56的方法，其中所述脂質回收步驟包括(d)除去所述發酵培養基中的水，得到干的微生物；和(e)從所述干的微生物分離脂質。69.項68的方法，其中所述除去水的步驟包括將所述發酵培養基不經預先離心而直接與轉鼓式干燥機接觸。70.項56的方法，其中所述回收脂質的步驟包括(d)處理發酵液以透化，溶解，或;皮裂纟鼓生物細胞；和(e)在有或沒有試劑幫助裂解脂質/水乳劑的情況下，通過重力分離來回收發酵液中的脂質。71.項70的方法，其中在步驟(d)中是在發酵罐或類似容器中處理微生物纟田月包。72.項70的方法，其中所述重力分離包括離心。73.項56的方法，其中所述微生物培養階段包括添加碳源和限制性營養源。74.項73的方法，其中所述碳源并非醇類。75.項74的方法，其中所述碳源包括一種碳水化合物。76.項73的方法，其中所述限制性營養源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素Bu源，泛酸鹽源，碌b胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，鈣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。77.項76的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgSCV7H20;MnCl2'4H20;ZnS04*7H20;CoCl2'6H20;Na2Mo04'2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04*7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。78.項73的方法，其中限制性營養源包括氮源。79.項78的方法，其中所述氮源包括無機銨鹽。80.項78的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。81.—種生產真核微生物脂質的方法，包括(a)向包含所述微生物的發酵培養基中加入非醇碳源和限制性營養源；(b)提供足以使所述微生物生產所述微生物脂質的條件；和(c)回收所述微生物脂質，其中所述微生物脂質的至少約15%為多不飽和脂。82.項81的方法，其中在生物量密度提高階段的發酵培養基中溶氧水平高于脂質生產階段發酵培養基中的溶氧水平。83.項81的方法，其中在生物量密度提高階段的發酵培養基中溶氧水平至少約為4%。84.項81的方法，其中在脂質生產階段的發酵培養基中溶氧水平約為1%或更低。85.項81的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物。86.項81的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，且其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。87.項81的方法，其中所述微生物是Stramenopiles。88.項81的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。89.項81的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。90.項81的方法，其中所述微生物選自破嚢壺菌屬，5b/H'zoc/7"n'wm或其混合物。91.項81的方法，其中該方法以至少約為0.5g/L/hr的平均速度產生微生物脂質。92.項91的方法，其中co-3和co-6脂肪酸的總量是所述微生物脂質的至少約20%。93.項81的方法，其中所述脂質的至少約25%是二十二碳六烯酸。94.項81的方法，其中該方法以至少約0.2g/L/hr的平均速度產生二十二碳六烯酸。95.項58的方法，其中所述脂質回收步驟包括(d)除去所述發酵培養基中的水，得到干的微生物；和(e)從所述干的微生物分離脂質。96.項95的方法，其中所述除去水的步驟包括將所述發酵培養基不經預先離心而蒸發去水。97.項81的方法，其中所述回收脂質的步驟包括(d)處理發酵液以透化，溶解，或破裂^[效生物細胞；和(e)在有或沒有試劑幫助裂解脂質/水乳劑的情況下，通過重力分離而回收發酵液中的脂質。98.項97的方法，其中在步驟(d)中是在發酵罐或類似容器中處理微生物細月包。99.項97的方法，其中所述重力分離包括離心。100.項81的方法，其中所述非醇碳源包括碳水化合物。101.項81的方法，其中所述限制性營養源選自氮源，碳源，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B!2源，泛酸鹽源，硫胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，鈣源，鈉源，鉀源)，二氧化硅源或其混合物。102.項101的方法，其中所述痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(如MgS04'7H20;MnCl2*4H20;ZnS04*7H20;CoCl2*6H20;Na2MoO,2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04'7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)或其混合物。103.項81的方法，其中限制性營養源包括氮源。104.項103的方法，其中所述氮源包括無機銨鹽。105.項103的方法，其中所述氮源包括氫氧化銨。106.—種生產真核微生物脂質的方法，包括(a)在含有真核微生物的發醇培養基中添加碳源和限制性營養源，并提供足以將該發醇培養基中溶氧水平維持在至少約4%的條件，以便產生至少約100g/L的生物量密度；(b)提供足以將該發醇培養基中溶氧水平維持在約1%或更低水平的條件，并提供足以使所述微生物生產所述脂質的發酵條件；和(c)回收所述脂質，其中所述微生物脂質的至少約15%是多不飽和脂。107.項106的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物。108.項106的方法，其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，且其中所述微生物能產生多烯脂肪酸或其它一般被認為其合成需要氧的脂質。109.項106的方法，其中所述孩么生物是Stramenopiles。110.項106的方法，其中所述微生物是微藻類和類藻微生物。111.項106的方法，其中所述微生物屬于破嚢壺菌目。112.項106的方法，其中所述樣i生物選自破嚢壺菌屬，Sc/n'zoc/^fn'wm或其混合物。113.項106的方法，其中所述微生物脂質的至少約20%是00-3和/或co-6脂肪酸。114.項106的方法，其中所述微生物脂質的至少約25%是二十二碳六烯酸。115.項106的方法，其中該方法以至少約0.2g/L/hr的平均速度產生二十二碳六烯酸。116.項106的方法，其中所述脂質回收步驟包括(d)除去所述發酵培養基中的水，得到千的微生物；和(e)從所述干的微生物分離脂質。117.項116的方法，其中所述除去水的步驟包括將所述發酵培養基不經預先離心而直接蒸發去水。118.項106的方法，其中所述回收脂質的步驟包括(d)處理發酵液以透化，溶解，或破裂微生物細胞；和(e)在有或沒有試劑幫助裂解脂質/水乳劑的情況下，通過重力分離而回收發酵液中的脂質。119.項106的方法，其中在步驟(d)中是在發酵罐或類似容器中處理微生物細月包。120.項118的方法，其中所述重力分離包括離心。121.—種富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法，包括在溶氧水平低于10%的生長培養基中發酵所述微生物。122.項121的方法，其中的溶氧水平低于5%。123.項121的方法，其中的溶氧水平低于1%。124.項121的方法，其中在開始的生長階段，溶氧水平高于10%,在隨后的生產階段，溶氧水平低于10%。125.項121的方法，其中所述微生物包括聚酮化合物合成酶基因。126.—種生產產物和微生物的異養方法，包括b.在生長培養基中培養所述微生物，所述微生物中包含聚酮化合物合成酶基因；和b.保持溶氧水平低于10%。127.項126的方法，其中所述溶氧水平低于約5%。128.項126的方法，其中所述溶氧水平低于約1%。129.項126的方法，其中所述聚酮化合物合成酶基因天然產生于所述微生物中。130.項126的方法，其中所述聚酮化合物合成酶基因是通過基因工程引入到所述微生物中的。131.項126的方法，其中在生長的開始階段，溶氧水平高于10%，在隨后的生產階段，溶氧水平約低于10%。圖1是微生物的各種脂質生產參數對發酵培養基中溶氧量的表和圖。發明詳述本發明提供了培養微生物，例如藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，和細菌的方法。優選地，微生物選自藻類，原生生物，細菌或其混合物。更優選地，微生物是藻類。而且，本發明方法可用于生產各種脂質化合物，尤其是不飽和脂質，優選多不飽和脂(即含有至少2個不飽和碳-碳鍵，例如雙鍵，的脂質)，更優選高度不飽和脂(即含有4個或更多個不飽和碳-碳鍵的脂質)如ro-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸(即DHA);和其它天然的不飽和，多不飽和及高度不飽和化合物。本文中術語"脂質"包括磷脂；游離脂肪酸；脂肪酸的酯；三酰基甘油；甾醇和甾醇酯；類胡羅卜素；葉黃素(例如羥基類胡蘿卜素)；烴；類異戊二烯衍生的化合物和本領域技術人員所知的其它脂質。更具體地，本發明方法可用于生產真核微生物多烯脂肪酸，類胡蘿卜素，真菌甾醇，植物甾醇，葉黃素，泛醌，和通常認為需要氧來產生不飽和碳-碳鍵(即通氣條件)的其它類異戊二烯衍生的化合物，和其次級代謝產物。具體地，本發明方法可用于培養生產多烯脂肪酸的微生物，并用于生產微生物多烯脂肪酸(類)。本發明的方法可用于培養許多微生物并得到由其產生的包含多不飽和脂的化合物，但為了簡潔，便利和說明，此發明詳述將討論培養能產生含有-3和/或co-6多不飽和脂肪酸的脂質的微生物，尤其能產生DHA(或密切相關的化合物如DPA，EPA或ARA)的微生物的方法。優選的孩i生物包括微藻類，真菌(包括酵母)，原生生物和細菌。優選的一組微生物是稱為Stramenopiles的成員，包括微藻類和類藻微生物。Stramenopiles包括下列微生物Hamatores,Proteromonads，Opalines,Developayelle,Diplophrys,Labrinthulids，Thraustochytrids,Biosecids,卵菌纟岡(Oomycetes)，Hypochytridiomycetes，Commation，Reticulosphaera,Pelagomonas，Pelagococcus，Ollicola，Aureococcus,Parmales，娃藻屬(Diatoms),黃藻(Xanthophytes),Phaeophytes(褐藻)，Eustigmatophytes,Raphidophytes,Synurids,Axodines(包才舌Rhizochromulinaales,Pedinellales,Dictyochales),Chrysomeridales,Sarcinochrysidales，Hydrurales，Hibberdiales,和Chromulinales。其它優選的微藻類包括綠藻和腰鞭毛目(dinoflagellates)，包括O7/^ec0AMm屬的成員。更具體地，本發明的優選實施方案參照培養海洋微生物的方法進行討論，所述海洋微生物尤其是藻類，例如破嚢壺菌目的Thraustochytrids,更尤其是破嚢壺菌屬(772rawWoc/zj^n^m)的破嚢壺菌(Thraustochytriales)以及Sc/z/zoc/z;^7Ywz屬，包4奮在共同壽爭讓的美國專利5340594和5340742(兩者授權于Barclay,都全文引入作為參考)中公開的破嚢壺菌。應注意，許多專家同意Ulkenia不是一個單獨的屬，實際是Sc/n'zoc/z;^r/Mw屬的一邢分。在本文中,Sc/z/zoc/zjvtn'wm屬包括L7fem'a。優選的微生物是那些可通過聚酮化合物合成酶系統產生目的化合物的微生物。這樣的微生物包括具有內源的聚酮化合物合成酶系統的微生物以及已通過基因工程導入聚酮化合物合成酶系統的^f效生物。聚酮化合物是結構多樣的天然產物，具有多種生物活性，包括抗生素和藥物學特性。聚酮化合物合成酶催化聚酮化合物碳鏈骨架的生物合成。象結構和機理相關的脂肪酸合成酶，聚酮化合物合成酶催化酰基硫代酸酯之間的重復的脫羧縮合，一次可以使碳鏈延長兩個碳原子。但是，與脂肪酸合成酶不同，聚酮化合物合成酶能產生結構具有很大差異的終產物。單個聚酮化合物合成酶系統可如下實現這一點利用非乙酸酯的起始單元，利用甲基或乙基丙二酸酯作為延伸單位，和改變每次縮合所得(3-酮基的酮還原、脫水和烯酰基還原反應的還原周期(cycle)。本文特別感興趣的是脫水步驟導入的碳-碳雙鍵在終產物中可保持。此外，盡管這些雙鍵開始是反式構型，通過酶促異構化作用在DHA(和其它目的多烯脂肪酸)中可轉變為順式。脫水酶和異構化反應都可在缺乏分子氧的情況下出現。優選地，本發明提供了異養方法用于產生產品和微生物。此方法優選包括在生長培養基中培養微生物，所述微生物中包含了聚酮化合物合成酶系統。優選地，保持溶氧水平低于約8%,更優選低于約4%，更優選低于約3%，更優選低于約1%。但是應理解地是，本發明作為一個整體并非要進行這樣的限制，本領域技術人員會認識到根據本發明的方法可用于其它微生物生產多種其它化合物，包括其它脂質化合物。假定某種藻類有相對恒定的生產脂質的速度，顯然較高的生物量密度能使單位體積生產的脂質總量更多。當今傳統的培養藻類的發酵方法產生的生物量密度為約50到約80g/L或更少。本發明人已經發現通過采用本發明方法，可以得到比現有已知生物量密度顯著提高的生物量密度。優選地，本發明生產的生物量密度為至少約100g/L,更優選至少約130g/L，還優選至少約150g/L,還優選至少約170g/L，最優選至少約200g/L。因此，有了這樣高的生物量，即使藻類的脂質生產率稍稍降低，單位體積的脂質總產量也會顯著高于現有方法。本發明培養破嚢壺菌目微生物的方法包括向包含微生物的發酵培養基中加入碳源和限制性營養源，其加入速度足以提高發酵培養基的生物量密度到上述水平。此處，"限制性營養源"指微生物生長所必需的營養來源(包括營養物本身)，當生長培養基中限制性營養耗盡時，它的缺乏會大大抑制微生物的進一步生長或復制。但是，由于其它營養物質還很豐富，所述生物會繼續制造和累積胞內和/或胞外產物。通過選擇特異性的限制性營養物，可以控制積累產物的類型。因此，以一定的速度提供限制性營養源，可以控制微生物的生長速度和所需產物(例如脂質)的生產或積累。這種發酵過程由于將一或多種底物(例如碳源和限制性營養源)增量加入，而通常稱為補料分批發酵過程。已發現在分批發酵過程中加入底物時，大量的碳源(例如每60g/L生物量約200g/L或更高密度)對微生物有不利影響。不受任何理論的限制，認為這樣大量的碳源會對微生物產生有害影響，包括滲透壓，并抑制微生物的初始生產力。本發明方法避免了這種不需要的有害影響，同時提供了足以使所述微生物達到上述生物量密度的底物量。本發明的培養微生物的方法包括生物量密度的提高階段。在此階段，發酵過程的主要目的是提高發酵培養基中的生物量密度以得到上述的生物量密度。加入碳源的速度一般保持在不對微生物的生產力，或微生物的活力產生顯著有害影響的特定水平或范圍，所述有害影響是由于發酵設備除熱和對培養液輸入或輸出氣體的能力不足而導致的。具體微生物在發酵過程所需的碳源量的合適范圍為本領域技術人員所熟知。優選地，本發明的碳源是非醇碳源，即不包含醇的碳源。此處，"醇"指具有4個或更少的帶有一個羥基的碳原子，例如曱醇，乙醇和異丙醇，但是為了本發明的目的不包括羥基有機酸如乳酸和類似的化合物。更優選地，本發明的碳源是碳水化合物，包括，但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀粉。其它合適的單純和復合碳源和氮源公開在上述參考的專利中。但是典型地，碳水化合物，優選玉米糖漿用作主要的碳源。脂肪酸，羥基形式的脂肪酸，三酸甘油酯，和雙-和單-酸甘油酯也可用作^暖源。特別優選的氮源是尿素，硝酸鹽，亞硝酸鹽，大豆蛋白，氨基酸，蛋白質，玉米漿，酵母提取物，動物性副產物，無機銨鹽，更優選硫酸銨，氫氧化銨，最優選氫氧化銨。其它限制性營養源包括碳源(如上定義)，磷酸鹽源，維生素源(如維生素B!2源，泛酸鹽源，硫胺素源)，痕量金屬源(如鋅源，銅源，鈷源，鎳源，鐵源，錳源，鉬源)，主要金屬源(如鎂源，4丐源，鈉源，鉀源，和二氧化硅源等)。痕量金屬源和主要金屬源選自這些金屬的硫酸鹽或氯化物(例如MgS04*7H20;MnCl2'4H20;ZnS04*7H20;CoCl6H20;Na2Mo04，2H20;CuS04'5H20;NiS04'6H20;FeS04*7H20;CaCl2;K2S04;KC1;和Na2S04)。當銨用作氮源時，如不加堿或不用緩沖液控制，發酵培養基會變酸。當氫氧化銨用作主要的氮源時，它也可用于控制pH。破嚢壺菌目微生物，尤其破嚢壺菌屬的破嚢壺菌和5"c/zz'zoc/z聲n'ww屬可在較寬pH范圍內生長，例如從約pH5到約pHll。本領域技術人員了解具體微生物發酵的合適pH范圍。本發明培養微生物的方法還包括生產階段。在此階段，微生物利用底物的主要用途不是提高生物量密度，而是利用該底物生產脂質。應理解地是在生物量密度提高階段微生物也產生脂質；但是，如上所述，在生物量密度提高階段的主要目的是提高生物量密度。一般地，在生產階段，減少或優選停止添加限制性營養底物。以前一般認為在利用真核微生物生產多不飽和化合物，包括co-3和/或①-6多不飽和脂肪酸時，發酵培養基中的溶氧的存在是至關重要的。因此，通常認為發酵培養基中優選溶氧水平相對較高。但是，本發明人驚奇地發現在生產階段當溶氧水平降低時脂質的生產速率顯著提高。因此，在生物量密度提高階段發酵培養基中的溶氧水平優選至少約8%的飽和度，優選至少4%的飽和度，而在產生階段發酵培養基中的溶氧水平減少到約3%的飽和度或更少，優選約1%飽和度或更少，更優選0%飽和度。在發酵開始時，DO值可以為或接近飽和，當微生物生長時可使DO值降低至這些低DO設定值。在本發明的一個具體實施方案中，發酵期間發酵培養基中的溶氧量有變化。例如，對于總發酵時間為從約90小時到約100小時的一個發酵過程，發酵培養基中的溶氧水平在前24小時保持在約8%，在約第24小時到約第40小時約為4%，從第40小時到發酵過程終止約為0.5%或更少。可通過控制發酵罐頂部空間中的氧量來控制發酵培養基中的溶氧量，或優選通過控制發酵培養基的搖動(或攪拌)速度來控制。例如，高的搖動(或攪拌)速度會比低搖動速度在發醇培養基中產生相對更高的溶氧水平。例如，在約14,000加侖容量的發酵罐中，搖動速度設定為前12小時約50rpm到約70rpm，約第12小時到18小時約55rpm到約80rpm，約第18小時到發酵過程終止為約70rpm到約90rpm,以獲得上述總發酵時間約90到約100小時的發酵過程所具有的溶氧水平。獲得發醇培養基中特定溶氧量所需攪拌速度的特定范圍是本領域技術人員能夠決定的。本發明方法的優選溫度是至少約2(TC,更優選約25。C，最優選至少約30°C。應理解地是，冷水比熱水更能保持較高的溶氧量。因此，較高的發酵培養基溫度具有降低溶氧量的額外的好處，這是如上所述特別需要的。某些微生物可能需要在發酵培養基中有一定量的礦物鹽。這些礦物鹽，特別是氯離子，能腐蝕發酵罐和其它下游處理設備。為防止或降低在發酵培養基中相對大量氯離子的存在的這些不需要的影響，本發明方法還包括使用不含氯的鈉鹽，優選硫酸鈉，作為發酵培養基中的鈉源。更具體地，發酵中絕大部分鈉需求以不含氯的鈉鹽形式提供。例如，在發酵培養基中少于約75%的鈉鹽以氯化鈉的形式提供，更優選少于約50%,更優選少于25%。本發明的微生物可在氯濃度低于約3g/L時生長，優選少于約500mg/L,更優選低于250mg/L，更優選在約60mg/L到約120mg/L之間。不含氯的鈉鹽可包括蘇打灰(碳酸鈉和氧化鈉的混合物)，碳酸鈉，碳酸氬鈉，硫酸鈉及其混合物，優選包括硫酸鈉。蘇打灰，碳酸鈉，碳酸氫鈉將會提高發酵培養基的pH，因此需要控制步驟以維持培養基的正確的pH。硫酸鈉的濃度有效地符合微生物的鹽度要求，優選鈉濃度(表示為g/L的鈉)至少約為lg/L,更優選為lg/L到約50g/L,更優選為約2g/L到約25g/L。接種，培養，和回收微生物的各種發酵參數，詳述于美國專利5130242,其全文引入作為參考。任何現今分離方法可用于從發酵培養基分離微生物，包括離心，過濾，超濾，傾析，和溶劑蒸發。本發明人發現，由于本發明的方法產生如此高的生物量密度，當采用離心回收微生物時，優選加入水稀釋發酵培養基以降低生物量密度，從而能更有效的從發酵培養基分離微生物。本發明中獲得的極高生物量密度也便于回收微生物脂質的"無溶劑，，方法。2000年1月19日提交的題為"無溶劑提取方法"的美國臨時專利申請60/177,125、2001年1月19日提交的題為"無溶劑提取方法"的美國專利申請Q9〃66,50Q(現為U.S.LettersPatentNo.6,750,048,2004年6月15曰授&和2001年1月19日提交的題為"無溶劑提取方法"的PCT專利申請PCT/USO1/001806(皆全文引入作為參考)，都記述了在發酵罐中裂解細胞的優選方法。優選的在細胞于發酵罐中透化，破碎或裂解后回收脂質的方法(它可使脂質乳劑裂解，并回收富含脂質的級分)，包括WO96/05278公開的脫油方法，其全文引入作為參考。在此方法中，在油/水乳液中加入水溶性化合物，例如醇或丙酮，以裂解乳液，所得混合物通過重力分離技術，例如離心來分離。此方法經改良后也可以用其它試劑(水和/或脂溶性的試劑)裂解乳液。備選地，通過使發酵培養基的水分蒸發，例如使發酵培養基直接接觸干燥設備如轉鼓式干燥機(即沒有，例如通過離心來預先濃縮)，而從培養基回收干(dry)的微生物，即一種直接的轉鼓式干燥機回收方法。當采用直接轉鼓式干燥機回收方法分離微生物時，一般采用蒸汽加熱式轉鼓式干燥機。此外當采用直接轉鼓式干燥機回收方法時，所述發酵培養基的生物量密度優選至少約130g/L,更優選至少約150g/L，最優選至少約180g/L。這種高生物量密度通常是直接轉鼓式干燥機回收方法所希望的，因為生物量密度低時所述發酵培養基含有的水分足以使轉鼓明顯冷卻，使微生物不能徹底干燥。其它干燥細胞的方法，包括噴霧干燥，已為本領域技術人員所熟知。本發明的方法提供至少約0.5g/L/hr的平均脂質生產速度，優選至少約0.7g/L/hr,更優選至少約0.9g/L/hr,最優選1.0g/L/hr。而且，本發明方法生產的脂質包含約15%以上的多不飽和脂，優選約20%以上，更優選約25%以上，還優選約30%以上，最優選約35%以上。可從干孩么生物或發酵培養基中的微生物回收脂質。通常，本發明方法中由微生物產生的脂質至少約20%是-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，優選至少約30%的脂質是-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，更優選至少約40%的脂質是co-3和/或co-6多不飽和脂肪酸，最優選至少約50%的脂質是0>3和/或co-6多不飽和脂肪酸。或者，本發明方法的-3脂肪酸(例如DHA)平均產生速度為至少約0.2go>3脂肪酸(例如DHA)/L/hr,優選至少約0.3go>3脂肪酸(例如DHA)/L/hr，更優選至少約0.4gco-3脂肪酸(例如DHA)/L/hr，最優選至少約0,5gco-3脂肪酸(例如DHA)/L/hr。或者，本發明方法的cd-6脂肪酸(例如DPAn-6)平均產生速度為至少約0.07gco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr，優選至少約O.lgco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr,更優選至少約0.13gco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr，最優選至少約0.17gco-6脂肪酸(例如DPAn-6)/L/hr。還備選地，至少約25%的脂質是DHA(基于總脂肪酸曱基酯)，優選至少約30%，更優選至少約35%，最優選至少約40%。從中提取了脂質的微生物，在提取脂質之后所剩的生物量或其混合物可直接用作食品成分，例如飲料，調味汁，乳制品(例如乳，酸乳酪，干酪和冰淇淋)和烤制的食品的成分；營養添加劑(膠嚢或片劑形式中)；其肉或產品為人所消費的任何動物的飼料或飼料添加劑；食品添加劑，包括幼兒食品和嬰兒乳粉；藥品(在直接或附屬的治療應用中)。術語"動物"指屬于動物界的任何生物，包括但不限于可得到家禽肉，海產食品，牛肉，豬肉或羊肉的任何動物。海產食品得自但不限于魚，奸，曱殼類動物。術語"產品"包括除了這類動物的肉以外的任何產品，包括但不限于蛋，乳或其它產品。當伺喂這樣的動物時，多不飽和脂能被引入到這些動物的肉，乳，蛋或其它產品中以^提高它們中這些脂質的含量。在了解了下面的實施例后，本發明的其它目的，優勢和新的特點對本領域一般技術人員是顯而易見的，這些實施例并不構成對本發明的限制。實施例在較寬范圍的各種發酵條件下，這些實施例所用的5"c/^oc/^n'wm菌抹產生兩種主要的多烯酸，DHAn-3和DPAn-6，比例一^:為3:1，還有少量的其它多烯酸，如EPA和C20:3。因此，當下列實施例^l列出了DHA的量時，可以采用上述的比例容易地計算出產生的DPA(n-6)的量。實施例1本實施例舉例說明發酵培養基中氧含量對脂質生產力的影響。斥企測了在各種溶氧水平下Sc/n:zoc/^Www菌抹ATCC20888的發酵結果。該結果見圖1,其中RCS是蔗糖的殘余濃度，DCW是細胞干重。實施例2本實施例也舉例說明發酵培養基中低溶氧水平對最終生物量產物中DHA含量(％干重)的影響。在250ml的Erlenmeyer燒瓶中進行"按比例縮小(scale-down)"實驗以模擬在大規模發酵罐中培養5b/^oc/z盧n'ww細胞時低氧量對DHA含量的影響。在04-4培養基中培養Sc//zoc/^n'wm菌才朱(ATCC20888)。該培養基由每升去離子水中溶解的如下物質組成Na2S0412.61g;MgS04'7H201.2g;KC10.25g;CaCl20.05g;谷氨酸單鈉7.0g;葡萄糖10g;KH2P040.5g;NaHC03O.lg;酵母提取物O.lg;混合維生素l.OmL;PII金屬l.OOmL。PII金屬混合物含有(每升)6.0gNa2EDTA，0.29gFeCI3'6H20，6.84gH3B03,0.86gMnCl2'4H20,0.06gZnCl2，0.026gCoCl2'6H20，0.052gNiS04*H20，0.002gCuS04'H20,和0.005gNa2Mo04*2H20。混合維生素含有(每升)lOOmg硫胺素，0.5mg生物素，0.5mg維生素B12。調培養液的pH為7.0，然后過濾除菌。此按比例縮小實驗的構想是，在有不同體積培養液的搖瓶中培養細胞-搖瓶中幾乎裝滿(例如在250mL搖瓶中裝200mL)，在搖床上不能充分混合，這樣在細胞生長時就會產生低溶氧條件。為此，在本實驗中建立4種處理，每一種都雙份(1)250mL搖瓶中裝50mL培養基；(2)250mL搖瓶中裝lOOmL培養基；(3)250mL搖瓶中裝150mL培養基；(4)250mL搖瓶中裝200mL培養基。這8個搖瓶的每一個都接種已經培養了48小時的Sc/z/zoc/^n'Mm細胞，所述細胞已經在04-4培養基中按照第l種處理所述條件，在28。C以220rpm在搖床上培養。將所有這8個搖瓶置于培育箱(28。C)中的搖床(220rpm)上，避光培養48小時。在實驗結束時，用YSI溶氧計檢測每個搖瓶中的溶氧(DO)水平，也測定培養基中的pH,以及細胞干重和脂肪酸含量。實驗結果列于表1中。表1:觀察低溶氧濃度對Sc/2^c/^r/ww菌株的長鏈高度不飽和脂肪酸含量(DHA%干重)的影響的按比例縮小實驗結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>該結果顯示在低溶氧水平下培養的細胞的脂質含量(以％FAME計)和DHA含量(y。干重)較高，溶氧水平越低，脂質和DHA量越高。這是令人意外的，因為一般認為氧是形成不飽和(雙)鍵所必需的。令人驚異的是在低溶氧水平下形成如此多的DHA，因為DHA是最不飽和的脂肪酸之一。盡管隨著溶氧水平降低，生物量產量降低，DHA含量卻提高了。因此，較為有利地是使生長階段的溶氧水平較高以形成最多的生物量，然后降低溶氧水平以產生最多的長鏈脂肪酸。實施例3本實施例闡明本發明方法的再現性。采用正常工作體積為1200加侖的發酵罐生產微生物。濃縮所得發酵液，采用轉鼓式干燥機干燥微生物。提取所得微生物等分試樣的脂質，并純化產生精煉的，脫色的，除臭的油。在分析脂質前加入約3000ppmd-l-a-生育酚醋酸酯作為營養添加劑。對ScWzoc/z^n'Mm菌抹ATCC20888進行九次發酵，所得結果表示于表2中。在前24小時溶氧水平為約8%,其后為約4%。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>1.生物量密度實際產量，2.以％細胞干重計的DHA含量，3.以％細胞干重計的總脂肪酸含量(以甲基酯形式測定)，4.(gDHA)/L/Hr，5.平均值，6.標準差7.變異系數。變異系數值低于5%指示具有極佳再現性的方法，在5%到10%之間指示具有良好再現性的方法，在10%到20%之間指示具有合理再現性的方法。補加玉米糖漿^吏發酵罐中的體積達到約1200加侖，此時停止加入玉米糖漿。在殘余糖濃度低于5g/L時停止發酵過程。從接種到終點的典型菌齡為約100小時。發酵液，即發酵培養基用水稀釋至接近2:l的比例以減少終產品中灰分含量并幫助改進離心步驟時的相分離。將濃縮的細胞加熱到160'F(約71。C),在BlawKnow雙-轉鼓式干燥機(42"x36")上干燥。但是優選微生物不經離心而直接在轉鼓式干燥機上干燥。從表2中每一實體的等分試樣提取的脂質的分析結果總結在表3中。表3:表2所列補料分批發酵中產生的微生物生物量的分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>1.參見表2。2.參見上述討論。3.標準差4.變異系數。變異系數值低于5%指示具有極佳再現性的方法，在5%到10%之間指示具有良好再現性的方法，在10%到20%之間指示具有合理再現性的方法。除非特別指出，在本文實施例部分所用的發酵培養基包括如下成分，其中第一個數字指出正常的目標濃度，括號中的數字表示可接受的范圍碌b酸鈉12g/L(11-13);KC10.5g/L(0.45-0,55);MgS04'7H202g/L(1.8-2.2);HodagK-60消泡劑0.35g/L(0.3-0.4);K2S040.65g/L(0.60-0,70);KH2P04lg/L(0.9-1.1);(NH4)2S04lg/L(0.95-1.1);CaCl2*2H200.17g/L(0.15-0.19);95DE玉米糖漿(以固體計)4.5g/L(2-10);MnCl2'4H203mg/L(2.7-3.3);ZnS04'7H203mg/L(2.7-3.3);CoCl2'6H200.04mg/L(0.035-0.045);Na2Mo04'2H200.04mg/L(0-0.045);CuS04'5H202mg/L(1.8-2.2);NiS04'6H202mg/L(1.8-2.2);FeS04'7H2010mg/L(9-ll);硫胺素9.5mg/L(4-15);維生素BI20.15mg/L(0.05-0.25)和泛酸4丐3.2mg/L(1.3-5.1)。此外，28%NH4OH溶液用作氮源。干微生物的灰分量約為6%重量^[分。實施例4'本實施例用于闡明14000加侖規模的發酵培養基中溶氧水平降低對微生物生產力的影響。采用實施例3所述方法，利用5Wz/zoc/^n'ww野生型菌抹進行標稱體積為14000加侖的發酵，所述菌4朱是用上述美國專利5340594和5340742公開的分離方法得到的。在前24小時發酵培養基中的溶氧水平為約8%,在第24到40小時約為4%,從第40小時到發酵過程終止約為0.5%。表4顯示了發醇過程中此低溶氧水平的結果。表4:在降低的溶氧濃度下14000加侖規模的Schizochytrium補料分批發酵的結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例5本實施例闡明41000加侖規模的發酵培養基中低溶氧水平對微生物生產力的影響。除了發酵在41000加侖的發醇罐中進行外，采用與實施例4相同的方法。增加培養液體積以在此規模下維持目標化合物的濃度。實驗結果顯示于表5。表5:Sc/^oc/^nim的41000加侖規模發酵<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例6本實施例闡明額外的氮對本發明的發酵過程的影響采用與實施例4近似的方法進行4組250L規模的補料分批培養實驗。進行兩組對照實驗和兩組含有額外的氨(1.15x和1.25x標稱量)的實驗。實驗結果顯示于表6中。表6:額外的氨對&/z/zoc/^n'ww發酵的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>通常，額外的氮對發酵效能有負面影響，在加入了額外的氨的兩批中DHA生產力顯著降低。如表6所示，對照批次的最終DHA水平占總細胞干重的18.4%和22.1%，額外供應了氨的批次為9.2。/。(1.15x氨)和12.6%(1.25x氨)。實施例7本實施例顯示本發明發酵方法的動力學特征(profile)。采用與實施例4近似的方法進行1000加侖規模的補料分批培養實驗。表7表示了發酵過程的動力學特征。表7:1000加侖規模的Sc/^ocA^n'wm4卜料分批發酵的動力學特征<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*在48小時的時候分析了兩個不同的樣品。"這是洗過的細胞干重(DCW)樣品。其它的值是未洗過的樣品的。實施例8本實施例闡明了碳源的量對生產力的影響。采用實施例4的方法以不同的碳源的量進行了三批不同發酵實驗。結果如表8所示。表8:不同碳源量對Sc/n'zoc/^n'ww發酵的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例9本實施例闡明營養限制對碳轉化為生物量，脂質并特別是DHA的轉化效率的影響。為了研究營養限制的影響，在2升Applikon發酵罐中對5"c/n'zoc/^r/wm菌抹ATCC20888進行連續培養實驗，基本生長培養基(ICM-2)由下列化合物組成(標定濃度)I組成分Na2S04(18.54g/L),MgS04*7H20(2.0g/L)和KC1(0.572g/L);II組成分(每一個單獨制備)葡萄糖(43.81g/L)，KH2P04(1.28g/L),CaCl2'6H20(0.025g/L)和(NH4)2S04(6.538g/L);III組成分Na2EDTA(6.0mg/L)，FeCl3'6H20(0.29mg/L),H3B03(6.84mg/L),MnCl2'4H20(0.86mg/L)，ZnS04*7H20(0.237mg/L)，CoCl2'2H20(0.026mg/L),Na2Mo04'2H20(0.005mg/L)，CuS04'5H20(0.002mg/L)和MS04'6H20(0.052mg/L);和IV組成分鹽酸硫胺素(0.2mg/L),維生素B12(0.005mg/L),泛酸鈣(0.2mg/L)。加入到發酵罐之前，I和II組高壓滅菌，III和IV組過濾除菌。用Sc//zoc/^n^m接種生長培養基，在30。C，pH5.5，溶氧為20%飽和度的控制條件下生長直到達到最大細胞密度。通過以足以維持稀釋速率為0.06hr"的流量泵入無菌ICM-2進料培養基到發酵罐并同時移出含5"c/z/zoc/^n'Mm細胞的培養液進行連續模式操作，直到達到穩定狀態。為觀察營養限制的影響，減少ICM-2進料培養基中的含有特定所需營養的化合物，使該營養成分在含細胞的出口培養液中耗盡，這樣由于該特定所需營養的缺乏，細胞生長受到限制。一旦確立每一條件的穩定狀態的操作，就測定最終培養液的干生物量，殘余葡萄糖，限制性營養濃度，細胞脂質含量和細胞DHA含量。用葡萄糖總耗量除以所得干生物量的總量，計算出葡萄糖轉化為生物量的轉化效率，以百分比表示。對列于下表中的每一營養成分重復進行此實驗，研究每一營養成分限制生長的效應。最終結果列于下表中。表9:營養限制對5b/n'zoc/^Wwm菌抹的生物量產量，轉化效率(葡萄糖—生物量)，脂質含量和DHA含量的影響。_<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>1.干生物量濃度(g/L)2.產量系數(％產生的生物量/消耗的葡萄糖)3.培養液中的殘余葡萄糖濃度(g/L)4.干生物量中的脂質含量(g脂質(以FAME計)/g干生物量)5.干生物量中的DHA含量(gDHA/g干生物量)表中清楚地顯示，氮限制導致DHA在細胞中的積累最多，然后是磷酸鹽，鈉，鎳，錳，葡萄糖(碳源)，鋅和鐵。該信息可用于商業，即將這些營養成分中一種或多種以足以限制細胞生長的速度加入到分批發酵中。在最優選的情況下，將氮以限制性方式加入到分批發酵中，以使細胞中的DHA量達到最高水平。其它營養成分(或其混合物)可以限制性方式加入以最大化生物量或其它有價值產物的產量。其它沒有評價的生物學必需成分，如硫，也可用作這種發酵控制策略中的限制性營養。本發明，在各種實施方案中，包括基本如本文記述的組分，方法，工藝過程，系統和/或裝置，它們包括各種實施方案，其進一步組合與集合。本領域技術人員在了解本發明后能理解如何實施和應用本發明。本發明，在各種實施方案中，包括提供沒有在此或各實施方案中記述的項的裝置和方法，包括那些可能已在以前的裝置或方法中采用的項，例如為改進效果，減輕勞動和/或降低實施成本而采用的項。出于闡述和說明的目的提供本發明的上述討論。上述內容不打算限制本發明于本文所公開的形式。盡管本發明的說明已經包括一種或多種實施方式和某些變化與修飾的說明，不過其他變化與修飾也在本發明的范圍內，例如在理解了目前的/^開內容后，可以在本領域的4支術與知識范圍內作出這些變化和修飾。本發明打算獲得包括替代實施方式的權利至這樣一種程度，包括與所要求保護的那些可交替、互換和/或等價的結構、功能、范圍或步驟，無論本文是否公開這類可交替、互換和/或等價的結構、功能、范圍或步驟，并且不打算以公眾名義貢獻任何可授予專利權的主題。保藏材料以下材料保藏于美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>權利要求1.一種從真核微生物生產含有多烯脂肪酸的脂質的方法，所述微生物能產生至少占其生物量約20％的脂質，該方法包括向含有所述微生物的發酵培養基中以足以提高該發酵培養基生物量密度到至少約100g/L的速率加入非醇碳源和限制性營養源。2.培養能生產占其生物量的20%為脂質的真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發酵培養基中添加碳源和限制性營養源，添加的速率足以提高該發酵培養基的生物量密度到至少約100g/L，其中該方法生產脂質的速度至少平均約為0.5g/L/hr,所述微生物產生的總脂質中至少約15%是多不飽和脂。3.培養真核微生物的方法，包括向包含所述微生物的發酵培養基中添加碳源和限制性營養源，添加的速率足以提高該發酵培養基的生物量密度到至少約100g/L,其中所述微生物選自藻類，真菌(包括酵母)，原生生物，細菌或其混合物，其中所述微生物能生產占其生物量至少約20%的包含多烯脂肪酸的脂質。4.一種生產真核微生物脂質的方法，包括(a)在發酵培養基中培養真核微生物以便將該發酵培養基的生物量密度提高到100g/L;(b)提供足以使所述微生物生產所述脂質的發酵條件；和(c)回收所述脂質，其中所述脂質的多于約15%是多不飽和脂。5.—種生產真核微生物脂質的方法，包括(a)向包含所述微生物的發酵培養基中加入非醇碳源和限制性營養源；(b)提供足以使所述微生物生產所述微生物脂質的條件；和(c)回收所述微生物脂質，其中所述微生物脂質的至少約15%為多不飽和脂。6.—種生產真核微生物脂質的方法，包括(a)在含有真核微生物的發醇培養基中添加碳源和限制性營養源，并提供足以將該發醇培養基中溶氧水平維持在至少約4%的條件，以便產生至少約100g/L的生物量密度；(b)提供足以將該發醇培養基中溶氧水平維持在約1%或更低水平的條件，并提供足以使所述微生物生產所述脂質的發酵條件；和(c)回收所述脂質，其中所述微生物脂質的至少約15%是多不飽和脂。7.—種富集微生物的多烯脂肪酸含量的方法，包括在溶氧水平低于10%的生長培養基中發酵所述微生物。8.—種生產產物和微生物的異養方法，包括a.在生長培養基中培養所述微生物，所述微生物中包含聚酮化合物合成酶基因；和b.保持溶氧水平低于10%。全文摘要本發明涉及通過在發酵罐中高密度培養真核微生物來增加含有多烯脂肪酸的脂質的產生。本發明提供了培養真核微生物的方法，所述微生物可以生產脂質，具體是含有多烯脂肪酸的脂質。本發明還提供了生產真核微生物脂質類的方法。文檔編號C12N1/12GK101519677SQ200910133079公開日2009年9月2日申請日期2001年1月26日優先權日2000年1月28日發明者喬恩·M·漢森,喬治·T·維德爾第三,克雷格·M·魯克爾,唐·迪馬西,塔茨奧·卡奈科,威廉·R·巴克利,彼得·J·米拉索爾,理查德·B·貝利申請人:馬泰克生物科學公司