臨床體外酶法鉀測定試劑的制作方法

專利名稱：：臨床體外酶法鉀測定試劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫用體外生化診斷試劑領域，特別是涉及一種應用酶動力學原理的臨床體外酶法鉀測定試劑。
背景技術：
：人體血清中鉀的含量的測定是臨床體外診斷測定項目之一，也是臨床常規和急診診斷中不可缺少的項目。血清鉀高于參考值上限，多見于腎上腺皮質功能減退。特別危重患者，血清鉀上升至8mmol/L,患者將出現心律失常等癥狀，嚴重時甚至可能超過10mmol/L,患者可能發生心室纖顫。血清鉀低于參考值下限，多見于腎小管疾病，出現嚴重腹瀉、嘔吐、腎上腺皮質功能亢進等癥狀。目前醫院測定血清鉀多使用離子選擇電極法(ISE)。其電極是對鉀專一性強的纈霉素膜，是比較理想的測定血清或尿中鉀離子濃度的方法。纈霉素膜專一性強，但使用壽命短，一般三個月左右就要更換一次。酶法測定鉀是上世紀80年代末由Beny、MN等人提出的。它是利用K+是丙酮酸激酶的激活劑的原理，建立起酶法測定血清鉀的基本反應。隨后德國B.M.公司正式推出酶法的鉀測定試劑盒，并在全世界和中國市場上銷售，受到醫院的歡迎。酶法鉀測定試劑盒的優點是可利用分光光度計原理，在全自動生化分析儀上進行測定，不需再購置和維護離子選擇設備，操作方便，節省開支。酶法的測定結果與離子選擇電極法等效，是醫院值得選擇的測定鉀的理想方法。
發明內容臨床體外酶法測定鉀的方法，包括如下步驟(1)尿素氨基水解酶(Ureaamidolyase簡稱UAL;EC3.5.1.45)在三磷酸腺苷(ATP)、HCCV、Mg+參與下，水解尿素(Urea)生成NH/、HC(V、二磷酸腺苷(ADP)和磷(Pi)，其反應式如下UALUrea+ATP+HC03>H20^ADP+Pi+HC03>NH4++OH(I)Mg2+K+(2)生成的NHZ加上a-酮戊二酸、還原型輔酶I(NADH)在谷氨酸脫氫酶(GLDH)的作用下生成谷氨酸鹽(Glutamate)和輔酶l(NAD+)，反應式如下GLDHNH4十+NADH+a-酮戊二酸^Glutamate+NAD十(II)(3)根據K+的濃度與K+的激活速率成正比，而K+的激活濃度與反應式(II)的NADH下降速率成正比，在340nm波長下測定NADH的下降速率，由NADH下降速率推出激活劑K+的濃度。本發明的主要貢獻是依據以上反應原理和方法，經過大量的實驗研究，將其開發為真正可操作的、測定精度高、可大規模生產的適用于臨床診斷和常規檢查的臨床體外酶法鉀測定試劑。本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑，尿素氨基水解酶(UAL)谷氨酸脫氫酶(GLDH)尿素(Urea)三磷酸腺苦(ATP)碳酸氬鈉(NaHC03)其主要試劑成分包括0.100.40u/ml，20.0~80.0u/ml，20.040.0mmol/L,1.0~3.0mmol/L,10.0~15.0mmol/L，5硫酸鎂(MgS04)還原輔酶I(NADH)a-酮戊二酸乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)疊氮化鈉(NaN》0.300.50mmol/L10.020.0mmol/L0.30~0.45mmol/L0.10.2g/L。.010.0mmol/L在實際生產過程中，本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑，其特征在于所述試劑是雙試劑，包括第一試劑部分(Rl)和第二試劑部分(R2),尿素氨基水解酶、谷氨酸脫氫酶、尿素、三磷酸腺苷、碳酸氫鈉、硫酸鎂、a-酮戊二酸、還原型輔酶I、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸和疊氮化鈉分別存在于第一試劑部分(Rl)或第二試劑部分(R2)中，其中，所述尿素氨基水解酶、谷氨酸脫氫酶以及三磷酸腺香、硫酸鎂和尿素三種組分中的任意一種或兩種同時存在于第一試劑部分(Rl)或第二試劑部分(R2)中，對乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸、碳酸氫鈉、還原型輔酶I、a-酮戊二酸和疊氮化鈉沒有限定，既可存在于第一試劑部分(Rl)中，也可存在于第二試劑部分(R2)中。所述第一試劑部分(Rl)的緩沖液為咪唑、三羥曱基氨基甲烷(Tris)和嗎啉代丙烷磺酸(Mops)中的任意一種，所述緩沖液的濃度為0.050.2mol/L，pH6.0~8.0,精度±0.1(25°C)。所述第一試劑部分的緩沖液優選Mops。所述第二試劑部分(R2)的緩沖液為咪唑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和嗎啉代丙烷磺酸(Nfops)和純水中的任意一種，所述緩沖液的濃度為0.005~0.02mol/L,pH7.0-8.5,4青度±0.1(25°C)。所述第二試劑部分的緩沖液優選Mops。所述雙試劑為干粉劑型或凍干劑型試劑。所述第一試劑部分(Rl)和第二試劑部分(R2)中還分別包括填充劑，所述填充劑為甘露醇、牛血清白蛋白和Dextran-5000的任意一種或三種的混合，其含量范圍為110g/100ml。6本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑可上全自動生化分析儀測定，選擇二點動力學方法，延長時間選擇1-5分鐘，以便充分去除內源性NH4+。測定時間選擇1-4分鐘，所用標準采用雙標準法(3mmol/L;6mmol/L)。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑，包括如下濃度的組分0.10-0.40u/ml的尿素氨基水解酶UAL，20.0-80.0u/ml的谷氨酸脫氫酶GLDH，20.0-40.0mmol/L的尿素Urea，1.0—3.0mmol/L的三磷酸腺苷ATP，10.0—15.0mmol/L的碳酸氫鈉NaHC03,5.0—10.0mmol/L的硫酸鎂MgS04,10.0—20.0mmol/L的a-酮戊二酸，0.30—0.45mmol/L的還原輔酶I,0.30—0.50mmol/L的乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸EGTA,0.1~0.2g/L的疊氮化鈉NaN3。在實際生產過程中，本發明的臨床體外診斷鉀測定試劑是雙試劑，包括第一試劑部分(Rl)和第二試劑部分(R2),尿素氨基水解酶水解酶、谷氨酸脫氫酶、尿素、三磷酸腺苷、碳酸氫鈉、硫酸鎂、a-酮戊二酸、還原型輔酶I、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸和疊氮化鈉分別存在于第一試劑部分Rl或第二試劑部分R2中，其中，尿素氨基水解酶、谷氨酸脫氫酶以及三磷酸腺苷、硫酸4美和尿素三種組分中的任意一種或兩種同時存在,既可存在于第一試劑部分Rl，也可以存在于第二試劑部分R2中。對乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸、碳酸氫鈉、還原型輔酶I、a-酮戊二酸和疊氮化鈉沒有限定，既可存在于第一試劑部分(Rl)中，也可存在于第二試劑部分(R2)中。1.本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑的配制分為以下步驟(l)第一試劑部分Rl的配制在配置過程中，第一試劑部分Rl;故分解成濃縮液Rla和緩沖液Rlb分別配制。①濃縮液Rla的配制:主要成分UAL130UGLDH30000U牛血清白蛋白50mgDextran-500050mg以上成分溶于50ml的M叩s(0.1mol/L，pH7.3±0.1,25。C)中，待完全溶解后，分裝在50個容積為10ml的試劑瓶中，每瓶lml，上凍干機冷凍干燥24小時，得到的Rla是凍干粉型試劑。②緩沖液Rlb的配制主要成分a-酉同戊二^3700mgATP1700mg尿素1150mgNaHC031300mgEGTA270mgNaN350mg以上成分溶于500ml的Mops(0.1mol/L，pH7.3±0.1,25°C)中，待完全溶解后，分裝在50個容積為10ml的試劑瓶中，每瓶10ml，2-S。C保存，得到的Rlb是液態試劑。(2)第二試劑部分R2的配制在配置過程中，第二試劑部分R2#1分解成濃縮液R2a和緩沖液R2b分別配制。①濃縮液R2a的配制主要成分NADH300mg牛血清白蛋白50mgDextran-500050mg以上成分溶于50ml的M叩s(0.01mol/L,pH8.0±0.1，25。C)中，待完全;;容解后，分裝在50個容積為10ml的試劑瓶中，每瓶1ml,上凍干機冷凍干燥24小時，得到的R2a是凍干粉型試劑。②緩沖液R2b的配制主要成分MgS042000mgNaN350mg以上成分溶于500ml的Mops(0.01mol/L，pH8.0±0.1，25。C)中，待完全溶解后，分裝在50個容積為10ml的試劑瓶中，每瓶10ml，2-8'C保存，得到的R2b是液態試劑。在臨床檢測時，將Rla與Rib混合至完全溶解，即可得到第一試劑部分Rl;將R2a與R2b混合至完全溶解，得到第二試劑部分R2。2.上機測定參數本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑可上全自動生化分析儀測定，選擇二點動力學方法，延長時間選擇l-5分鐘，測定時間選擇l-4分鐘，所用標準采用雙標準法(3mmol/L;6mmol/L)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試劑1無緩沖普通測定用量160試劑2普通測定用量160試劑3普通測定用量0點1.2211-317秒3.利用本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑的血清鐘的測定結果(1)批內精密度用本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑，重復測定定值質控血清21次，測定結果如下表1所示。表l同批次試劑的血清鉀的測定結果序號測定值14.42024.3824.41344.2424.25464.42474.46284.41094.313104.401114.389124.294134.317144.323154—329164.162174.230184.368194.421204.278<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(3)線性特性用接近線性范圍上限的高濃度標準和接近線性范圍下限的低濃度標準，混合成5個稀釋濃度，用本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑分別測定稀釋濃度樣品，求出回歸方程和相關系#t。表3本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑的測定結果與標準值的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>圖1是根據表3的結果繪制的線性圖。由圖l得知線性方程為y=1.0275x+0.001,R2=0.9974(4>^目關小生表4是本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑與上市公司Randox的鉀測定試劑同時測定50例人血清，求出回歸方程和相關系凄史。表4相關性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由圖2得知線性方程為y=1.0561x-0.2006，R2=0.9876以上所得性能指標結果均達到中華人民共和國衛生行業標準WS/T124-1999規定要求。與RANDOX相關實驗證明本發明的臨床體外酶法鉀測定試劑與RANDOX公司的產品等效。權利要求1.臨床體外酶法測定鉀的方法，包括如下步驟(1)尿素氨基水解酶(UAL)在三磷酸腺苷(ATP)、HCO3-、Mg+參與下水解尿素(Urea)生成NH4+、HCO3-、二磷酸腺苷(ADP)和磷酸(Pi)，其反應式如下(2)生成的NH4+加上α-酮戊二酸、還原型輔酶I(NADH)在谷氨酸脫氫酶(GLDH)的作用下生成谷氨酸鹽(Glutamate)和輔酶I(NAD+)，反應式如下(3)根據K+的濃度與K+的激活速率成正比，而K+的激活濃度與反應式(II)的NADH下降速率成正比，在340nm波長下測定NADH的下降速率，由NADH下降速率推出激活劑K+的濃度。2.利用權利要求1的方法的臨床體外酶法鉀測定試劑，其主要試劑成分包括:尿素氨基水解酶(UAL)谷氨酸脫氫酶(GLDH)尿素(Urea)三磷酸腺苷(ATP)碳酸氫鈉(NaHC03)硫酸鎂(MgS04)還原型輔酶I(NADH)a-酉同戊二酉吏0.100.40u/ml,20.0~80.0u/ml，20,0~40.0mmol/L,1.03.0mmol/L,10.015.0mmol/L，5.010.0mmol/L，0.300.45mmol/L,10.020.0mmol/L，乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)0.30~0.50mmol/L，疊氮化鈉(NaN3)0.1~0.2g/L。3.根據權利要求1或2所述的臨床體外酶法鐘測定試劑，其特征在于所述試劑是雙試劑，包括第一試劑部分(Rl)和第二試劑部分(R2),尿素氨基水解酶、谷氨酸脫氫酶、尿素、三磷酸腺苷、碳酸氫鈉、硫酸鎂、a-酮戊二酸、還原型輔酶I、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸和疊氮化鈉分別存在于第一試劑部分(Rl)或第二試劑部分(R2)中，其中，所述尿素氨基水解酶、谷氨酸脫氫酶以及三磷酸腺苷、硫酸鎂和尿素三種組分中的任意一種或兩種同時存在于第一試劑部分(Rl)或第二試劑部分(R2)中，乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸、碳酸氫鈉、還原型輔酶I、a-酮戊二酸和疊氮化鈉分別存在于第一試劑部分(Rl)或第二試劑部分(R2)中。4.根據權利要求3所述的臨床體外酶法鉀測定試劑，其特征在于所述第一試劑部分(Rl)的緩沖液為咪唑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和嗎啉代丙烷石黃酸(Mops)中的任意一種，所述緩沖液的濃度為0.050.2mol/L，pH6.08.0,精度土O.l,25°C。5.根據權利要求3所述的臨床體外酶法鉀測定試劑，其特征在于所述第二試劑部分(R2)的緩沖液為咪唑、三羥曱基氨基曱烷(Tris)和嗎啉代丙烷石黃酸(Mops)和純水中的任意一種，所述緩沖液的濃度為0.0050.02mol/L,pH7.0~8.5,精度土O.l，25°C。6.根據權利要求3所述的臨床體外酶法鉀測定試劑，其特征在于所述雙試劑為干粉劑型或凍干劑型試劑。7.根據權利要求6所述的臨床體外酶法鉀測定試劑，其特征在于所述第一試劑部分(Rl)和第二試劑部分(R2)中還分別包括填充劑，所述填充劑為甘露醇、牛血清白蛋白和Dextran-5000中的任意一種或三種的混合，其含量范圍為l10g/100ml。全文摘要尿素氨基水解酶(UreaamidolyaseUAL；EC3.5.1.45)在ATP、HCO₃^-、Mg⁺參與下，水解尿素生成NH₄⁺、HCO₃^-、ADP和Pi。K⁺是UAL酶的激活劑，其激活速度與K⁺濃度成正比。偶聯一個輔助反應，將UAL酶生成的NH₄⁺與α-酮戊二酸、NADH和谷氨酸脫氫酶(Glutamatedehydrogenase，GLDH)反應，生成谷氨酸鹽和NAD⁺，在340nm波長下，NADH的下降速率與K⁺的濃度成正比。通過NADH下降速率求出K⁺的濃度。本發明將以上反應實際應用到臨床體外測定鉀試劑中，并提出最佳雙試劑成份組成，使得試劑穩定性、準確度和精密度達到最理想狀態。文檔編號C12Q1/32GK101514357SQ20091013149公開日2009年8月26日申請日期2009年4月1日優先權日2009年4月1日發明者朱以桂,朱小暉申請人:北京瑞正善達生物工程技術有限公司