檢測慢性粒細胞白血病的單鏈dna適配子及其制備方法

專利名稱：：檢測慢性粒細胞白血病的單鏈dna適配子及其制備方法專利說明本發明屬生物醫學領域，特別是生物檢測技術。具體涉及一種利用分子生物學SELEX技術設計的能夠特異性檢測人慢性粒細胞白血病的高親和力單鏈DNA適配子及其制備方法。
背景技術：
：白血病(Leukemia)是一種起源于骨髓多能造血干細胞的惡性增殖性疾病。在我國，白血病被列為十大高發性腫瘤之一，約占腫瘤總發病率的5%左右。其死亡率占我國腫瘤男性第6位、女性第8位，在兒童及青少年中占第1位。慢性粒細胞性白血病，簡稱慢粒(chronicmyelognousleukemia,CML)，是臨床上一種起病及發展相對緩慢的白血病，表現為髓系祖細胞池擴展，髓細胞系及其祖細胞過度生長。我國的CML發病率調查結果為年發病率36/10萬，在我國CML約占各類白血病的20%，占慢性白血病的95%。發病年齡分布較廣，但發病率隨年齡的增長有逐步上升的趨勢。臨床上白血病的診斷主要依靠血象、骨髓象、細胞化學染色以及用流式細胞儀檢測白血病細胞抗原，但是血象檢查無特異性，骨髓穿剌具有一定的風險性，且技術要求較高，細胞化學染色結果受影響的因素較多，如試劑、每個實驗人員判斷標準等，使結果相差很大，流式細胞儀檢測價格昂貴，不能作為常規體檢的項目對白血病進行人群普查。臨床上現有的檢測手段診斷出的白血病均已屬晚期，如能早期診斷，無論化療或放療，治療效果非常顯著，癥狀、體征可完全消失，血象、骨髓象恢復正常或接近正常。因此白血病的早期診斷成為亟待解決的問題。利用SELEX技術篩選出靶細胞特異性適配子，從而建立白血病的早期特異性檢測技術方法。SELEX技術(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment指數富集的配基系統進化技術)是20世紀90年代初研制的一種新的組織化學技術，其基本思想是體外構建一個大容量單鏈寡核苷酸文庫，并與靶物質混合，形成靶物質與核酸的復合物，洗掉未與靶物質結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸，并以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下一輪的篩選過程。通過重復的篩選與擴增，最后得到特異性強、親和力高的寡核苷酸適配子(aptamers)，具有庫容量大、耙物質范圍廣、親和力高、特異性強等優點，已成功應用于多種靶物質的篩選，除用于核苷酸序列、蛋白質、氨基酸(L-精氨酸)夕卜，還可用于染料、金屬離子、藥物小分子(如茶堿)、生長因子、肽鏈、類固醇、糖類，甚至可用于完整的細胞、病毒、孢子和朊病毒等。這種方法具有簡便、快速、經濟等特點，與其他化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具有更高的親和力和特異性，具有良好的應用前景。目前通過此技術篩選到的靶物質有200多種，篩選出的適配子在疾病的診斷、治療與藥物的快速開發等方面起著重要作用。目前，在國內利用SELEX技術篩選特異性適配子方面的研究很多，但是在白血病適配子的開發上還是空白，而且在國外發表的文獻僅報道了以急性粒細胞白血病細胞、急性T細胞型淋巴母細胞白血病為材料篩選適配子的方法，然而在慢性粒細胞白血病適配子的制備上沒有任何報道。因此本實驗篩選出的DNA適配子可以填充空白，而且為慢性粒細5胞白血病的診斷、治療等提供科學依據和實驗基礎。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠特異性結合慢性粒細胞白血病細胞的DNA適配子，該DNA適配子為診斷和治療慢性粒細胞白血病提供了新的方法，為克服臨床上現在不能做到早期診斷、早期治療的問題，提供了新的解決途徑。本發明的另一目的是提供一種制備能夠和慢性粒細胞白血病細胞高親和力特異性結合的DNA適配子的方法，該方法包括隨機單鏈DNA文庫和引物的構建、PCR擴增、生物素_鏈霉親和素磁珠分離制備次級文庫、SELEX篩選、人中性粒細胞反篩、一級二級結構的分析、適配子親和力特異性的測定。本發明的有益效果是能特異性的結合慢性白血病K562細胞上，而與其他細胞的結合率很低，因此該DNA適配子經修飾可檢測和治療慢性粒細胞性白血病。因為采用了新的組合化學技術-SELEX技術進行慢性粒細胞性白血病的DNA適配子的篩選，確保了獲得的DNA適配子可特異性結合在慢性粒細胞性白血病細胞上，從而檢測和治療慢性粒細胞性白血病。另外，本發明制備的DNA適配子為小分子核酸，其分子結構不同于任何使用的檢測物質，且只高親和力結合慢性粒細胞，對其他細胞并無危害；該DNA適配子也有別于傳統的抗體，其分子量小，可快速滲入，經修飾后作為治療藥物攜帶體，無抗原性，不引起副作用。圖1表示不同循環的PCR產物3%瓊脂糖電泳圖；圖1中1-5分別代表9、12、15、18、21個循環PCR產物；M代表100bpDNAMarker;箭頭指示為目的條帶。圖2表示部分SELEX篩選的PCR產物3%瓊脂糖電泳圖；圖2中l-5分別代表第1、4、7、10、13輪篩選的PCR產物;M代表100bpDNAMarker;箭頭指示為目的條帶。圖3表示部分SELEX篩選的產物結合率所測吸光度A值圖；圖3中橫坐標為篩選輪數，縱坐標為吸光度A值。圖4為感受態DH5a轉化率的測定圖；圖5為重組體轉化大腸桿菌DH5aa互補篩選圖；圖6為DNA適配子的二級結構預測圖。具體實施例方式材料與方法—、實驗材料1.2細胞和菌株慢性粒細胞白血病K562細胞株；大腸桿菌DH5a。1.3克隆載體克隆載體pGEM-T購自Promega公司，1.4主要試劑及試劑盒1.4.1PCR試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；1.4.2PCR產物純化試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；1.4.3UNIQ-10柱式DNA膠回收純化試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；1.4.4lOObpDNAmarker:購自西安舟鼎國生物技術有限公司；1.4.5人中性粒細胞提取液購自西安舟鼎國生物技術有限公司；1.4.6生物素_鏈霉親合素磁珠及磁力架購自Promega公司；1.4.7pGEM-T載體和T4DNA連接酶購自Promega公司；1.4.8小牛血清購自杭州四季青公司；1.4.9氨芐青霉素(Amp):購自華美生物工程公司；1.4.10溴化乙錠(EB):購自華美生物工程公司；1.4.11Agarose(瓊脂糖)德國進口分裝；1.4.12IPTG:Promega產品分裝；1.4.13X-gal:美國進口分裝;1.4.14胰蛋白胨英國Oxoid公司產品；1.4.15酵母提取物英國Oxoid公司產品；1.4.16Agar(瓊脂)日本進口分裝；1.4.17ATP:購自華美生物工程公司；1.4.18CaC12:購自北京化學試劑公司；1.4.19Tris:購自上海新興化工試劑研究所；1.4.20EDTA:購自北京化學試劑公司；1.4.21BSA(牛血清蛋白)購自西安舟鼎國生物技術有限公司公司；1.4.22酚氯仿異戊醇(25:24:i):購自上海生工生物技術有限公司；1.4.23質粒小提試劑盒天根生化科技有限公司；1.5主要試劑及配制1.5.1RPMI-1640的制備:取10.4g1640干粉溶于800ml新鮮三蒸水，磁力攪拌2h，加2gNaHC03再攪拌4h，加青、鏈霉素各io萬u，定容至1L，過濾除菌并分裝到若干個小瓶，4t:冰箱保存備用。1.5.2血清的滅活1瓶小牛血清在56t:水浴中滅活35min，消除補體活性，分裝到數個小瓶，-2(TC保存備用。1.5.3谷氨酰胺貯存液谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，_201:保存，使用時向100ml培養液中加入lml谷氨酰胺溶液。1.5.4完全培養基的制備90mlRPMI-1640液體培養基中加入10ml滅活的小牛血清，制成含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養基。1.5.5D-hank，s液的配制稱取NaCl8.OOg，KCl0.4g，Na2HP0412H200.134g，KH2P040.06g，NaHC030.35g，酚紅0.02g溶于900ml三蒸水中，7.4%NaHC03pH值到7.2-7.4，容量燒瓶定容到1L，在1.034X105Pa高壓下蒸汽滅菌20min，4t:冰箱保存備用。1.5.60.Olmol/L，pH7.4PBS的配制:稱取NaCl8.Og，KC10.2g，Na2HP0412H203.628g，KH2P040.24g溶于900ml三蒸水中，容量燒瓶定容到IL，在1.034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20min，4"C冰箱保存備用。1.5.70.5mol/L的EDTA(pH8.0)的配制:在800ml雙蒸水中加入EDTA-Na22H20186.lg，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用lmol/LNaOH調節溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌放于4"C冰箱保存備用。1.5.8pH8.0的TE緩沖液的配制:吸取lmol/L的Tris-Cl(pH8.0)lOml，O.5mol/L的EDTA(pH8.0)2ml，加入800ml的雙蒸水，調節pH至8.0，定容至1000ml，分裝后高壓滅菌，4t:冰箱保存備用。1.5.9溴化乙錠(EB)的配制在10ml雙蒸水中溶解0.lg的溴化乙錠，磁力攪拌3h使其溶解，分裝后用鋁箔包裹容器，4t:冰箱保存備用。1.5.105XTBE的配制稱取54gTris堿加入27.5g硼酸和20ml0.5mol/LEDTA(pH8.O)，加入雙蒸水定容至lL，4t:冰箱保存備用。1.5.116X上樣緩沖液的配制稱取2.5mg的溴酚藍和4g的蔗糖用雙蒸水溶解后定容至10ml，4"冰箱保存備用。1.5.123%瓊脂糖凝膠的配制1.5g瓊脂糖+50ml電泳緩沖液，在微波爐中加熱30s至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至5(TC時加入10mg/ml溴化乙錠1.25ul，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后使用。1.5.133XBSA的配制3g牛血清蛋白(BSA)溶于100mlPBS中，4"冰箱保存備用。1.5.142X結合緩沖液的配制50mMTrisHCl，5mMKCl，100mMNaCl，lmMMgCl2，調節pH7.4。1.5.152X洗滌緩沖液的配制將0.lmlTween20溶液加入100ml滅菌pH7.4的PBS緩沖液中，充分混勻，4°C冰箱保存備用。二、實驗方法2.1慢性粒細胞白血病K562細胞的培養用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液置于37"、飽和濕度、5%C02的培養箱內培養。隔天傳代一次。2.2隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫及引物以下隨機ssDNA文庫和引物均委托上海生工生物技術有限公司合成。2.2.1隨機ssDNA文庫構建了長度為88nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間52個核苷酸為隨機序列，庫容量大約為1016，合成量為20D26。。將合成庫加入22ii1的三蒸水配制成100iiM貯存液-2(TC儲存備用。合成的序列如下5'-ATACCAGCTTATTCAATT-52-nt-AGATAGTAAGTGCAATCT—3'此外還合成了一個標準品(5'_FITC-88nt-3')，測定結合率時用。2.2.2引物合成以下5種引物，無任何二級結構形成，與核酸序列中已有的核酸序列無同源性。引物序列如下PI5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3'P25，-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3，P35，-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3，P45，-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3，P55，-AGATTGCACTTACTATCT-3'弓|物PI和P5分別對應于隨機ssDNA庫的兩端固定序列，利于在PCR反應時退火延伸；引物P4用生物素標記，在用生物素-鏈霉親和素磁珠分離DNA雙鏈為單鏈時使用；引物P2、P3分別用熒光素和地高辛標記，在測定結合率時使用。以上5種引物合成量均為50D26。，每0D的引物加57ii1的三蒸水配制成100yM貯存液-2(TC儲存備用。2.3SELEX技術篩選K562細胞的適配子2.3.1SELEX篩選過程(l)lOiig的隨機ssDNA文庫加到400iU2X結合緩沖液中，于1.5ml微量離心管中99"變性5min，然后立即置于(TC冰上10min;(2)加入3%BSA13.5降低背景；(3)將lX10e個人慢性粒細胞性白血病K562細胞加到上述溶液中混勻，37t:水浴30min;(4)更換離心管，去除與管壁結合的ssDNA;(5)3000rpm離心5min，去上清，加入400iU結合緩沖液混勻再3000rpm離心5min，反復6次;(6)最后所得沉淀加入100ii1ddH20，IO(TC加熱10min;(7)10000rpm離心5min，取上清，經酚氯仿抽提，乙醇沉淀，將ssDNA溶解于20iilTE緩沖液中。2.3.2PCR擴增將上述篩選過程得到的ssDNA用上游引物Pl和下游生物素標記的引物P4經PCR擴增成一端帶生物素的dsDNA。PCR反應體系為模板mii1，lOXPCRButter5iil，MgCl23iil，dNTPs5iU，TaqDNA多聚酶2U，上游引物、下游5'端生物素標記的引物各25pmol，加去離子水至50yl;PCR反應條件為94t:預變性2min，然后進行n個循環94。C的變性30s，45。C退火lmin，72。C延伸30s，最后72。C延伸5min。PCR反應體系如下10XPCRButter5pidNTPs5^1MgCl23^1上游引物25pmol下游5'端生物素標記的引物25pmol模板mpiTaqDNA多聚酶2U去離子水upto50^1m為模板量，隨著篩選輪數的增加而不斷變化，具體數值見表1;n為循環次數，隨著篩選輪數的增加而不斷變化，具體數值表l。為了盡可能多地捕獲適配子，在開始幾輪篩選過程中，ssDNA文庫和細胞量投放很多；在隨后的幾輪篩選中，由于高特異性的適配子已經富集，為了提高篩選的嚴謹性，結合時間由30min減少到20min;模板量也由2y1減少到0.5;然而PCR循環數卻由原來的11個循環增加到16個循環；具體數值見表1。表113輪篩選所加細胞、ssDNA文庫、結合時間、PCR循環數和模板量表輪數細胞量ssDNA結合時間PCR循環模板量(輪)(個)Cpmol)(min)數(個)(Hi)12xl0610003011222xl065003013132xl065003013141.5xl06300301511.5xl063002015161.5xl0620020151lxl0620020150.58lx10620020150.59lxl0610020160.510lxl0610020160.511lx10610020160.512MO610020160.513lx10610020160.52.3.3PCR擴增產物電泳鑒定用含有濃度0.25illEB的3X的瓊脂糖凝膠，將每輪篩選產物的PCR產物中，取5-10yl上樣于80V，進行電泳，30min后取出凝膠，用凝膠圖像分析系統(Syngene10ChemiGenius2)觀察并照相。2.3.4PCR擴增產物純化PCR產物用UNIQ-10柱式PCR產物回收試劑盒純化。實驗過程中，我們發現退火溫度對PCR反應結果影響很大本實驗最佳退火溫度為45t:;當退火溫度在40-651:時，3%瓊脂糖凝膠電泳有目的條帶；退火溫度低于4(TC時，有大于目的條帶的片段出現；退火溫度高于65t:時，無任何PCR反應產物。另外，模板含量和循環次數對反應結果影響也很大每輪SELEX篩選的模板含量和循環次數都各不相同。模板含量一定，循環次數過少，無目的條帶，循環次數過多，則出現梯狀條帶且有拖尾現象，結果如圖1所示；模板含量過少，適當增加循環也可獲得目的條帶；模板含量過多反而無目的條帶。其他因素如引物濃度、dNTP濃度、Mg2+離子濃度等在擴增過程中也有一定的影響。電泳條帶隨SELEX篩選輪數的增加逐漸變細變致密，結果如圖2所示。2.3.5磁珠分離制備次級文庫取100iil磁珠于1.5ml微量離心管中置磁力架12min，吸棄上清；拿下微量離心管，加入100ul2X洗滌緩沖液重懸磁珠；重置磁力架12min，吸棄洗滌緩沖液，加入200iil2X洗滌緩沖液，再加入200ii1生物素化的dsDNA37。C水浴15min;上磁力架12min，吸棄上清；用200X洗滌緩沖液沖洗23次；加入50y1150mMNaOH于37。C水浴15min，使dsDNA解鏈；上磁力架，含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素磁珠上并吸附于管壁，而另一條不含生物素的ssDNA則存在于上清中，分離出上清中的ssDNA并測定A值，此即為下一輪篩選的ssDNA庫。2.3.6正常人中性粒細胞的提取本實驗材料均取自蘭州大學第一醫院健康查體人群，與所有實驗對象簽署知情同意書后，抽取空腹靜脈血2ml，并用人中性粒細胞提取液(購自西安舟鼎國生物技術有限公司)從血液中提取中性粒細胞，按照說明書步驟進行。2.3.7用中性粒細胞進行反篩為了加快篩選的速度，并有效地提高適配子的特異性，本實驗用中性粒細胞做反篩，步驟如下(1)將磁珠分離得到的ssDNA庫99°C加熱5min進行變性，然后立即置于0°C10min;(2)將1X10S個從血液中提取的中性粒細胞，去上清后加入上述溶液，加入選擇緩沖液400ii137。C水浴30min;(3)將混合液3000rpm離心2min，取上清，用于下一輪SELEX篩選。2.3.8ssDNA文庫與K562細胞親和力的測定1-13輪SELEX篩選的產物，用標記地高辛的引物P3和標記生物素的引物P4進行PCR擴增，電泳鑒定目的條帶清楚的PCR產物用試劑盒純化，然后與K562細胞充分反應并用150mMNaOH解鏈，地高辛標記的ssDNA游離在上清中，測定ssDNA含量。按ssDNA:K562細胞=500pmo1:1X106個在400ii12X結合緩沖液中結合，離心，棄上清，加入100ii11:15000稀釋的抗地高辛抗體標記的堿性磷酸酶，反應10min，離心，棄上清，用500iUlX結合緩沖液懸浮K562細胞后，離心，棄上清，重復洗滌3次，洗去未與抗地高辛抗體結合的堿性磷酸酶，以底物顯色，終止反應后用酶聯儀于405nm測定A值(三次試驗取平均值)。結果如圖3表示。2.4克隆、測序及結構分析2.4.1制備感受態大腸桿菌DH5a細胞(1)從大腸桿菌DH5a平板上挑選單個菌落接種于含2mlLB液體培養基的試管中，37t:搖床振搖培養過夜；(2)次日，取0.5ml渾濁菌液轉移到一個含有50mlLB液體培養基的錐形瓶中，37。C搖床振搖23h，使菌液的0D6。。《0.40.5;(3)將菌液轉移到50ml的離心管中，立即冰上放置lOmin;(4)04°C，4000rmp離心lOmin，使細胞沉淀，回收細胞；(5)倒出離心管中的培養液，將離心管倒置于一滅菌的濾紙上lmin，以盡量流盡培養液；(6)用冰冷的0.1M的CaCl210ml懸浮沉淀，立即放冰上保溫30min;(7)04°C，4000rmp離心lOmin，使細胞沉淀，回收細胞；(8)倒出離心管中的液體，將離心管倒置于一滅菌的濾紙上lmin，以盡量流盡殘留液體；(9)用冰預冷的0.1M的CaCl22ml懸浮細胞，制成感受態細胞；(10)迅速將懸液分裝到無菌的E卯endorf管中，每管200iU。2.4.2感受態大腸桿菌DH5a轉化率的測定(1)將0.5iig/ill的pGEM-T質粒1:100稀釋后待用(pGEM-T質粒濃度稀釋為5ng/li1);(2)向上述分裝好感受態細胞的E卯endorf管加入稀釋的pGEM-T質粒1y1，吹打混勻，置冰上30min;;(3)將Eppendorf管放到42。C水浴90s;(4)將E卯endorf管冰上放置加in;(5)加入800ill的LB液體培養基，37。C慢搖培養lh;(6)將管中的轉化反應用培養液作1:10的稀釋(其中的pGEM-T質粒濃度為2.5ng/ml)，取其中100的稀釋液加到已含有適當Amp的LB固體培養基的培養皿中，用無菌的玻璃涂布器將轉化菌均勻鋪在瓊脂板表面；(7)將平板置于室溫0.5h以使液體能被吸收；(8)倒置平板于37t:培養16h，進行菌落計數；(9)按照下式計算轉化率轉化率=產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。例如用0.lng完整的質粒DNA轉化100ii1的感受態細胞，向轉化反應液中加入900ii1培養液(0.lng/lml)，讓細菌恢復一段時間(lh)。將轉化反應用培養液作1:10的稀釋(0.01ng/ml)，取其中100的稀釋液來涂布(0.OOlngDNA/100y1)。如能獲得200個克隆，轉化效率是2X108cfu/ugDNA，計算方法如下200cfu/0.00lng=2X105cfu/ng=2X108cfu/ugDNA轉化效率lXl(fcfu/iigDNA可滿足普通的亞克隆實驗；1X107cfu/iigDNA用于作更復雜的亞克隆。結果如圖4顯示。2.4.3篩選產物擴增和膠回收純化經11輪篩選得到的ssDNA，用引物1和引物5經PCR擴增成dsDNA，再用膠回收試劑盒回收DNA，按說明書操作步驟進行。2.4.4PCR純化產物的連接反應(l)DNA分子摩爾質量計算方法DNA分子摩爾數(pmol)=DNA分子質量(ng)X1000/(660XDNA分子的bp數)(2)PCR膠回收產物通過3%瓊脂糖凝膠電泳估量約為10ng/iU。(3)按i:3、i:5、i:8比例在微量離心管中加入以下成分1:31:51:82x連接緩沖液5^15nl5^1pGEM-T載體(50ng/ul)11W1nl目的DNA片段0.9pl1.5nl2.4plT4DNA連接酶1nl1pl1pi滅菌水2.1nl1.5nl0.6pi將上述物質混合均勻，4t:放置過夜。2.4.5連接產物的轉化及Amp和a互補篩選(1)向上述分裝好感受態細胞的E卯endorf管加入連接反應液10y1，吹打混勻，置冰上30min;(2)將Eppendorf管放到42。C水浴90s;(3)將E卯endorf管冰上放置加in;(4)向各管加入800ia的LB液體培養基，37t:慢搖培養lh;(5)將以上各管取轉化反應用培養液取100iil，分別涂布到IPTG/X-gal/Amp的LB平板上；(6)將平板置于室溫0.5h以使液體能被吸收；(7)倒置平板于37"培養16h;(8)取出培養皿在4t:放置6h，使藍色充分顯現，觀察結果如圖5。2.4.6挑選單克隆菌液測序次日取出培養皿，隨機挑選24個菌落接種于3ml含Amp的LB液體培養基中，37°C搖菌過夜，分別吸取轉化菌液lml加入離心管中，每管加入30ii1滅菌甘油，顛倒混勻、封膜后送上海生工生物技術有限公司采用載體的通用測序引物(T7引物)鑒定并測序。剩余菌液加入100iU滅菌甘油，顛倒混勻后置-S(TC冰箱凍存。2.4.7適配子一級結構和二級結構分析用DNAMAN軟件對隨機區序列進行分析發現無同源序列，但可分為6個家族(family):家族1含有保守序列ACCAG，家族2含有保守序列ACCGG，家族3含有保守序列CCCGC，家族4含有保守序列家族5含有保守序列AAGTT。家族6共10個，無保守序列。結果如下130183]Family10184]1N18—0185]2N18—0186]9N18—0187]Family20188]6N18—0189]7N18—0190]17N18—0191]Family30192]10訓-0193]16訓-0194]22訓-0195]Family40196]5訓-0197]11訓-0198]24訓-0199]Family50200]12訓-0201]19訓-0202]Family60203]3訓-0204]4訓-0205]8訓-0206]13訓-0207]14訓-0208]15訓-0209]18訓-0210]20訓-0211]21訓-0212]23訓-0213]對所有序CACCACGAGGAACTTCCCGCAAACCAGCAGATGTGACACGCATAGGTCCT-ACCAGATAGTAAGTGCAATCTATACCAGCTTATTCAATTGGC—N18-訓ATCGTTTTTAAGAGAATGAGAGGTGGGGCGCGTCCACCAGGCCTAAGTCGG—N18CGCGGCGGAATCCCCCGGAGCACCGGAACGGGCGGGAATCTGGCCACTGCTCG-TAGGAGTGGGACCGGTACAAAAAAATATAACCCACTCAATATAATGCCTCAT-—N18.訓N18-AGTTCGGCTCAGAAGGGGTGCTAGCTCCGGGTGTAGCCGGACGCGTGACCGT--GGCAAGGAAATTCACTCATGGAGTATGTGGAAGTTAAGACGGTTCCGGGGCG--訓-訓-訓-訓—訓—訓—訓—訓-訓—訓—訓—訓—訓—訓—N18適配子的二級結構主要是由莖環和凸環結構組成的，分為以下5類A類隨機序列與3'端形成幾個小莖環，樹杈樣分布，基底部與5'端形成的大凸環相連；B類5'端與隨機序列形成幾個小莖環，分兩支與3'端形成的大凸環相連；C類5'端、3'端和隨機序列分別形成一個小莖環，各自連接在一個大凸環上；D類5'端、3'端和隨機序列形成4個小莖環，各自連接在一個大凸環上；E類5'端、3'端和隨機序列形成多個小莖環復雜排列，無凸環結構。具體的二級結構預測圖如圖6。2.524個克隆適配子與靶細胞親和力的測定取-S(TC冰箱凍存的測序之轉化菌，經質粒抽提、PCR擴增、純化后測定其與慢性14粒細胞白血病K562細胞的親和力。2.5.1各克隆菌質粒抽提用質粒提取試劑盒的說明書操作步驟進行。2.5.2PCR擴增及擴增產物純化將上述質粒抽提產物用標記熒光素和生物素的引物進行PCR擴增，取PCR產物凝膠電泳觀察看是否有明亮清晰的目的條帶，若條帶明亮清晰，則進一步純化PCR產物，方法同2.2.4。PCR反應體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.5.3熒光強度-ssDNA濃度標準曲線的制備將標準品(5，-FITC-88nt-3')用選擇緩沖液稀釋為800ng/ml、666.7ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml9管不同濃度的溶液，測定各管的熒光強度(測三次取平均值)，繪出熒光強度-ssDNA濃度標準曲線。2.5.4熒光素標記的ssDNA的制備2.4.2中PCR產物一條鏈5'端含熒光素，另一條鏈5'端含生物素。利用生物素_鏈霉親和素磁珠將dsDNA解鏈為ssDNA。含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素磁珠上并吸附于管壁，而另一條帶熒光素的ssDNA存在于上清中，分離出上清中ssDNA并用熒光分光光度計測定其熒光強度，從標準曲線查得其熒光強度對應的ssDNA的含量，此即測定結合率的純適配子庫。2.5.5各克隆適配子與靶細胞和中性粒細胞結合率的測定按熒光素標記的ssDNA:慢性粒細胞性白血病K562細胞=50pmol:1Xl(f個慢性粒細胞性白血病K562細胞的比例進行結合反應，將二者在選擇緩沖液中結合30min，更換離心管，離心，吸取上清測定熒光強度；用選擇緩沖液重懸慢性粒細胞性白血病K562細胞后離心，吸取上清，測定熒光強度，重復洗滌2次，洗去未與慢性粒細胞性白血病K562細胞結合的熒光素-ssDNA。根據各管洗滌上清的熒光強度從標準曲線查得其對應的濃度，乘體積得到ssDNA的量，再將各管的量相加，即為未結合到慢性粒細胞性白血病K562細胞上的ssDNA的總量。將投入總量減去未結合的量即為結合到慢性粒細胞性白血病K562細胞上的ssDNA的量，用結合的量除以總量，計算出結合率；用同樣的方法測定其與人正常中性粒細胞的集合率。結果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從上表中看出，各適配子中與靶細胞結合率比較高的是5、10、21、22、24號適配子，其結合率分別為40.6%、45.2%、40.8%、42.2%、41.6%。2.6各克隆適配子特異性通過上表中各適配子與慢性粒細胞白血病K562細胞和中性粒細胞的結合率測定顯示結合率高的5、10、21、22、24號適配子都有較高的特異性，與正常人血液中提取的中性粒細胞的結合率明顯降低，分別僅為2.9%、2.8%、3.0%、2.5%、2.7%，由此證明此5種適配子具有較高的特異性。適配子一級結構測序結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>〈120〉檢測慢性粒細胞白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法〈130〉檢測慢性粒細胞白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法〈160>5〈170>PatentInversion3.5<210>1〈211〉88〈212>DNA〈213〉白血病細胞〈400>1ataccagcttattcaattccgcccggtcagcatctcttcccaacctattttcactgtgtg60gctccctatcagategteagtgcaatct88〈210>2〈211>88〈212>DNA〈213〉白血病細胞〈400>2ateccagcttattcaattcccgctgcttcggctccccactccgcactgtgttactgcctt60agtctecttgagategteagtgc朋tct88〈210>3<211>88〈212>DNA〈213〉白血病細胞〈400>3￡lt￡lCC3gCtt3ttC朋ttC3tCgttttt朋g￡lg￡l￡ltgag￡lggtggggCgCgtCC3CC3gg60cct朋gtcgg3gategte3gtgcaatct88〈210>4〈211〉88〈212>DNA〈213〉白血病細胞〈400>4agattgcacttectatctgagcttcccccgcgagaccgttagcgacgtcaattggagtct603ttcacc3ga朋ttg朋teagctggtet88〈210>5〈211>88〈212>DNA〈213〉白血病細胞〈400>5agattgcacttectetctegttcggctcagaaggggtgctagctccgggtgtegccggac60gcgtgaccgt朋ttg朋teagctggtet88權利要求一種檢測慢性粒細胞白血病的單鏈DNA適配子，其特征在于該適配子具有序列表中SEQIDNo.1至SEQIDNo.5所述的核苷酸序列的任意一種。2.根據權利要求1所述的一種檢測慢性粒細胞白血病的單鏈DNA適配子，其特征在于所述SEQIDNo.1所述的核苷酸序列的二級結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述SEQIDNo.2所述的核苷酸序列的二級結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述SEQIDNo.3所述的核苷酸序列的二級結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述SEQIDNo.4所述的核苷酸序列的二級結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>所述SEQIDNo.5所述的核苷酸序列的二級結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.—種如權利要求1所述的檢測慢性粒細胞白血病的單鏈DNA適配子的制備方法，其特征在于該方法按照下列步驟進行①將慢性粒細胞白血病K562細胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中，置于37°〇、飽和濕度、5%C02的培養箱內培養，隔天傳代一次；②構建單鏈DNA文庫5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N52-AGATAGTAAGTGCAATCT-3，，其中N代表堿基A、G、C、T中的任意一個，構建5條引物，分別為Pl5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'P25'-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3'P35，-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3，P45，-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3，P55，-AGATTGCACTTACTATCT-3，③將10yg的隨機ssDNA文庫加到400iil2X結合緩沖液中，于99。C變性5min，然后立即置于0。C冰上10min;加入3%BSA13.5yl降低背景；再將1X106個人慢性粒細胞性白血病K562細胞加到上述溶液中混勻，37。C水浴30min;3000rpm離心5min，去上清，加入400ii1結合緩沖液混勻再3000rpm離心5min，反復6次；最后所得沉淀加入100y1ddH20，IO(TC加熱10min;10000rpm離心5min，取上清，經酚氯仿抽提，乙醇沉淀，將ssDNA溶解于20iUTE緩沖液中;④將上述篩選過程得到的ssDNA，用上游引物Pl和下游生物素標記的引物P4經PCR擴增成一端帶生物素的dsDNA，PCR反應體系為:模板mii1，10XPCRButter5iU，MgCl23yl，dNTPs5iU，T叫DNA多聚酶2U，上游引物、下游5，端生物素標記的引物各25pmol，加去離子水至50ii1;PCR反應條件為94t:預變性2min，然后進行n個循環94°C的變性30s，45°C退火lmin，72t:延伸30s，最后72。C延伸5min;在開始幾輪篩選過程中，ssDNA文庫和細胞量投放很多；在隨后的幾輪篩選中，由于高特異性的適配子已經富集，為了提高篩選的嚴謹性，結合時間由30min減少到20min;模板量也由2y1減少到0.5yl;然而PCR循環數卻由原來的11個循環增加到16個循環；⑤PCR擴增產物電泳鑒定及純化用含有濃度O.25iUEB的3%的瓊脂糖凝膠，將每輪篩選產物的PCR產物中，取5-10iU上樣于80V，進行電泳，30min后取出凝膠，用凝膠圖像分析系統觀察并照相，PCR產物用UNIQ-10柱式PCR產物回收試劑盒純化；⑥磁珠分離制備次級文庫取100ii1磁珠于1.5ml微量離心管中置磁力架12min，吸棄上清；拿下微量離心管，加入100ul2X洗滌緩沖液重懸磁珠；重置磁力架12min，吸棄洗滌緩沖液，加入200iil2X洗滌緩沖液，再加入200ii1生物素化的dsDNA37。C水浴15min;上磁力架12min，吸棄上清；用200ylIX洗滌緩沖液沖洗23次；加入50y1150mMNaOH于37。C水浴15min，使dsDNA解鏈；上磁力架，含生物素的一條ssDNA仍留在鏈霉親和素磁珠上并吸附于管壁，而另一條不含生物素的ssDNA則存在于上清中，分離出上清中的ssDNA并測定A值，此即為下一輪篩選的ssDNA庫；⑦中性粒細胞進行反篩用中性粒細胞提取液從正常查體人群血液中提取中性粒細胞，將磁珠分離得到的ssDNA庫99t:加熱5min進行變性，然后立即置于0t:10min;將1X106個中性粒細胞上清后加入上述溶液，加入選擇緩沖液400ii137t:水浴30min;將混合液3000rpm離心2min，取上清，用于下一輪SELEX篩選；⑧適配子克隆測序及一級、二級結構的分析重復篩選13輪后，將篩選得到的適配子回收純化后連接pGEM-T質粒載體，經藍白篩選后，隨機挑選24個克隆子進行序列測定；并用DNAMAN軟件對適配子序列進行一級結構同源性分析和二級結構預測；⑨克隆適配子與靶細胞親和力的測定將標準品5'-FITC-88nt-3'用選擇緩沖液稀釋為不同濃度的溶液，測定各管的熒光強度，繪出熒光強度-ssDNA濃度標準曲線；取測序之轉化菌，經質粒抽提試劑盒抽提后，用標記熒光素和生物素的引物進行PCR擴增，然后再用生物素-鏈霉親和素磁珠分離，得到標記有熒光素的單鏈DNA，測定其熒光強度；按熒光素標記的ssDNA:慢性粒細胞性白血病K562細胞二50pmol:1X106個慢性粒細胞性白血病K562細胞的比例進行結合反應，將二者在選擇緩沖液中結合30min，更換離心管，離心，吸取上清測定熒光強度；用選擇緩沖液重懸慢性粒細胞性白血病K562細胞后離心，吸取上清，測定熒光強度，重復洗滌2次，洗去未與慢性粒細胞性白血病K562細胞結合的熒光素-ssDNA;根據各管洗滌上清的熒光強度從標準曲線查得其對應的濃度，乘體積得到ssDNA的量，再將各管的量相加，即為未結合到慢性粒細胞性白血病K562細胞上的ssDNA的總量；將投入總量減去未結合的量即為結合到慢性粒細胞性白血病K562細胞上的ssDNA的量，用結合的量除以總量，計算出結合率；用同樣的方法測定適配子與人正常中性粒細胞的結合率；與慢性粒細胞性白血病K562細胞結合率較高，而與人正常中性粒細胞結合率低的就是能與慢性粒細胞性白血病細胞特異性結合的DNA適配子。全文摘要本發明提供了一種檢測慢性粒細胞白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法，體外合成長度為88個堿基的隨機單鏈DNA文庫，采用生物素-鏈霉親和素磁珠法制備次級文庫，以正常人中性粒細胞為反篩細胞，利用SELEX技術篩選出與慢性粒細胞白血病K562細胞特異結合的適配子。將篩選得到的適配子回收純化后連接pGEM-T質粒載體，經藍白篩選后，隨機挑選24個克隆子進行序列測定。采用熒光標記引物法檢測親和力，并用DNAMAN軟件對適配子序列進行一級結構同源性分析和二級結構預測。一級結構分析發現無同源序列，但可分為6個家族(family)。二級結構分析表明適配子形成的莖環、凸環結構可能是與K562細胞特異性結合的結構基礎。24個克隆適配子中，第5、10、21、22、24號適配子與慢性粒細胞白血病K562細胞的結合率較高，分別為40.6％、45.2％、40.8％、42.2％、41.6％。文檔編號C12Q1/68GK101748210SQ20091011758公開日2010年6月23日申請日期2009年11月11日優先權日2009年11月11日發明者劉玲玲,姚海燕,查成喜,韓躍武申請人:蘭州大學