專利名稱：貝類多倍體倍性檢測方法
技術領域：
本發明屬于細胞工程育種的多倍體誘導技術領域，涉及一種人工 誘導貝類多倍體中使用的倍性檢測方法，尤指在規模化誘導鮑魚、牡 蠣、扇貝等貝類多倍體時使用的一種貝類多倍體倍性檢測方法。
賴絲
無論是人工誘導多倍體的研究實驗，還是多倍體規模化養殖生 產，都要求在早期胚胎發育階段就能快速且及時地對多倍體率做出檢 測，從而對其誘導結果的有效性做出準確的評估。在目前的貝類多倍 體人工誘導實驗中，往往通過取樣早期胚胎、幼蟲、稚貝、成貝組織， 經染色體制片后進行染色體條數統計，或者取樣并制成細胞懸液后， 使用流式細胞儀進行倍性檢測來鑒定多倍體誘導的效果。雖然這兩種 方法被廣泛使用于目前的多倍體誘導研究中，尤其是流式細胞儀檢測 法具有快速和準確率高等優點。但染色體制片時易弓I起染色體缺失， 且鑒定過程耗時較長，無法及時地獲得鑒定結果；而流式細胞儀檢測 時需要一定數量的細胞樣品，這對發育早期的個體很難鑒定，還有價 格昂貴，使用成本高。再者，這兩種方法都要求操作者具有專業的實 驗操作水平。所以，這兩種鑒定方法都無法對其多倍體率做出快速且 及時地檢測。
發明內容
本發明的目的在于提供一種設備簡單、容易掌握、能夠快速檢測 和統計出多倍體率的貝類多倍體倍性檢測方法，該方法能即時了解了 誘導方法的有效性，提高了誘導方法的準確性。
為實現上述目的，本發明的技術解決方案是-
本發明是一種貝類多倍體倍性檢測方法，其操作步驟如下當理 化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體或第2極體釋放來誘導貝類
多倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，在顯微鏡下分別統計僅釋 放1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算多倍體率。
該方法包括三倍體率檢測法和四倍體率檢測法。四倍體率檢測法 又分為抑制第1極體釋放時的四倍體率檢測法和同時抑制第1極體和 第2極體釋放時的四倍體率檢測法。
1、 三倍體率檢測法
當理化因子作用于貝類受精卵，抑制第2極體釋放來誘導貝類三 倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，在顯微鏡下分別統計僅釋放
1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算三倍體率；計算公式
三倍體率二僅釋放1個極體的受精卵數/(僅釋放1個極體的受精卵數
+釋放2個極體的受精卵數)X100%。
2、 四倍體率檢測法
(1)抑制第l極體釋放時的四倍體率檢測法 當理化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體的釋放來誘導產生 貝類四倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，顯微鏡下分別統計此 細胞期內僅釋放1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算四倍體 率；計算公式四倍體率=僅釋放1個極體未的受精卵數/ (僅釋放1個極體的受精卵數+釋放2個極體的受精卵數)X 100%。
(2)同時抑制第1極體和第2極體釋放時的四倍體率檢測法 當理化因子作用于貝類受精卵，同時抑制第1極體和第2極體的 釋放來誘導產生貝類四倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，顯微 鏡下分別統計此細胞期內無極體釋放的受精卵數和總受精卵數，并計 算四倍體率；計算公式四倍體率=(無極體釋放的卵數一對照組的 無極體釋放的卵數)/總卵數X1009&。
(1) 由于本發明在早期胚胎發育時期就可對貝類多倍體誘導實 驗和規模化養殖生產的多倍體率進行檢測和統計，所以能直觀、準確 并即時地對誘導效果做出鑒定。
(2) 由于本發明能直觀、準確并即時地對誘導效果做出鑒定， 有助于迅速調整各誘導參數至最佳組合，從而避免多倍體誘導的盲目 性和常規染色體倍性檢測的延遲性，縮短實驗周期，節約成本。
(3) 由于本發明只需通過簡單的顯微鏡觀察和細胞計數就能有 效地對多倍體誘導效果做出鑒定，對工作人員的實驗操作水平要求不 高，在生產中的可操作性更強。
綜上所述，本發明與常規貝類多倍體倍性檢測法相比，能快速地 檢測和統計出多倍體率，更直觀、準確且即時地鑒定多倍體誘導的有 效性，避免了染色體倍性檢測的延遲性和多倍體誘導的盲目性，縮短 實驗周期，節約實驗成本。有利于人工誘導貝類多倍體技術在生產上 的大規模推廣應用。
具體實施例方式
本發明是一種觀察極體釋放情況來檢測和統計多倍體率，從而鑒 定人工誘導多倍體有效性的方法，包括三倍體率檢測法和四倍體率檢
5測法；所述的三倍體率檢測法，即理化因子抑制第2極體釋放誘導貝 類三倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，顯微鏡下分別統計僅釋 放1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算三倍體率，計算公式 三倍體率=僅釋放1個極體的受精卵數/(僅釋放1個極體的受精卵數 +釋放2個極體的受精卵數)X100%;所述的四倍體率檢測法因誘導 方式的不同分為抑制第l極體釋放時的四倍體率檢測法、同時抑制 第1極體和第2極體釋放時的四倍體率檢測法。
所述的抑制第1極體釋放時的四倍體率檢測法，即理化因子抑制 第1極體的釋放來誘導產生貝類四倍體時，在早期胚胎發育的2-4細 胞期，顯微鏡下分別統計此細胞期內第1極體未釋放的受精卵數和第 1極體釋放的受精卵數，并計算四倍體率，計算公式四倍體率=僅 釋放1個極體的受精卵數/ (僅釋放1個極體的受精卵數+釋放2個極 體的受精卵數)X100%。
所述的同時抑制第1極體和第2極體釋放時的四倍體率檢測法， 即理化因子同時抑制第1極體和第2極體釋放來誘導產生貝類四倍體 時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，顯微鏡下分別統計此細胞期內無 極體釋放的受精卵數和總受精卵數，并計算四倍體率，計算公式四 倍體率=(無極體釋放的卵數-對照組的無極體釋放的卵數)/總卵數X 100%。
實驗結果表明，這種用極體個數法即時鑒定多倍體率的檢測方法
所表達的多倍體率與成貝的多倍體率呈正相關性。
實施例1:抑制貝類受精卵第二極體的釋放誘導三倍體 在胚胎發育早期的2 — 4細胞期，鏡檢到1個極體的受精卵數有
70個，2個極體的受精卵數有50個，則其三倍體率二70/(70+50)X
100%=58. 3% .
6實施例2:抑制貝類受精卵第一極體的釋放誘導四倍體 在胚胎發育早期的2—4細胞期，鏡檢到1個極體的受精卵數有
90個，2個極體的受精卵數有60個，則其四倍體率二90/(90+60)X
100%=60. 0% .
實施例3:抑制貝類受精卵第一極體和第二極體的釋放誘導四倍
體
在胚胎發育早期的2—4細胞期，鏡檢到樣品中無極體的卵數有 80個，有極體的卵數40個(其中有1個極體的卵數15個，有2個極體 的卵數25個)，即鏡檢的總卵數為120個，而對照組的無極體的卵數有 20個，則其四倍體率=(80-20)/(80+40) X 100%=50. 0%。
權利要求
1、一種貝類多倍體倍性檢測方法，其特征在于其操作步驟如下當理化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體或第2極體釋放來誘導貝類多倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，在顯微鏡下分別統計僅釋放1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算多倍體率。
2、 根據權利要求1所述的貝類多倍體倍性檢測方法，其特征在于其三倍體率檢測法操作步驟如下當理化因子作用于貝類受精卵，抑制第2極體釋放來誘導貝類三倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，在顯微鏡下分別統計僅釋放1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算三倍體率；計算公式三倍體率=僅釋放1個極體的受精卵數/(僅釋放1個極體的受精卵數+釋放2個極體的受精卵數)X 100%。
3、 根據權利要求1所述的貝類多倍體倍性檢測方法，其特征在于其抑制第l極體釋放時的四倍體率檢測法操作步驟如下當理化因子作用于貝類受精卵，抑制第1極體的釋放來誘導產生貝類四倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，顯微鏡下分別統計此細胞期內僅釋放1個極體和釋放2個極體的受精卵數，并計算四倍體率；計算公式四倍體率=僅釋放1個極體的受精卵數/ (僅釋放1個極體的受精卵數+釋放2個極體的受精卵數)X100%。
4、 根據權利要求1所述的貝類多倍體倍性檢測方法，其特征在于其同時抑制第1極體和第2極體釋放時的四倍體率檢測法操作步驟如下當理化因子作用于貝類受精卵，同時抑制第1極體和第2極體的釋放來誘導產生貝類四倍體時，在早期胚胎發育的2-4細胞期，顯微鏡下分別統計此細胞期內無極體釋放的受精卵數和總受精卵數，并計算四倍體率；計算公式四倍體率=(無極體釋放的卵數一對照組的無極體釋放的卵數)/總卵數xiooyo。
全文摘要
本發明公開了一種貝類多倍體倍性檢測方法，它包括三倍體率檢測法和四倍體率檢測法，屬于多倍體誘導技術領域。由于本發明只需在早期胚胎發育時期，通過簡單的顯微鏡觀察和細胞計數就可對多倍體率進行統計，就能直觀、準確并即時地對誘導效果做出鑒定，并有助于迅速調整各誘導參數至最佳組合，避免多倍體誘導的盲目性和常規染色體倍性鑒定的延遲性，縮短實驗周期，節約成本，對工作人員的實驗操作水平要求不高，完全能滿足貝類多倍體誘導實驗和規模化養殖生產對誘導效果鑒定的要求。
文檔編號C12Q1/06GK101643771SQ20091011224
公開日2010年2月10日 申請日期2009年7月15日 優先權日2009年7月15日
發明者姜永華, 張紅云, 陳昌生, 顧勇杰 申請人:集美大學