專利名稱：一種用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制備方法
技術領域：
本發明屬于發酵技術領域，具體涉及一種發酵法生產花生四烯酸
(Arachidonic Acid，簡稱AA)的種子培養基制配方法。
背景技術：
花生四烯酸是全順式A-5， 8， U， 14-二十碳四烯酸，化學式為 CH:,(CH2)4(CH=CH-CH2)4(CH2)2C00H，花生四烯酸屬于"-6脂肪酸，由于人體內不 具備相應的酶系統來合成特定的不飽和雙鍵，因此被認為是人體必需脂肪酸。 在多數花生四烯酸代謝途徑中，它被磷醋化形成細胞膜磷脂，對維持細胞膜結 構非常關鍵。因其含有4個不飽和雙鍵，使得分子具有很大的流動性，即使在0 "C以下也能保持液體狀態，這也保證了在生理溫度下哺乳動物的細胞膜具有一 定的流動性。同時它還參與調節各種細胞活動，如調節細胞增殖、細胞生長、 調節免疫系統功能(Weems YS， " a丄，2007， Prostaglandins Other Lipid Mediat. 84: 163-173.)等；此外它對嬰幼兒的神經系統，尤其是大腦的發育至 關重要(Maekawa M, et a丄，2009， PLoS ONE. 4: 5085.)。另外，雙鍵也是花 生四烯酸抗氧化作用的來源，它可以在無酶介導的條件下發生氧化反應，也可 以通過以下三種氧化酶進行反應環氧化酶(cycloocygenase， COX)、脂氧化酶 (lipoxygenase, L0X)、細胞色素P450,其反應產物包括前列腺素、血栓烷、白 細胞三烯(Zarini S, a丄，2006， J Biol Chem. 281: 10134-10142.)以及其 他生物活性產物。而這些生物活性物質對細胞信號傳導、蛋白的代謝、血液流 變學、血管彈性、白細胞功能和血小板激活等具有重要的調節作用，且花生四烯酸本身也具有很好的生物活性(Cowpland C, W a丄，2006， Clin Exp Pharmacol Physiol. 33: 183-188.)。研究發現，當用葡萄糖和卡巴可(carbacol) 剌激細胞后，花生四烯酸的含量分別增加一倍和十倍，推測相關的生理反應都 可能由釋放的花生四烯酸來介導(Liu BH, eta丄，2005， J Anim Sci. 83: 1516-1525.)。花生四烯酸作為人體必需脂肪酸發揮著無可替代的作用，其應用 前景廣闊。
花生四烯酸主要來源有植物、動物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但 花生四烯酸在動物組織中含量低， 一般小于0.2。/。(wt/wt)，來源也有限，而微生 物發酵法則為生產花生四烯酸開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、 生長周期短、培養工藝簡單、花生四烯酸含量高等特點，近幾年己成為國內外 研究的熱點。尤其是日本、美國等國家已先后問世了卜亞麻酸、二高-Y—亞麻 酸、花生四烯酸的發酵產品，現正著手開發二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的 發酵產品。國內在這一領域的研究起步較晚，雖對微生物發酵生產花生四烯酸 的發酵培養基作了初步的研究，但還存在著利用現有的培養基培養的花生四烯 酸生物量偏低，生長周期長的問題，因此離大規模生產還存在一定的距離。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基 的制備方法。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案，其發酵制配方法如下 1、花生四烯酸的種子培養基的帝丄備
(l)新鮮麩皮，加水煮沸0.5-1.5小時，過濾出麩皮浸汁備用。麩皮與水的 比例(g/mL)為1 1.6 : 2 3。(2)取麩皮浸汁,按麩皮浸汁的體積(L)，每升麩皮浸汁分別加入44 100g 葡萄糖，0.5 2.0g的KH2P04，攪拌溶解，用少量H3P04調節浸汁液的pH為6. 0 6.4之間。然后置于搖床上，培養溫度24 26。C，搖床轉速為150 200rpm， 培養時間2二3天，培養出種子培養基。
(3)采用產花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌種，經斜面活化后，加8 14ml 無菌水洗下孢子，制成孢子懸液。按100mL種子培養基加8 10mL孢子懸液的 比例，在搖床上繼續擴大培養2 3天，獲得用于發酵法生產花生四烯酸的種子 擴大培養基。
2、花生四烯酸發酵培養
在發酵法生產花生四烯酸的發酵培養基中，按100mL發酵培養基接入本發 明制備的種子培養基18-25mL，發酵培養7 8天。發酵結束后，抽濾，收集菌 體經烘干、粉碎、石油醚抽提油脂。氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量， 再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果原料易購，價格低廉，花 生四烯酸合成穩定，產量在1.35-1.55g/L，發酵過程簡單易行，操作簡便，適合 工業化生產。
具體實施例方式
實施例1:
1、花生四烯酸的種子培養基的制備
(1) 新鮮麩皮600g，加水1000mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2) 麩皮浸汁1000mL，葡萄糖100g/L， KH2P04 1.5g/L，用少量113 04調節 浸汁液的pH至6.2。然后置于搖床上，培養溫度為26。C，搖瓶轉速為200rpm，培養2天。
(3)按500mL搖瓶裝100mL種子培養基，然后采用普通的產花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌種活化后，用8mL無菌水洗下孢子，按每100mL種子培養基加入8mL孢子懸液接入搖瓶中，并按(2)中的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得用于發酵法生產花生四烯酸的種子擴大培養基。
2、發酵培養
在發酵培養基，加入備用的種子培養基，形成混合培養基，混合培養基中種子培養基和發酵培養基的體積比例為1 : 1 10;保持混合培養基的溫度在26。C 2(TC之間，攪拌并通氣，攪拌轉速為100-250rpm，通氣量為1.5-2.0 vvm，進行培養，培養時間7 8天。發酵結束后，抽濾，收集菌體40-6(TC烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
2、花生四烯酸發酵培養
在發酵法生產花生四烯酸的發酵培養基中，按100mL發酵培養基接入本發明制備的種子擴大培養基25mL，發酵培養8天。發酵結束后，抽濾，收集菌體6(TC烘干至恒重、粉碎，采用石油醚溶劑提取油脂;氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。實施例2:
1、花生四烯酸的種子培養基的制備
(1) 新鮮麩皮400g，加水800mL，煮沸0.5小時，取出浸汁，備用。
(2) 麩皮浸汁1000mL，葡萄糖60g/L， KH2P04 2g/L， pH 6.4。培養條件培養溫度為24"C，搖瓶轉速為200rmp，培養3天。(3)按500mL搖瓶裝lOOmL種子培養液，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌種、經斜面活化后，加8mL無菌水、洗下孢子。制成孢子懸液，按每lOOmL種子培養基加14mL孢子懸液。再按(2)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得用于發酵法生產花生四烯酸的種子擴大培養基。
2、花生四烯酸發酵培養
在發酵法生產花生四烯酸的發酵培養基中，按100mL發酵培養基接入本發明制備的種子擴大培養基18mL，發酵培養7天。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至55'C烘干至恒重，粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。實施例3
1、 花生四烯酸的種子培養基的制備
(1) 新鮮麩皮660g，加水1800mL，煮沸1.5小時，取出浸汁，備用。
(2) 鼓皮浸汁1200mL，葡萄糖53g/L， KH2P04 0.6g/L， pH 6.0。培養溫度為24'C，搖瓶轉速為150rpm，培養3天。
(3戚500mL搖瓶裝100mL種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保裁菌種、經斜面活化后，加10mL無菌水、洗下孢子，制成孢子懸液。按每lOOmL種子培養基加12mL孢子懸液，再按(2)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得用于發酵法生產花生四烯酸發酵的種子擴大培養基。
2、 發酵培養
在發酵法生產花生四烯酸的發酵培養基中，按100mL發酵培養基接入本發明制備的種子擴大培養基20mL，發酵培養7天。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至5(TC烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。實施例4:
1、 花生四烯酸的種子培養基的制備
(1) 新鮮麩皮900g，加水1100mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2) 麩皮浸汁1000mL，葡萄糖76g/L， KH2P04 1.2g/L， pH 6.5。種子培養條件培養溫度為26'C，搖瓶轉速為200rpm，培養2天。
(3) 按500mL搖瓶裝100mL種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌種、經斜面活化后，加14mL無菌水、洗下孢子，制成飽子懸液。按每lOOmL種子培養基加10mL孢子懸液，再按(2)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子擴大培養基。
2、 發酵培養-
在發酵法生產花生四烯酸的發酵培養基中，按100mL發酵培養基接入本發明制備的種子擴大培養基20mL，發酵培養8天。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至6(TC烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得龍生四烯酸純品。
權利要求
1、一種用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制備方法，其特征是(1)新鮮麩皮，加水煮沸0.5-1.5小時，過濾出麩皮浸汁備用；(2)取麩皮浸汁，分別加入葡萄糖、KH2PO4，攪拌溶解，用少量H3PO4調節浸汁液的pH為6.0～6.4之間，然后置于搖床上，培養溫度24～26℃，搖床轉速為150～200rpm，培養時間2～3天。(3)采用產花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌種，經斜面活化后，加8～14ml無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，加入種子培養基，在搖床上繼續擴大培養2～3天。
2、 根據權利要求1所述的用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制備方法，其 特征是麩皮與水的重量體積比例為1 1.6 : 2 3。
3、 根據權利要求1所述的用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制備方法，其 特征是麩皮浸汁中加入的葡萄糖量是每升麩皮浸汁加44 100g。
4、 根據權利要求1所述的用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制備方法，其 特征是麩皮浸汁中加入的KH2P04量是每升麩皮浸汁加0.5 2.0g 。
5、 根據權利要求1所述的用于發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制備方法，其 特征是所述的搖床培養條件是溫度24 26'C，搖床轉速為150 200rpm,培養時 間2 3天。
全文摘要
本發明屬于發酵技術領域，具體涉及一種發酵法生產花生四烯酸的種子培養基制配方法。具體是在新鮮麩皮，加水煮沸0.5-1.5小時，過濾出麩皮浸汁備用。麩皮與水的比例(g/mL)為1～1.6∶2～3。取麩皮浸汁，按麩皮浸汁的體積(L)，每升麩皮浸汁分別加入44～100g葡萄糖，0.5～2.0g的KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>，攪拌溶解，調節浸汁液的pH為6.0～6.4之間。然后置于搖床上，培養時間2～3天，培養出種子培養基。按100mL孢子懸液加8～10mL種子培養基，加入到在搖床上繼續擴大培養2～3天，獲得用于發酵法生產花生四烯酸的種子擴大培養基。本發明工藝簡便，成本低，花生四烯酸合成穩定，產量高，適合工業化生產。
文檔編號C12N1/14GK101638623SQ20091011165
公開日2010年2月3日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者吳松剛, 斌 江, 黃建忠 申請人:廈門金達威集團股份有限公司;內蒙古金達威藥業有限公司