腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法

專利名稱：腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及一種腫瘤多藥耐藥相關基因的焚光 定量PCR檢測試劑盒，還涉及該試劑盒的檢測方法。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。 化療是根治惡性腫瘤、防止其轉移和復發(fā)的有效手段之一，但隨著抗腫瘤藥 物的廣泛應用，腫瘤耐藥問題日益突出，已成為肺瘤有效治療的主要障礙之 一。根據(jù)腫瘤細胞的耐藥特點，腫瘤耐藥可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐 藥(MDR)兩類。PDR只對誘導的原藥產(chǎn)生耐藥而對其他藥物不產(chǎn)生交叉耐 藥。MDR是由一種藥物誘發(fā)，但同時又對其它多種結構和作用機制迥異的藥 物產(chǎn)生交叉耐藥。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，90%以上腫瘤患者的死因都與MDR有關。 因此，逆轉MDR成為腫瘤治療亟待解決的問題。
在MDR發(fā)生機制中，目前研究最廣泛的是膜轉運蛋白，其可以將藥物 泵出細胞，^f吏細胞內(nèi)藥物濃度低于治療濃度，或者可以將藥物在細胞內(nèi)重新 分布，使藥物遠離作用靶點，從而導致耐藥。已知與MDR有關的膜轉運蛋 白包括p-糖蛋白(p-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)和肺耐藥蛋白(LRP) 等。
p-gp由1200個氨基酸組成，定位于7號染色體q21.1帶上的MDR1基 因，共有12個跨膜疏水區(qū)和2個ATP結合位點，在膜內(nèi)以二聚體或四聚體 的方式存在。這種跨膜結構具有能量依賴性"藥泵"的功能，能將抗腫瘤藥物 和其它疏水性化合物主動轉運出細胞，其底物包括蒽環(huán)類、長春堿、表鬼臼 毒素、紫杉醇和其它天然抗腫瘤藥物。p-gp在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血干細胞等均有表達，負責激素運輸及排泌毒物等生理功能，當正常細胞 演變成惡性細胞時，p-gp仍繼續(xù)表達，因此，臨床上來源于這些組織的腫瘤， 對初始化療就具有耐藥性。而食管癌、胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、膀胱 癌、卵巢癌和造血系統(tǒng)惡性腫瘤等則屬化療前p-gp低表達的腫瘤。p-gp高表 達的腫瘤患者常伴預后不良，如低緩解率、高復發(fā)率、生存期短，可作為預 后評價指標。
MRP由1531個氨基酸組成，定位于16號染色體pl3.1帶上的MRP基 因。MRP至少有四種亞型，其中MRP1在正常組織及腫瘤組織中廣泛存在， 是引起MDR的主要因素之一。耐藥的發(fā)生是由于依賴ATP的谷胱甘肽S結 合載體活性提高的緣故，谷胱甘肽S結合的輸出載體又稱為"GS-X泵"，它 可將陰離子的共軛物排泄出細胞，并在清除外源性毒素中發(fā)揮作用，MRP能 介導藥物中的谷胱甘肽硫共軛物、葡萄糖醛酸戒共軛物和硫酸鹽共軛物排出 細胞。此外，MRP不但定位于血漿細胞膜，而且存在于內(nèi)質網(wǎng)、高爾基濾泡 處，提示MRP還可在細胞內(nèi)隔離藥物，使藥物不能與靶位點結合，從而間 接導致耐藥。由MRP介導的耐藥譜包括紫杉醇、米托蒽醌、蒽環(huán)類、長春 堿、表鬼臼毒素等。文獻報道的由MRP機制引起MDR的胂瘤包括乳腺癌、 宮頸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、食管 癌、纖維肉瘤和神經(jīng)母細胞瘤等。
LRP由896個氨基酸組成，定位于16號染色體上的LRP基因。LRP廣 泛分布于正常組織和腫瘤細胞中，其介導耐藥非常廣泛，包括一些p-gp和 MRP不能介導的藥物的耐藥，如鉑類、烷化劑等。LRP可通過兩種途徑引起 MDR: —是封鎖核孔，使藥物不能進入細胞核；二是使進入細胞內(nèi)的藥物轉 運至胞質中的運輸嚢泡，呈房室分布，最終經(jīng)胞吐機制排出。
目前，MDR的檢測主要是采用流式細胞術、Western Blot和免疫組化等 方法檢測p-gp、 MRP1和LRP等相關蛋白，但上述方法存在操作繁瑣、不易 標準化和檢測費用高等問題，在臨床應用上受到一定局限。近年來，以熒光定量PCR為代表的基因擴增技術迅速發(fā)展，在檢測臨床病原體等方面發(fā)揮了 重要作用。因此，開發(fā)一種操作筒單快速、易標準化、檢測費用低的MDR 相關基因檢測方法具有良好的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光 定量PCR檢測試劑盒，能夠靈敏、特異、準確地同時檢測多種腫瘤多藥耐藥相 關基因。
為達到此目的，本發(fā)明提供了一種腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR 沖全測試劑盒，包括以下組成部分
a、 MDR1基因標準品含有MDR1基因編碼序列的重組載體；
b、 MRP1基因標準品含有MRP1基因編碼序列的重組載體；
c、 LRP基因標準品含有LRP基因編碼序列的重組載體；
d、 內(nèi)對照GAPDH基因標準品含有GAPDH基因編碼序列的重組載體；
e、 ^r測MDRl基因的上、下游引物和焚光探針 MDR1誦上游引4勿5 ，國ggaagccaatgcctatgacttta一3 ，, MDR1 -下游引物5，-gaaccactgcttcgctttctg-3 ，，
MDR1 -熒光探4十5' -tgaaactgcctcataaatttgacaccctgg-3 ，；
f、 檢測MRP1基因的上、下游引物和焚光探針 MRP 1誦上游引物5 ，-caatgctgtgatggcgatg-3,， MRP 1 -下游引物5，-gatccgattgtctttgctcttca-3，， MRP 1 -熒光探針5 ， -agaccaagacgtatcaggtggcccac-3 ， 5
g、 檢測LRP基因的上、下游引物和熒光探針 LPR國上游引4勿5 ，-cagctggccatcgagatca-3 ，， LRP-下游引凈勿5 ， -tccagtctctgagcctcatgc-3 ，, LRP-熒光探針5 ， -caactcccaggaagcggcggc-3 ，；
h、 檢測內(nèi)對照GAPDH基因的上、下游引物和熒光探針GAPDH-上;摔引4勿5 ， -catgagaagtatgacaacagcct-3 ，， GAPDH-下游引4勿5 ， -agtccttccacgataccaaagt-3 ，, GAPDH-焚光探針5'-atcatcagcaatgcctcctgcaccW 。
進一步，所述含有MDR1基因編碼序列的重組載體、含有MRP1基因編碼 序列的重組載體、含有LRP基因編碼序列的重組載體和含有GAPDH基因編碼 序列的重組載體均采用pGET載體；
進一步，該試劑盒還包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物01igo-(dT)、 dNTPs溶 液、M-MLV逆轉錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶中的一種或多種。
所述MDRl-焚光探針、MRPl-熒光探針、LRP-焚光探針和GAPDH-熒光探 針分別用不同的熒光標記物進行標記，如FAM(羧基熒光素)、TAMRA(羧基 四曱基羅丹明)等；所述逆轉錄緩沖液為常規(guī)逆轉錄緩沖液，如5x逆轉錄緩沖 液(由濃度為50mmol/L、 pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L的KC1、濃 度為4mmol/L的MgCb和濃度為10mmol/L的二碌u蘇糖醇DTT組成)等；所 述逆轉錄引物Oligo-(dT)為寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液為dATP (脫氧腺芬三磷酸)、dGTP (脫氧鳥苷三磷酸)、dCTP (脫氧胞苷三磷酸)和 dTTP (脫氧胸苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR緩沖液為常規(guī)定量PCR 緩沖液，如5 x定量PCR緩沖液(由濃度為10mmol/L、 pH為8.0的Tris-HCl、 濃度為50mmol/L的KC1和濃度為2mmol/L的MgCb組成)等。
本發(fā)明的目的之二在于提供所述腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢 測試劑盒的檢測方法，操作簡便、快速，易標準化，檢測費用低。
為達到此目的，本發(fā)明提供了所述腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR 檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟
a、從待測標本中提取細胞總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉錄緩沖液、 逆轉錄引物Oligo-(dT)、 dNTPs溶液和M-MLV逆轉錄酶，將RNA逆轉錄為 cDNA;b、 分別將已知拷貝數(shù)的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準 品倍比稀釋至108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 10'個拷貝數(shù)4il;
c、 分別以步驟a所得待測cDNA及步驟b所得倍比稀釋的MDRl、 MRP1 和LRP基因標準品為模板，加入內(nèi)對照GAPDH基因標準品，檢測MDR1基因 的上、下游引物和熒光探針，檢測MRP1基因的上、下游引物和熒光探針，檢 測LRP基因的上、下游引物和萸光探針，檢測內(nèi)對照GAPDH基因的上、下游 引物和熒光探針，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進行焚 光定量PCR;
d、 模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，根據(jù)倍比 稀釋的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品的循環(huán)閾值與初始拷 貝數(shù)分別繪制MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準曲線，再根據(jù)待 測cDNA的循環(huán)閾值對其含有的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因的 初始拷貝數(shù)進行定量。
進一步，所述步驟c的PCR擴增條件為93。C預變性3分鐘，然后93。C變 性30秒、56。C退火40秒，共40個循環(huán)。
本發(fā)明的有益效果在于MDR1、 MRP1和LRP基因與腫瘤多藥耐藥成明 顯正相關，且基因含量與使用的不同化療藥物密切相關。當發(fā)生基因對應的 底物藥物耐藥時，基因含量明顯增加，而停用此類藥物則基因含量降低。三 者協(xié)同、動態(tài)監(jiān)測肺瘤多藥耐藥的變化，對指導腫瘤化療，提高患者生存率 具有重要意義。本發(fā)明的定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法，能夠靈敏、特異、 準確地同時檢測MDR1、 MRP1和LRP基因，且操作簡單、快速，易標準化， 檢測成本低，適用于腫瘤患者多藥耐藥的臨床檢測和動態(tài)監(jiān)測，可以為臨床選 擇敏感化療藥物和評價治療效果提供依據(jù)，具有良好的應用前景。
具體實施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。
一 、腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的配置
本實施例的腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCIU企測試劑盒，包括以下 組成部分
a、 MDR1基因標準品含有MDR1基因編碼序列(GeneBank編號為 AF016535的第120位至第3959位堿基，SEQIDNo.l)的重組pGET載體；
b、 MRP1基因標準品含有MRP1基因編碼序列(GeneBank編號為 NM—004996的第176位至第4771位堿基，SEQIDNo.2)的重組pGET載體；
c、 LRP基因標準品含有LRP基因編碼序列(GeneBank編號為BCO15623 的第61位至第2742位堿基，SEQ ID No.3 )的重組pGET載體；
d、 內(nèi)對照GAPDH基因標準品含有GAPDH基因編碼序列(GeneBank 編號為NM—002046的第103位至第1110位堿基，SEQ ID No.4)的重組pGET 載體；
e、 檢測MDR1基因的上、下游引物和焚光探針
MDR1 -上游引物5 ，-ggaagccaatgcctatgacttta-3 ， ( SEQ ID No.5 )， MDRl-下游引物5，-gaaccactgcttcgctttctg-3， ( SEQ ID No.6 )， MDRl-焚光才果4十5，-FAM-tgaaactgcctcataaatttgacaccctgg-TAMRA-3，( SEQ ID No.7 );
f、 檢測MRP1基因的上、下游引物和熒光探針 MRPl-上游引物5，-caatgctgtgatggcgatg-3， ( SEQ ID No.8 )， MRPl-下游引物5，-gatccgattgtctttgctcttca-3， ( SEQ ID No.9), MRPl-焚光4果針5'-FAM-agaccaagacgtatcaggtggcccac誦TAMRA-3' (SEQ ID
No. 10);
g、 檢測LRP基因的上、下游引物和熒光探針 LPR-上游引物5'-cagctggccatcgagatca陽3， ( SEQ ID No.l 1 ), LRP-下游引物5,-tccagtctctgagcctcatgc-3， ( SEQ ID No.12 )，LRP-熒光探針5，-FAM-caactcccaggaagcggcggc-TAMRA-3，( SEQ IDNo.13 );
h、 檢測內(nèi)對照GAPDH基因的上、下游引物和熒光探針 GAPDH-上游引物5 ，-catgagaagtatgacaacagcct-3 ， ( SEQ ID No. 14 )， GAPDH-下游引物5 ，-agtccttccacgataccaaagt-3 ， ( SEQ ID No. 15 ), GAPDH-熒光4笨針5，-FAM-atcatcagcaatgcctcctgcacca-TAMRA-3， (SEQ ID
No. 16)。
i、 5x逆轉錄緩沖液，濃度為10pmol/i^l的逆轉錄引物Oligo-(dT:h6，濃度為 20pmol/pl的dNTPs溶液，濃度為lOU/pl的M-MLV逆轉錄酶，5 x定量PCR緩 沖液，濃度為2U/pl的TaqDNA聚合酶。
其中，MDR1、 MRPl、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品由以下方法制得 用TRIZol試劑提取K562/VCR耐藥細月包抹的總RNA，將所得RNA逆轉錄為 cDNA，再以所得cDNA為模板進行PCR擴增，分別獲得含有MDR1、 MRPl、 LRP和GAPDH基因編碼序列的片段DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收 純化后，用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I進行雙酶切，再與同樣經(jīng)Hind III 和BamH I雙酶切的pGET載體進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH-5a感受 態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質粒，即得分別含有MDR1、 MRP1、 LRP和 GAPDH基因編碼序列的重組pGET載體。當然，除pGET載體外，其它載體如 pBU18等也可用于構建含有MDRl 、 MRPl 、 LRP和GAPDH基因編碼序列的重 組載體，都可以達到本發(fā)明目的。
此外，逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、 dNTPs溶液、M-MLV逆轉 錄酶、定量PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶均為RT-PCR的常規(guī)試劑，使用者可 自行制備或從市場上購得，故本發(fā)明的檢測試劑盒也可以不包括上述常規(guī)試劑。
二、腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測 本實施例的腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方 法，包括以下步驟a、 從待測外周血、瘤組織或其他標本中提取細胞總RNA,用DEPC水(在 雙蒸水1000ml中，加入焦碳酸二乙酯DEPC lml,靜置4小時，即得)溶解， 在紫外分光光度計上測定波長為260nm時的吸光度，計算RNA的濃度；將所得 RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄體系為5 x逆轉錄緩沖液4^1、濃度為10pmol/pl 的逆轉錄引物01igo-(dT)16 2|il、濃度為20pmol4d的dNTPs溶液1^1、濃度為 10U/|il的M-MLV逆轉錄酶lpl、濃度為lOOng/^l的RNA 2^1、 DEPC水補充至 總體積為20pl;逆轉錄條件為37。C醉育l小時，再95。C變性3分鐘；
b、 分別將已知拷貝數(shù)的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準 品倍比稀釋至108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 10'個拷貝數(shù)4d;
c、 分別以步驟a所得待測cDNA及步驟b所得倍比稀釋的MDRl、 MRP1 和LRP基因標準品為模板，進行熒光定量PCR; PCR體系為5x定量PCR緩 沖液10^1、濃度為15pmol/nl的各基因上、下游引物各1^1、濃度為lOpmol/^l 的各基因熒光探針1^1、濃度為20pmol/pL的dNTPs溶液1^1、濃度為2U/|xl的 Taq DNA聚合酶1^1、濃度為lOOng/jil的待測cDNA或倍比稀釋的MDR1 、MRP1 和LRP基因標準品1^1、濃度為100ng/pl的內(nèi)對照GAPDH基因標準品1^1、雙 蒸水補充至總體積為50^1; PCR條件為93。C預變性3分鐘，然后93。C變性30 秒、56'C退火40秒，共40個循環(huán)(PCR條件可根據(jù)使用的萸光定量PCR儀略 做調整)；在每個循環(huán)結束時進行熒光檢測，檢測波長為525nm;
d、 模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，根據(jù)倍比 稀釋的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品的循環(huán)閾值與初始拷 貝數(shù)，用熒光定量PCR儀工作軟件分別繪制MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照 GAPDH基因標準曲線，再根據(jù)待測cDNA的循環(huán)閾值，從標準曲線上讀取其含 有的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因的初始拷貝數(shù)。
采用本發(fā)明試劑盒及其檢測方法，對約2000例外周血和瘤組織標本進行了 肺瘤多藥耐藥相關基因的檢測與方法學評價，結果顯示，采用本發(fā)明試劑盒及其檢測方法，能夠靈敏、特異、準確地同時檢測MDR1、 MRP1和LRP基因(見 表l)，符合臨床診斷試劑標準。
表1.本發(fā)明試劑盒及其檢測方法檢測腫瘤多藥耐藥相關基因的方法學評價
檢測基因靈敏度(％)特異性(％)準確性(％)
MDR1949090
MRP1959291
LRP979391
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡 管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通 技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不 偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序列 表
<110> 張鵬輝
<120> 腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒及其;f全測方法
<160> 16
<210> 1
<211> 3840
<212> DNA
<213> 智人(homo sapiens)
<220> <221> <222>
CDS (1).
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<400> 1
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gggaagagca caacagtcca gctgatgcag 1320 agtgUgatg gacaggatat Uggaccata 1380 gtggtgagtc aggaacctgt attgtttgcc 1440 cgtgaaaatg tcaccatgga tgagattgag 1500 Utatcatga aactgcctca taaatttgac 1560 agtggtgggc agaagcagag gatcgccatt 1620 ctcctgctgg atgaggccac gtcagccttg 1680 gctctggata aggccagaaa aggtcggacc 1740 gUcgtaatg ctgacgtcat cgctggtttc 1800 catgatgaac tcatgaaaga gaaaggcatt 1860 ggaaatgaag ttgaattaga aaatgcagct 1920 gaaatgtctt caaatgattc aagatccagt 1980 gtccgtggat cacaagccca agacagaaag 2040 atacctccag tttccttttg gaggattatg 2100 gttgttggtg tattttgtgc camt纖t 2160 ttttcaaaga Uataggggt tUtacaaga 2220 agtaacttgt tttcactatt gtttctagcc 2280 cttcagggtt tcacatttgg caaagctgga 2340 gttttccgat ccatgctcag acaggatgtg 2400 ggagcattga ctaccaggct cgccaatgat 2460 aggcttgctg taattaccca gaatatagca 2520 atctatggtt ggcaactaac actgttactc 2580 ggagUgUg aaatgaaaat gUgtctgga 2640 ggtgctggga agatcgctac tgaagcaata 2700 caggagcaga agtttgaaca tatgtatgct 2760 ttgaggaaag cacacatctt tggaattaca 2820 tcctatgctg gatgtttccg gtttggagcc 2880 gaggatgttc tgttagtatt ttcagctgtt 2940 agttcatttg ctcctgacta tgccaaagcc 3000 attgaaaaaa cccctttgat tgacagctac 3060 gaaggaaatg tcacatttgg tgaagttgta 3120 gtgcttcagg gactgagcct ggaggtgaag 3180 agtggctgtg ggaagagcac agtggtccag 3240 gggaaagtgc tgcttgatgg caaagaaata 3300 cacctgggca tcgtgtccca ggagcccatc 3360 gcctatggag acaacagccg ggtggtgtca 3420 gccaacatac atgccttcat cgagtcactg 3480 aaaggaactc agctctctgg tggccagaaa 3540 agacagcctc atattttgct tttggatgaa 3600gccacgtcag ctctggatac agaaagtgaa aaggttgtcc aagaagccct ggacaaagcc 3660 agagaaggcc gcacctgcat tgtgattgct caccgcctgt ccaccatcca gaatgcagac 3720 Uaatagtgg tgtttcagaa tggcagagtc aaggagcatg gcacgcatca gcagctgctg 3780 gcacagaaag gcatctattt ttcaatggtc agtgtccagg ctggaacaaa gcgccagtga 3840
〈210> 2
<211> 4596
<212> 腿
<213〉 智人(homo sapiens)
<220〉
<221> CDS
<222> (1)……(4596)
<400> 2
atggcgctcc
acgtggaata
gtgccttgtt
gaccgaggct
ctgtggatcg
ttcctggccc
acctttttaa
ttctggctgg
tt￡ia￡L￡Lg￡lgg
ctcttEtctca accatccacg ttctggtgga ctctggtcct tggaagaagg gatcctgccc atcgtcaagt tttgggccct tccgggccgc tggcagggct ctgcaccagt ggggctgtct ggggagattg attaacatga aatctgggcc
ggggcttctg ccagcaaccc tttacctctg acattcagat tctgctgggc cagtgtttct ttcagctgga tagccctagt
atgCCCELggt
ttcagctcgt accctaatcc tcacagggtt taaacaagga aatgcgccaa agccgaaaga ccccacagaa acttcctcat agatcUaaa acttctacac acttccacat atcggaaggc tcaacctcat tctggtcagc cttccgtcct
cagcgccgat cgacttcacc ggcctgtttc gacacctctc agacctcttc ggtcagccca gaggaggaag gtgtgcccta ggacctgttt cttgtcctgt ctgcccagag g"tgtccgg ggacacgtcg gactaggaag gagUccaag ggagtggaac gagcttcttc gttgctcatc cgtgctgctg ctgcttcgtc cctggtgatc gtctgtggac ccccctgcaa ggctggagtg
ggctccgacc aagtgctttc cccttctact aacaaaacca tactctttct actctcttgg ggagttcagt gccatcctga cgtgacatca ttctcagatc tccagcgcU ggctaccgcc gaacaagtcg cagccggtga gtggatgcga ccctctctgt Ucaaggcca aagUcgtga tttgtcactg agtggcatga accaattcag gctcagaggt gtcatccttg gcggtgatgg
cgctctggga
agwcacggt
tcctctatct
aaactgccU
gggaaagaag
gcatcaccat
cttcagggat
gatccaaaat
ctttctacgt
gctcacccct
cct tcctgtc
agcccctgga
tgcctgttU
aggttgtgta
atgaggaggt
Uaaggtgtt
tccacgacct
atgacacgaa
cctgcctgca
ggatcaagac
ccagaaaatc
tcatggactt
ctctctacct
tcctcatggt
ctggaatgtc 60 cctcgtgtgg 120 ctcccgacat 180 gggatttttg 240 tcggggcata 300 gctgcttgct 360 catgctcact 420 tatgacagcc 480 ctactUtcc 540 gttctcggaa 600 gaggatcacc 660 gggcagtgac 720 ggUaagaac 780 ctcctccaag 840 ggaggctttg 900 atacaagacc 960 gatgatgttt 1020 ggccccagac 1080 gaccctcgtg 1140 cgctgtcatt 1200 ctccacggtc 1260 ggccacgtac 1320 cctgtggctg 1380 gcccgtcaat 1440
16gctgtgatgg cgatgaagac caagacgtat cggatcaagc tgatgaacga aattctcaat gagctggcat tcaaggacaa ggtgctggcc aagtctgcct acctgtcagc cgtgggcacc gccttgtgca catttgccgt ctacgtgacc acagccttcg tgtctttggc cttgttcaac atggtcatca gcagcatcgt gcaggcgagt tcccatgagg agctggaacc tgacagcatc acgaacagca tcaccgtgag gaatgccaca ctgaatggca tcaccttctc catccccgaa ggctgcggaa agtcgtccct gctctcagcc cacgtggcta tcaagggctc cgtggcctat tctctccgag aaaacatcct ttttggatgt atacaggcct gtgccctcct cccagacctg attggcgaga agggcgtgaa cctgtctggg gccgtgtact ccaacgctga catttacctc catgtgggaa aacacatctt tgaaaatgtg acgcggatct tggtcacgca cagcatgagc atgagtggcg gcaagatctc tgagatgggc gccttcgctg agttcctgcg tacctatgcc aacggggtca cgggcgtcag cggtccaggg ctggtgacgg acagtgcagg gaagcaactg agtggggaca tcagcaggca ccacaacagc aaggaggaga cctggaagct gatggaggct tccgtgtact gggactacat gaaggccatc cttttcatgt gtaaccatgt gtccgcgctg gatgacccca tcgtcaacgg gactcaggag gccctgggca tttcacaagg gatcgccgtg gggatcttgg cttcccgctg tctgcacgtg atgagcttct ttgagcggac ccccagtggg gacacagtgg actccatgat cccggaggtc gtcattggtg cctgcatcgt Utcctgctg ccccttggcc tcatctactt cUcgtccag aagcgcctcg agtcggtcag ccgctccccg ggggtcagcg tcattcgagc cttcgaggag aaggtggacg agaaccagaa ggcctattac gtgcggctgg agtgtgtggg caactgcatc tccaggcaca gcctcagtgc tggcttggtg accacgtact tgaactggct ggUcggatg
caggtggccc acatgaagag caaagacaat 1500 gggatcaaag tgctaaagct Uatgcctgg 1560 atcaggcagg aggagctgaa ggtgctgaag 1620 Ucacctggg tctgcacgcc ctttctggtg 1680 attgacgaga acaacatcct ggatgcccag 1740 atcctccggt Ucccctgaa cattctcccc 1800 gtctccctca aacgcctgag gatctttctc 1860 gagcgacggc ctgtc謹ga cggcgggggc 1920 ttcacctggg ccaggagcga ccctcccaca 1980 ggtgctttgg tggccgtggt gggccaggtg 2040 ctcttggctg agatggacaa agtggagggg 2100 gtgccacagc aggcctggat tcagaatgat 2160 cagctggagg aaccatatta caggtccgtg 2220 gaaatcctgc ccagtgggga tcggacagag 2280 ggccagaagc agcgcgtgag cctggcccgg 2340 ttcgatgatc ccctctcaigc agtggatgcc 2400 attggcccca aggggatgct gaagaacaag 2460 tacttgccgc aggtggacgt catcatcgtc 2520 tcctaccagg agctgctggc tcgagacggc 2580 agc歸gagc aggagcagga tgcagaggag 2640 aaggaagcaa agcaaatgga gaatggcatg 2700 cagagacagc tcagcagctc ctcctcctat 2760 accgcagaac tgcagaaagc tgaggccaag 2820 gacaaggcgc agacagggca ggtcaagctt 2880 ggactcttca tctccUcct cagcatcttc 2940 gcttccaact attggctcag cctctggact 3000 cacacgaaag tccggctgag cgtctatgga 3060 UtggcUct ccatggccgt gtccatcggg 3120 gacctgctgc acagcatcct gcggtcaccc 3180 aacctggtga accgcUctc caaggagctg 3240 atcaagatgt tcatgggctc cctgttcaac 3300 gccacgccca tcgccgccat catcatcccg 3360 aggttctacg tggcttcctc ccggcagctg 3420 gtctattccc atttcaacga gaccttgctg 3480 caggagcgct tcatccacca gagtgacctg 3540 cccagcatcg tggccaacag gtggctggcc 3600 gttctgtttg ctgccctgtt tgcggtgatc 3660 ggcctctcag tgtcUactc attgcaggtc 3720 tcatctgaaa tggaaaccaa catcgtggcc 3780gtggagaggc tcaaggagta ttcagagact gagaaggagg cgccctggca aatccaggag 3840 acagctccgc ccagcagctg gccccaggtg ggccgagtgg aattccggaa ctactgcctg 3900 cgctaccgag aggacctgga cttcgttctc aggcacatca atgtcacgat caatggggga 3960 ga雄ggtcg gcatcgtggg gcggacggga gctgggaagt cgtccctgac cctgggctta 4020 tttcggatca acgagtctgc cgaaggagag atcatcatcg atggcatcaa catcgccaag 4080 atcggcctgc acgacctccg cttcaagatc accatcatcc cccaggaccc tgttUgUt 4140 tcgggUccc tccgaatgaa cctggaccca ttcagccagt actcggatga agaagtctgg 4200 acgtccctgg agctggccca cctgaaggac Ucgtgtcag cccttcctga caagctagac 4260 catgaatgtg cagaaggcgg ggagaacctc agtgtcgggc agcgccagct tgtgtgccta 4320 gcccgggccc tgctgaggaa gacgaagatc cttgtgttgg atgaggccac ggcagccgtg 4380 gacctggaaa cggacgacct catccagtcc accatccgga cacagttcga ggactgcacc 4440 gtcctcacca tcgcccaccg gctcaacacc atcatggact acacaagggt gatcgtcttg 4500 gacaaaggag aaatccagga gtacggcgcc ccatcggacc tcctgcagca gagaggtctt 4560 ttctacagca tggccaaaga cgccggcttg gtgtga 4596
<210> 3
<211〉 2682
<212〉 腿
<213> 智人(homo sapiens) <220>
<221〉 CDS
<222〉 (1)……(2682)
<400> 3
atggcaactg aagagttcat cagaacagca acgtgtcccg g卿gggtac tgtttgcccc gtggccaacc ctgtgtctcg gttcggcUc gccacgctga ccaggggagg tgctgga, ctccatctaa aggcgctgct gatgagtggc Uttcgaggg gagatcattc aggccaccat gagtgctggg accgggacgg gtaggggcgt acctcccagc cttacggaaa agacagccct gtgtcccgcc gcactgggga ccagatgtcc acgaggaggt
catccgcatc cccccatacc actatatcca tgtgctggac 60
tgtggaggtc gggccaaaga cctacatccg gcaggacaat 120
catgcgcatg gtgaccgtcc ccccacgtca ctactgcaca 180
ggatgcccag ggcUggtgc tgtttgatgt cacagggcaa 240
cctcgag3tc cggctggccc aggacccctt ccccctgtac 300
ggacatcaca cccctgcagg tggttctgcc caacactgcc 360
tgattttgag gat雄gatg gagacaaggt ggtggcagga 420
acctggcacg tacatccccc ggaaggaagt ggaggtcgtg 480
catcaggcag aaccaggctc tgcggctcag ggcccgcaag 540
caaggagagg gtg織gggg aagaatggct ggtcaccaca 600
ggtgtttgag gaggttctgg atttggtgga cgccgtcatc 660
gcacctccgg gctcggcgga acttccggga cttcagggga 720
ggagtggctg gtaacagtgc aggac歸ga ggcccacgtg 780
gctgggggtt gtgcccatca ccaccctggg cccccacaac 840tactgcgtga gtggtcaagg caggatgtgt gaggaggggg ggacccctgg cctctagacg gtgattggaa cccggggtgg gacacagcta cgcgtgcccc gtcttcgggc tcagctgggc gacttcttca ctggcctaca ctcttttcag ggggccgtgg actgctgtct aggccccggg cagtcagtgg gccatcgaga gagcaggaag aaagctcgca actgccaagg gtgctgcagg agggtccaga gtgagcaagg gceataggcc ctgctccagt ctcttcaaca agggtggcca caagctcctg
ttctcgaccc gagagaagtc atgtgctgtc aggatgagga agtatgtgcc agaacgaggg gcacctacat aggagctgct agagcctcca acaacgctgc ctgagctggt ggcccaagcg cagacgtcat actggcactt tgccagactt cctctgtcac ttggctttga accaggctgt agcctgtgga tcaccaccaa cccgcggccg aggaacUtt cggaggccga ccaagctaaa aggtccgaga ctcagcagct ccagcaccat ccctgggcct cagcctttgg gtgggcccag gagacaacca
tgtcggaccg ttttttcctc ggagcagcag gaaggtctca atctgccaaa catctatgtg gctgacccag gaacaagggg gcccUggcg ggtgcaggtg gtcgctgggt tccccatgcc caccatcgaa tgaggtgaat tgtaggtgat tttcgatgac gacctcggaa cttcccccaa tcagaggacc ctcccaggaa gcttgagcgg ggagctggag gtcccgtgcg agcacaggcc gctggaactg ggctgaggtg cagggacctt gaasitcaacc gctgctgggg ccctggggag cgtggtgcct
gatgg固ga cagccaggag gggctgctgc caccaggctg gtggaggtgg caggatgtca gacgaagtcc caggaccctc ccccggaaca tacgactacc cctgaggagc cgccgtgcgc acggcggatc gaccggaagg gcctgcaaag Uccataaga gcgaagggcc 雄gggctgg cgggacgccc gcggcggcca cagaagatcc gctctgagca gaggcEigccc ttggccattg gtctatgccc gaggtgaaga gctgtggctg ctcatcaccg atggggcccg gggatatccc gtactgcgct
atcagctggg agcagctgga tgagggccct gggaccactg tggaggagcg agaccggaaa tgtgggagaa tggcagacag agacccgtgt gagagaagcg agt tcacagt tctgcctgct atgccaggct acccccaaga ccatcgcatc actcagcccg ccgatggcat tggtcagcag tgcaacgcag agc"gaggc tggaccagtc tggccgtgga
gg￡Lttg￡Lggg
aaacggaggc gggcccagct agttcaagca ggcctgagat atggctccac agggtcagcc cccagtctgc aa
gcagaagcgc 900 acaaggcatc 960 gcagcccctg 1020 gctcatccgc 1080 ccaggccatc 1140 ggtgcgcgct 1200 agagctgcct 1260 gggtgagaag 1320 ggtcagctac 1380 agcccgcgtg 1440 gttgtccctc 1500 gctggggcct 1560 gcaactgcag 1620 gacggccaag 1680 ccgggtgcgg 1740 catcattcgc 1800 ggccctgccc 1860 tgtggacgtg 1920 cgtccagctg 1980 tcagagactg 2040 agaagccgag 2100 gagcaccggg 2160 agaagggtcc 2220 tgagctccag 2280 ggagctggag 2340 gatgacagag 2400 gcaggtaaaa 2460 tcccatcaac 2520 cctgggcaga 2580 tcaggcccct 2640 2682
<210> 4
<211> 1008
<212> 腿
<213> 智人(homo sapiens)
<220〉
<221> CDS<222> (1)……(1008)
<400〉 4
atggggaagg tgaaggtcgg agtcaacgga gctgctttta actctggtaa agtggatatt aactacatgg tttacatgtt ccaatatgat aaggctgaga acgggaagct tgtcatcaat gatccctcca aaatcaagtg gggcgatgct gtcttcacca ccatggagaa ggctggggct atctctgccc cctctgctga tgcccccatg gacaacagcc tcaagatcat cagcaatgcc gccaaggtca tccatgacaa ctttggtatc at6actgcca cccagaagac tgtggatggc ggggctctcc agaacatcat ccctgcctct atccctgagc tgaacgggaa gctcactggc tcagtggtgg acctgacctg ccgtctagaa gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc gtggtctcct ctgacttcaa cagcgacacc attgccctca acgaccactt tgtcaagctc agcaacaggg tggtggacct catggcccac
tttggtcgtaUgggcgcctggtcaccagg60
gttgccatcaatgaccccttcaUgacctc120
tccacccatggcaaattccatggcaccgtc180
ggaaatcccatcaccatcttccaggagcga240
ggcgctgagtacgtcgtggagtccactggc300
catttgCEiggggggagccaaaagggtcatc360
ttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagUt420
tcctgcaccaccaactgcttagcacccctg480
gtggaaggactcatgaccacagtCCELtgCC540
ccctccgggaaactgtggcgtg"ggccgc600
actggcgctgccaaggctgtgggcaaggtc660
atggccttccgtgtccccactgccaacgtg720
aaacctgccaaatatgatgacatcaagaag780
aagggcatcctgggctacactgagcaccag840
cactcctccacctttgacgctggggctggc900
atttcctggtatg汪caacgaatttggctac960
atggcctcca aggagtaa1008
<210〉 5
<211〉 23
<212> ■
<213〉 人工序列
<220>
<223〉 MDRl-上游引物
<400> 5
ggaagccaat gcctatgact tta 23
<210> 6
<211> 21
<212> 隱
<213> 人工序列
<220>
<223> MDRl-下游引物
20<400> 6
gaaccactgc ttcgctttct g 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220>
<223> MDRl-焚光寺笨4十
<400> 7
tgaaactgcc tcataaattt gacaccctgg 30
<210〉 8
<211〉 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MRP1-上游引物
<400> 8
caatgctgtg atggcgatg 19
<210> 9
<211> 23
<212> 駆
<213> 人工序列
<220〉
<223〉 MRPl-下游引物
<400> 9
gatccgattg tctttgctct tea 23
<210> 10
<211> 26
<212> DNA<213> 人工序列 <220>
<223> MRP1-熒光探針
<400〉 10
agaccaagac gtatcaggtg gcccac 26
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LRP-上游引物
<400> 11
cagctggcca tcgagatca 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LRP-下游引物
<400〉 12
tccagtctct gagcctcatg c 21
<210> 13
<211> 21
<212> 腿
<213> 人工序列
<220〉
<223〉 LRP-熒光探針
<400〉 13
caactcccag gaagcggcgg c
22<210> 14
<211> 23
<212> 腿
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-上游引物
<400〉 14
catgagaagt atgacaacag cct
<210> 15
<211> 22
<212> ■
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-下游引物
<400〉 15
agtccttcca cgataccaaa gt
<210> 16
<211〉 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-熒光探針
<400> 16
atcatcagca atgcctcctg caeca
權利要求
1、腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于包括以下組成部分a、MDR1基因標準品含有MDR1基因編碼序列的重組載體；b、MRP1基因標準品含有MRP1基因編碼序列的重組載體；c、LRP基因標準品含有LRP基因編碼序列的重組載體；d、內(nèi)對照GAPDH基因標準品含有GAPDH基因編碼序列的重組載體；e、檢測MDR1基因的上、下游引物和熒光探針MDR1-上游引物5’-ggaagccaatgcctatgacttta-3’，MDR1-下游引物5’-gaaccactgcttcgctttctg-3’，MDR1-熒光探針5’-tgaaactgcctcataaatttgacaccctgg-3’；f、檢測MRP1基因的上、下游引物和熒光探針MRP1-上游引物5’-caatgctgtgatggcgatg-3’，MRP1-下游引物5’-gatccgattgtctttgctcttca-3’，MRP1-熒光探針5’-agaccaagacgtatcaggtggcccac-3’；g、檢測LRP基因的上、下游引物和熒光探針LPR-上游引物5’-cagctggccatcgagatca-3’，LRP-下游引物5’-tccagtctctgagcctcatgc-3’，LRP-熒光探針5’-caactcccaggaagcggcggc-3’；h、檢測內(nèi)對照GAPDH基因的上、下游引物和熒光探針GAPDH-上游引物5’-catgagaagtatgacaacagcct-3’，GAPDH-下游引物5’-agtccttccacgataccaaagt-3’，GAPDH-熒光探針5’-atcatcagcaatgcctcctgcacca-3’。
2、根據(jù)權利要求1所述的腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于所述含有MDR1基因編碼序列的重組載體、含有MRP1基因編碼序列的重組載體、含有LRP基因編碼序列的重組載體和含有GAPDH基因編碼序列的重組載體均采用pGET載體。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的腫瘤多藥耐藥相關基因的焚光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉錄酶、定量PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶中的一種或多種。
4、 權利要求1所述的腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟a、 從待測標本中提取細胞總RNA,測定RNA濃度，加入逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、 dNTPs溶液和M-MLV逆轉錄酶，將RNA逆轉錄為cD歐b、 分別將已知拷貝數(shù)的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品倍比稀釋至108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 10!個拷貝數(shù)/^l;c、 分別以步驟a所得待測cDNA及步驟b所得倍比稀釋的MDR1 、 MRP1和LRP基因標準品為模板，加入內(nèi)對照GAPDH基因標準品，檢測MDR1基因的上、下游引物和焚光探針，檢測MRP1基因的上、下游引物和熒光探針，檢測LRP基因的上、下游引物和熒光探針，檢測內(nèi)對照GAPDH基因的上、下游引物和熒光探針，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進行熒光定量PCR;d、 模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對凄t存在線性關系，根據(jù)倍比稀釋的MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制MDR1、 MRP1、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準曲線，再根據(jù)待測cDNA的循環(huán)閾值對其含有的MDR1 、 MRP1 、 LRP和內(nèi)對照GAPDH基因的初始拷貝數(shù)進行定量。
5、 根據(jù)權利要求4所述的腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于所述步驟c的PCR擴增條件為93'C預變性3分鐘，然后93。C變性30秒、56。C退火40秒，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤多藥耐藥相關基因的熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括以下組成部分MDR1、MRP1、LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品，檢測MDR1、MRP1、LRP和內(nèi)對照GAPDH基因的上、下游引物和熒光探針；該試劑盒的檢測方法是先提取待測標本的細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，再與MDR1、MRP1、LRP和內(nèi)對照GAPDH基因標準品作熒光定量PCR，計算待測標本中MDR1、MRP1、LRP基因的初始拷貝數(shù)；本發(fā)明能靈敏、特異、準確地同時檢測MDR1、MRP1和LRP基因，且操作簡單快速，易標準化，檢測費用低，適用于腫瘤患者多藥耐藥的動態(tài)監(jiān)測，可以指導腫瘤化療用藥。
文檔編號C12Q1/68GK101565752SQ20091010398
公開日2009年10月28日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2009年5月27日
發(fā)明者張鵬輝 申請人:張鵬輝