專利名稱：一種非天然l-氨基酸的生物催化去消旋化制備方法
技術領域：
本發明涉及非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制備方法，屬于生物催化不對稱氧化制備手性醫藥中間體技術領域。
背景技術：
非天然L-氨基酸是自然界中不存在的非蛋白源氨基酸。非天然L-氨基酸及其衍生物如保護非天然L-氨基酸、非天然L-氨基醇等是手性藥物的關鍵中間體，在醫藥領域有廣泛應用。例如，L-2-氨基丁酸是抗癲癇藥物左乙拉西坦中間體，L-2-氨基戊酸是抗高血壓藥物培哚普利中間體，L-2-氨基己二酸是谷氨酰胺合成酶抑制劑中間體，L-叔亮氨酸是抗病毒、抗腫瘤和抗炎藥物中間體，L-環己基甘氨酸是環氧合酶(COX-幻抑制劑JTE-522 中間體，L-鄰氯苯甘氨酸是抗血栓藥物氯吡格雷中間體，L-對氟苯甘氨酸是抗癌藥物中間體，L-2-氨基-4-苯基丁酸是普利類抗高血壓藥物中間體，L-哌啶-2-羧酸是局麻藥羅哌卡因、抗精神病藥物硫利噠嗪中間體，L-哌嗪-2-羧酸是HIV蛋白酶抑制劑中間體。非天然L-氨基酸不能像天然L-氨基酸一樣采用發酵法生產。盡管非天然L-氨基酸可以采用化學法制備，但化學不對稱合成采用價格昂貴的手性源、手性助劑或手性催化劑，化學拆分工藝路線復雜、環境污染大。無論是化學不對稱合成或是化學拆分，都存在收率低、光學純度不高、生產成本高的缺點。生物催化法具有立體選擇性高、反應條件溫和、 環境友好等特征，是制備對映純非天然L-氨基酸極為有用的方法。目前大量具有商業價值的非天然L-氨基酸都是用生物催化法制備的(Breuer M,Ditrich K,Habicher T,HauerB. Angew Chem Int Ed，2004，43，788)。生物催化法包括酶拆分法和酶催化不對稱合成法。外消旋體的酶催化動力學拆分是制備非天然L-氨基酸的一個最成功的策略，但涉及消旋氨基酸的衍生以及游離氨基酸和衍生氨基酸的分離，工藝復雜，非天然L-氨基酸的理論收率僅為50%。因此，為了避免D-對映體的浪費，有必要開發收率> 50%的非天然L-氨基酸酶催化或化學酶催化合成方法。這可以通過三個途徑實現前手性底物的酶催化不對稱合成，酶催化動態動力學拆分，酶催化去消旋化。酶催化去消旋化可以采用兩種策略采用具有互補對映選擇性的雙酶或多酶系統如氨基酸脫氫酶/轉氨酶；對映選擇性酶催化氧化反應和非選擇性、非酶還原反應組合。D-氨基酸氧化酶在分子氧存在下，立體選擇性催化D-氨基酸氧化脫氫為相應的亞氨基酸，亞氨基酸經歷非酶水解為酮酸。D-氨基酸氧化酶已成功用于從頭孢菌素C工業合成7-氨基頭孢烷酸(7-ACA，半合成抗生素的關鍵母核)、去除L-氨基酸中的少量D-對映體和從DL-氨基酸制備非天然L-氨基酸。為了獲得收率> 50 %的非天然L-氨基酸， 對D-氨基酸氧化酶催化DL-氨基酸氧化和化學還原劑組合體系進行了廣泛的研究。組合 D-氨基酸氧化酶和用于DL-哌啶-2-羧酸的去消旋化，L-對映體的產率和光學純度均>98% (Soda K, Oikawa Τ, Yokoigawa K. J Mol Catal B =Enzymatic 2001，11，149.)。 以NaCNBH3替代NaBH4為還原劑和豬腎D-氨基酸氧化酶為生物催化劑，實現了哌嗪_2_羧酸的去消旋化，收率和ee分別為86%和> 99%。以NaBH4作還原劑，DL-苯甘氨酸、2-氨基丁酸、環戊基甘氨酸等非環和環狀氨基酸去消旋化產生的非天然L-氨基酸收率75-90 %， ee > 99% (Beard TM, Turner NJ. Chem Commun，2002，246.)。在這些方法中采用 NaBH4 或 NaCNBH3與D-氨基酸氧化酶組合將DL-氨基酸去消旋化轉化為非天然L-氨基酸有3個缺點l)NaBH4對水敏感，在D-氨基酸氧化酶表現最大活性和穩定性的pH(酸性或中性)條件下易分解。為使還原有效，必須多次緩慢加入且當量很大(500個當量以上)。雖然NaCNBH3 比NaBH4的水穩定性好，但反應性較低，從而導致產生的非天然L-氨基酸收率低；幻大量 NaBH4的加入致使操作pH接近10。在如此高pH下，D-氨基酸氧化酶容易通過不可逆變性快速失活，增加制備成本，難于規模化；幻必須采用價格高昂的D-氨基酸氧化酶作生物催化劑。因此有必要提出基于D-氨基酸氧化酶的適合非天然L-氨基酸規模化制備的生物催化去消旋化方法。 以D-氨基酸氧化酶為生物催化劑，組合化學催化還原制備非天然L-氨基酸的方法未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的非天然L-氨基酸生物催化去消旋化制備方法，利用固定化D-氨基酸氧化酶高度的對映選擇性，組合化學催化氫轉移反應，以高的光學活性和高的收率制備非天然L-氨基酸。方法的技術路線如下
權利要求
1.一種非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制備方法，其特征是非天然DL-氨基酸中的D-對映體以D-氨基酸氧化酶為生物催化劑，在氧源存在下對映選擇性氧化為亞氨基酸， L-氨基酸保留；亞氨基酸采用金屬催化劑、在氫源存在下原位轉化為DL-氨基酸，反應過程中產生的過氧化氫利用氧化劑原位分解為水和分子氧；方法步驟如下1)選擇固定化D-氨基酸氧化酶為生物催化劑將化學合成的非天然DL-氨基酸中的 D-對映體氧化為亞氨基酸，L-氨基酸保留；2)選擇高活性的過氧化氫酶將上述反應過程中形成的過氧化氫原位分解為水和分子氧；3)選擇Pd-C為化學氫轉移催化劑將反應中形成的亞氨基酸原位轉化為非天然DL-氨基酸，用于非天然DL-氨基酸向非天然L-氨基酸的連續轉化；4)反應體系構建在50ml甲酸銨溶液(lmol/L，pH7.2)中加入l_4g DL-氨基酸，l_4g 固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)，l-2ml過氧化氫酶(50000U/ml)，Ig Pd-C (10% )；5)反應條件反應溫度30°C，pH7.2，磁力攪拌，勻速通入氧氣，反應時間16-30小時；6)反應液處理反應完成后減壓濃縮，調等電點，冷凍析出非天然L-氨基酸，紅外干O
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述非天然L-氨基酸選自L-脂肪族氨基酸中的L-2-氨基丁酸、L-2-氨基戊酸、L-2-氨基己二酸、L-叔亮氨酸；或選自L-脂環族氨基酸中的L-環己基甘氨酸、L-哌啶-2-羧酸或L-哌嗪-2-羧酸；或選自L-芳香族氨基酸中的L-鄰氯苯甘氨酸、L-對氟苯甘氨酸、L-2-氨基-4-苯基丁酸。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是底物非天然DL-氨基酸的使用濃度為 0.1-0. 5mlo/L。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是D-氨基酸氧化酶為固定化酶。固定化D-氨基酸氧化酶與DL-氨基酸的質量比為0. 5-1. 0。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是氧化DL-氨基酸中D-對映體為亞氨基酸的氧源為空氣氧或純氧。
6.根據權利要求1所述的方法，金屬催化劑為Pd-C、鈀黑、鈀/氧化鋁；Pd-C催化劑與固定化D-氨基酸氧化酶的質量比為0. 3-1. 0。
7.根據權利要求1所述的方法，氫源為氫氣或甲酸銨；甲酸銨既作為生物催化氧化反應的緩沖鹽，也作為化學催化氫轉移反應的氫供體；甲酸銨濃度為l-3mol/L，最好為lmol/ L0緩沖液pH為5-8，最好為7. 2。
8.根據權利要求1所述的方法，分解反應過程中產生的過氧化氫的氧化劑為狗3+、過氧化氫酶，最好為過氧化氫酶。過氧化氫酶與固定化D-氨基酸氧化酶的活性比為300-1000。
9.根據權利要求1所述的方法，反應溫度為10-40°C，最好為30°C。
全文摘要
本發明提供一種非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制備方法。該方法以具有高對映選擇性的固定化D-氨基酸氧化酶為生物催化劑，在分子氧存在下催化化學合成的DL-氨基酸中的D-對映體氧化為亞氨基酸，L-氨基酸保留。以Pd-C為催化劑，HCOONH4為氫供體通過化學催化氫轉移反應將形成的亞氨基酸原位轉化為DL-氨基酸，實現DL-氨基酸向L-氨基酸的連續轉化。反應過程中產生的過氧化氫利用過氧化氫酶原位高效分解為水和分子氧。方法用于制備手性藥物中間體L-2-氨基丁酸、L-2-氨基戊酸、L-2-氨基己二酸、L-叔亮氨酸、L-環己基甘氨酸、L-鄰氯苯甘氨酸、L-對氟苯甘氨酸、L-2-氨基-4-苯基丁酸、L-哌啶-2-羧酸、L-哌嗪-2-羧酸，收率75-95％，ee＞99％。
文檔編號C12P41/00GK102174632SQ20091010388
公開日2011年9月7日 申請日期2009年5月19日 優先權日2009年5月19日
發明者夏仕文, 徐紅梅, 方國蘭, 李陽, 楊智慧, 葛超, 郭麗娟 申請人:重慶凱樂爾生物催化技術有限公司, 重慶郵電大學