專利名稱：光學純n-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物催化技術領域和藥物合成領域，具體涉及一種光學純 1^-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸的制備方法。
背景技術：
人的a-凝血酶是一個類似胰島素的絲氨酸蛋白，它包括兩個多肽鏈A (含有36個氨基酸殘基)和B ( 259個氨基酸殘基)，在生物體系起到凝 血作用。凝血酶發揮凝血作用，通常有兩條途徑內源激活途徑和外源激 活途徑。外源激活途徑是在組織損傷時，產生凝血素，激活凝血酶原酶， 最終導致形成凝血酶；內源激活途徑是由于生理平衡被打石皮，激活凝血因 子，最終形成凝血酶。這兩種途徑都是階梯式的活化酶原，再聚集于產生 凝血酶這一點。凝血酶使纖維蛋白原交聯形成纖維蛋白，它再與激活的凝 血因子交聯，最后形成血塊。這一過程又會加強血小板的聚集，正反饋這 個凝血過程，加速交聯作用。在正常的生理條件下，內源激活的凝血系統 被抗凝血系統和纖維蛋白溶解系統平衡。但當病原誘發破壞系統平衡時， 抗凝系統處于主導，導致出血；凝血系統主導，血液流通的管路就會形成 血栓及其一 系列并發癥，這些是心腦血管病的引發因素。
凝血酶處于凝血交聯反應的最后階段，當凝血酶抑制劑以一定的比例 與人的a-凝血酶的一個或所有的架構域相作用，從而使凝血酶喪失結合底 物的能力，抑制凝血酶的催化活力，這樣就阻斷纖維蛋白的形成，阻止凝 血酶催化的止血反應及凝血酶誘導的血小板激活反應，達到抗凝抗栓的目 的。
臨床使用的凝血酶抑制劑有低分子量的肝素和華法令，^f旦他們存在許 多不足之處。低分子量的肝素延長治療導致發生骨質疏松癥的危險性增 加，還可以引起"肝素誘導性血小板減少"，肝素依賴于內源性凝血酶抑 制劑抗凝血酶血漿水平，它不能使凝血塊結合的凝血酶失活。口服抗凝劑 如華法令( 一種維生素K拮抗劑)可有效減少大手術后的深部靜脈血栓形成，然而它有導致嚴重出血的危險性，需要的頻繁的實驗室監測控制。
目前，現有的低分子量凝血酶抑制劑包括低分子肽型、氨基酸型和肽 類似物型凝血酶抑制劑，這幾類化合物的分子都具有一至四個肽鍵。
Claesson在Blood Coagul, Fibrinol. ( 1994 ) 5，411中介紹了低分子量凝血酶 抑制劑的早期研制。作為嗎啉酮類凝血酶抑制劑的母體中心結構，不同構 型的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸，其對凝血酶的抑制活性明顯的表現出差 異。A. Dahlgren等人在Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 1829-1839中報道了 如式(III)所示的(R)-嗎啉酮凝血酶抑制劑和(S)-嗎啉酮凝血酶抑制劑，其合 成方法是由光學純底物出發，得到光學純目標產物，研究顯示，(R)-N-二 苯基曱基取代的嗎啉酮凝血酶抑制劑抑制活性遠大于(S)-N-二苯基甲基取 代的嗎啉酮凝血酶抑制劑。相反的，Jonas W.在J. Med. Chem. ( 2003 ) ， 46, 3985-4001的報道中認為(S)-N-(2,5-二曱氧基)苯磺酰胺取代的嗎啉酮凝血 酶抑制劑抑制活性是很高的。可見，嗎啉酮類的構型與其凝血酶抑制劑抑 制活性有很大的關系，研究制備特定構型的嗎啉酮類凝血酶抑制劑中間體 的方法具有重大的意義。
NH
(III)
發明內容
本發明提供了一種光學純N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸的制備方法，利用 不同脂肪酶的催化選擇性，通過拆分外消旋的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯 底物，可以方便地制備(R)- N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸和(S)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸，為(R)-嗎啉酮類凝血酶抑制劑和(S)-嗎啉酮類凝血酶抑制劑的 制備提供了 一條可行的途徑。
一種光學純N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸的制備方法，包括如下步驟 以脂肪酶為催化劑，在水/有機溶劑體系中，水解拆分外消旋的式(I )
5所示的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯底物，經后處理制得式(II )所示的(R)->^-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸或(8)->1-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸；
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，所述的R為二苯曱基、(3，,4，-二甲氧基)千基、(4，-甲氧基)節基、 (4，-氯)芐基、(4，-二甲胺基)爺基、苯乙基、芐基、苯基、(2，,5，-二甲氧基)-苯磺酰胺基、辛基、異丙基、乙基或曱基。
所述的&為Q ~ C18的烷基或d ~ C18的烯基，優選Q ~ C8的烷基或 C廣Q的烯基，更優選辛基、丁基、乙基、甲基或乙烯基。
本發明可以使用固定化的脂肪酶，也可以使用游離脂肪酶。
作為優選，所述的脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶(CAL-B: Candida antarctica lipase B )或固定4匕米赫毛霉月旨肪酶(Lipozyme immobilized from Mucormiehei)時，在7jc/有機溶劑體系中，水解拆分外消旋的上述式(I ) 所示的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯底物，經后處理制得上述式(II )所示 的(8)-1^-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸。
所述的脂肪酶為褶鈹,i絲酵母脂肪酶(CRL: Candidarugosalipase) 或圓柱狀假絲酵母脂肪酶(CCL: lipase from Candida cylindracea)時，在 水/有機溶劑體系中，水解拆分外消旋的上述式(I )所示的N-取代-嗎啉 -3-酮-2-乙酸酯底物，經后處理制得上述式(II )所示的(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸。
所述的式(I )所示的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯在水/有機溶劑體系 中的濃度為5~100g/L;過高的底物濃度容易導致反應體系呈現非均相態 而影響拆分的結果。
由于過高的脂肪酶濃度并不能進一步提高酶促反應活性，卻會相應增 加反應原料的消耗成本，因此從節約成本的角度考慮，所述的脂肪酶在水 /有機溶劑體系中的濃度優選為5 ~ 50g/L。
所述的水解拆分最好是在轉速為100~200r/min的搖床中進行，反應 溫度為5 60。C，反應時間為1~50小時；優選反應溫度為10~30°C,反應時間為1 50小時。該優選的反應溫度可以維持酶更高的水解活性，另
從而獲得最好的拆分結果。
本發明的水解拆分反應對壓強沒有特別的要求，在常壓下進行即可。 所述的后處理為在水解拆分結束后，離心去除脂肪酶，濾液用飽和 NaHCOr乙酸乙酯萃取，旋干后得到光學純(R)- N-取代-嗎啉-3-S同-2-乙酸 或(S)- N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸。
所述的水/有機溶劑體系即為水和有才幾溶劑的混合物，其中有機溶劑可 以選用本領域通用的親水性的有機溶劑，如二曱基亞砜、N，N-二曱基甲酰 胺、二氧六環、乙腈、丙酮、叔戊醇中的一種，也可以選用本領域通用的 疏水性的有機溶劑，如甲基叔丁基醚、二異丙基醚、乙醚、丁醚、苯曱醚、 苯醚、正己烷、異辛烷、環己烷、曱苯、二氯曱烷中的一種，優選疏水性 的曱基叔丁基醚、二異丙基醚、苯曱醚或正己烷。疏水性有機溶劑由于具 有較高的LogP值，極性弱，不會像強極性溶劑一樣容易剝奪酶分子表面 的必需水，因此，優選的非極性有機溶劑(即疏水性有機溶劑)與水組成 的體系中酶的活性更容易得到維持，從而保證好的拆分效果，而且體系中 的脂肪酶可以回收重復利用，如使用固定化脂肪酶，其重復使用次數可以 達到10次。
所述的7jC/有才幾溶劑體系中水的體積百分含量為0.5% ~ 100%，優選為 0.5% ~ 20%。由于水解反應中水M應原料之一，水含量過高容易導致水 解反應過快，從而使得(11)->^取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯和(S)-N-取代-嗎啉 -3-酮-2-乙酸酯兩種底物都迅速水解，拆分效果較差。而在具有較高有機 溶劑濃度的水/有機溶劑體系中，有機溶劑的加入一定程度上抑制了酶的水 解催化活性，此時(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯和(S)-N-取代-嗎啉-3-酮 -2-乙酸酯兩種底物在酶催化立體空腔中不同的結合位點將決定其水解活 性的差異，從而使得(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯和(S)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯兩種底物得以拆分開來。
本發明的反應體系中，還可以添加其它有機或無機添加劑，如添加表 面活性劑吐溫80可以用于乳化底物使得底物和酶更均勻分散，添加無機 鹽/鹽水合物如十水合硫酸鈉/硫酸鈉等可以用于調節反應體系的水活度， 以提高脂肪酶的選擇性和活性。以CAL-B、 CRL為例，本發明的水解拆分可以用下式所表示的歷程
實現:<formula>formula see original document page 8</formula>
(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸
反應過程用HPLC (Shimadzu SPD-10AVP)來檢測，色譜柱Shim-Pack VP-ODS (150x4.6mm)，分析條件甲醇/水(體積比)=40/60,流速 1 ml/min。
對映體過量值用HPLC( Shimadzu SPD-10AVP)來檢測，手性色語柱 Chimlcel AS-H (250 x 4.6 mm， Daicel Co.， Japan )，分析條件正己烷/異丙 醇/乙酸(體積比)=55/45/0.1，流速0.4 ml/min.
反應產物光學純度通過對映過量值(ee%)來評價，反應的對映體選 擇性以E來評價。相應的計算公式如下，其中eep是指產物的ee值，ees 是指底物的對映體過量百分率，c為反應轉化率。[(S)-acid]、 [(R)-acid]、 [Intial vinyl ester]分別指代反應結束時S構型水解酸產物的濃度、R構型水 解酸產物的濃度、底物的初始濃度。
c(%)=,-acd]xl00
—%) = [(i )-aCid]-,-aCid]x100 [(及)陽acid] + [(S)-aci司
<formula>formula see original document page 8</formula>
ln[l-—卿)] 本發明具有如下有益效果
本發明篩選獲得了高立體選擇性的脂肪酶CAL-B、 Lipozyme ,用以 選擇性水解(8)-^[-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯得到光學純(S)- N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸，產物對映體過量值最高達到99 %，收率為40%~53%，通過 最終轉化得到(S)-嗎啉酮凝血酶抑制劑；而采用脂肪酶CRL 、 CCL則擇性 水解(11)-]^取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯得到光學純(R)- N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸，產物對映體過量值最高達到98.3%，收率為41%~47%，通過最終 轉化得到(R)-嗎啉酮凝血酶抑制劑。本發明方法通過改變反應條件，可以 調控水解產物的選擇性，實現兩種構型產物的可控制備；
本發明采用的酶促方法與其它化學法合成相比產物光學純度高、副反 應少、底物與產物易分離、反應條件溫和，對環境友好。
本發明方法為進一步合成(R)-嗎啉酮凝血酶抑制劑和(S)-嗎啉酮凝血 酶抑制劑提供一種有效的路線。
具體實施例方式
取500mg 4-(3，，4，-二曱氧基節基)嗎啉-3-酮-2-乙酸乙烯酯置于100ml 反應瓶，用25ml甲基叔丁基醚溶解。再加蒸餾水500pl， 500mgCAL-B, 搖床溫度控制在25。C,搖床轉速是200 r/min,攪拌反應30 h。反應結束 后，將反應液過濾回收酶以重復利用。濾液中的產物(S)-4-(3，,4，-二曱氧基 芐基)嗎啉-3-酮-2-乙酸和未反應的(R)-4-(3，，4，-二甲氧基芐基)嗎啉-3-酮-2-乙酸乙烯酯用HPLC檢測。產物轉化率為48.9%, ee值為98.10/()。
濾液用飽和NaHC03水溶液每次25ml反向萃取3次，水相用稀HC1 調節pH到7，再用乙酸乙酯對水相進行萃取，旋干乙酸乙酯最后得到光 學純的(S)- 4-(3，，4，-二曱氧基爺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸。其結構式如下<formula>formula see original document page 9</formula>
取500 mg 4-(3，，4，-二曱氧基節基)嗎啉-3-酮-2-乙酸乙烯酯置于100 ml 反應瓶，用25ml環己烷溶解。再加蒸餾水500jnl， 500mgCRL，搖床溫 度控制在25。C,搖床轉速為200 r/min,攪拌反應36 h。反應結束后，將
實施例1
實施例2反應液過濾回收酶以重復利用。濾液中的產物(R)-4-(3，，4，-二曱氧基千基) 嗎啉_3-酮-2-乙酸和未反應的(S)-4-(3，，4，-二曱氧基節基)嗎啉-3-酮-2-乙酸 乙烯酯，用HPLC4企測。產物轉化率為47.5%， ee值為97.3 %。
濾液用飽和NaHC03水溶液每次25 ml反向萃取3次，水相用稀HC1 調節pH到7，再用乙酸乙酯對7jC相進行萃取，旋干乙酸乙酯最后得到光 學純的(R)-4-(3，，4，-二曱氧基千基)嗎啉-3-酮-2-乙酸。其結構式如下
實施例3
除了酶促水解底物選用4-(4，-氯節基)嗎啉-3-酮-2-乙酸乙酉旨，其余操作 同實施例1，制得下式所示的光學純(S)-4-(4，-氯千基)嗎啉-3-酮-2-乙酸， 轉化率為48.2 %, ee值為97.5 %。
<formula>formula see original document page 10</formula>
實施例4
除了酶促水解底物選用4-(4，-氯節基)嗎啉-3-酮-2-乙酸乙酯，其余操作 同實施例2,制得下式所示的光學純(R)-4-(4，-氯節基)嗎啉-3-酮-2-乙酸， 轉化率為45.8%， ee值為98.3 %。
<formula>formula see original document page 10</formula>
實施例5
取2.5g 4-(2，,5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸丁酯置于 100ml反應瓶，用25ml丙酮溶解。再加蒸餾水6.2ml (體積含量20%)， 1250mg固定化米赫毛霉脂肪酶Lipozyme⑧，搖床溫度控制在60。C，搖床轉速是200r/min，攪拌反應24 h。反應結束后，將反應液過濾回收酶以重 復利用。濾液中的產物(S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸 和未反應的(R)-4-(2，,5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸丁酯用 HPLC檢測。產物轉化率為52.8%, ee值為95.40/。。
濾液旋干后用飽和NaHC03水溶液每次25ml洗滌3次，水相用稀HC1 調節pH到7，再用乙酸乙酯對水相進行萃取，旋干乙酸乙酯最后得到(S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸。其結構式如下
除了催化劑選用圓柱狀假絲酵母脂肪酶(CCL )，溶劑選用25ml環己 烷和150ul水(體積含量0.5% )，反應時間50h外，其余操作同實施例5， 制得下式所示的光學純(R)-4-(2，，5，-二甲氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙 酸，轉化率為41.4%, ee值為97.3 %。
取160mg 4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸丁酯置于 100ml反應瓶，用25ml丙酮溶解。再加蒸餾水6.2ml (體積含量20%), 160mg固定化米赫毛霉脂肪酶Lipozyme ,搖床溫度控制在60°C,搖床 轉速是200 r/min，攪拌反應lh，其余操作同實施例5,其中水解產物 (S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸的轉化率為40.4%, ee 值為99.0%，其結構式如實施例5所示。
實施例6
實施例7
ii實施例8
除了反應溫度為5。C，反應時間為24小時外，其余操作同實施例7， 其中水解產物(S)-4-(2，，5，-二曱氧基-苯磺酰胺基)嗎啉-3-酮-2-乙酸的轉化 率為48.3%， ee值為96.0。/c)，其結構式如實施例5所示。
1權利要求
1、一種光學純N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸的制備方法，包括如下步驟以脂肪酶為催化劑，在水/有機溶劑體系中，水解拆分外消旋的式(I)所示的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯底物，經后處理制得式(II)所示的(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸或(S)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸；其中，所述的R為二苯甲基、(3’，4’-二甲氧基)芐基、(4’-甲氧基)芐基、(4’-氯)芐基、(4’-二甲胺基)芐基、苯乙基、芐基、苯基、(2’，5’-二甲氧基)-苯磺酰胺基、辛基、異丙基、乙基或甲基；所述的R1為C1～C18的烷基或C1～C18的烯基。
2、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶或固定化米赫毛霉脂肪酶，制得(8)"^-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸。
3、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的脂肪酶為褶鈹假絲酵母脂肪酶或圓柱狀假絲酵母脂肪酶，制得(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸。
4、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯底物在水/有機溶劑體系中的濃度為5 ~ 100g/L。
5、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的脂肪酶在水/有機溶劑體系中的濃度為5 ~ 50g/L。
6、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的水解拆分的反應溫度為5 60。C，反應時間為1 50小時。
7、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的后處理為在水解拆分結束后，離心去除脂肪酶，濾液用飽和NaHC(V乙酸乙酯萃取，旋干后得到光學純(11)"^-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸或(8)->^取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸。
8、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的7K/有機溶劑體系中有機溶劑為二甲基亞砜、N,N-二甲基曱酰胺、二氧六環、乙腈、丙酮、叔戊醇、曱基叔丁基醚、二異丙基醚、乙醚、丁醚、苯曱醚、苯醚、正己烷、異辛烷、環己烷、甲苯或二氯曱烷。
9、 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的7jc/有機溶劑體系中水的體積百分含量為0.5% ~ 20%。
全文摘要
本發明公開了一種光學純N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸的制備方法，包括如下步驟以脂肪酶為催化劑，在水/有機溶劑體系中，水解拆分外消旋的式(I)所示的N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸酯底物，經后處理制得式(II)所示的(R)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸或(S)-N-取代-嗎啉-3-酮-2-乙酸；本發明采用的酶促方法通過改變反應條件，可以調控水解產物的選擇性，實現兩種構型產物的可控制備；本發明方法與其它化學法合成相比產物光學純度高、副反應少、底物產物易分離、反應條件溫和，對環境友好。
文檔編號C12P17/14GK101643757SQ20091010239
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月7日 優先權日2009年9月7日
發明者葉海朋, 起 吳, 林賢福 申請人:浙江大學