專利名稱：耐堿性葡萄糖脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法
技術領域：
本發明涉及突變或遺傳工程技術領域，尤其涉及一種耐堿性葡萄糖脫氫酶基因序
列及其編碼的多肽和制備方法。
背景技術：
葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase, GDH， EC1. 1. 1. 47)能特異催化P _D_葡 萄糖和NAD (P) +生成D-葡萄糖酸內酯和NAD (P) H，可用于制造生物傳感器和生物芯片，測定 人體體液和發酵液的葡萄糖濃度；還可用于高純度低聚果糖和葡萄糖酸鈣的生產，反應產 物NAD(P)H可用于手性醇生產。目前GDH主要從牛的心臟提取，以及由芽孢桿菌發酵而來， 來源受到限制。國內GDH主要依靠進口。
發明內容
本發明的目的之一針對現有技術的不足，耐堿性葡萄糖脫氫酶基因及其編碼的多 肽和制備方法。 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的 —種耐堿性葡萄糖脫氫酶基因，它是編碼具有耐堿性葡萄糖脫氫酶蛋白活性的多 肽的核苷酸序列。所述核苷酸序列具有SEQ ID NO. l的多核苷酸序列以及它的突變形式， 所述突變形式包括缺失、無義、插入、錯義。 —種耐堿性葡萄糖脫氫酶基因，它是編碼具有耐堿性葡萄糖脫氫酶蛋白活性的多 肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有SEQ ID NO. l的多核苷酸序列以及它的突變形式，所 述突變形式包括缺失、無義、插入、錯義。 —種上述耐堿性葡萄糖脫氫酶基因編碼的多肽，它是具有SEQ ID No.2中的氨基
酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。 —種上述多肽的制備方法，包括以下步驟 1)分離出編碼耐堿性葡萄糖脫氫酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO. 1 ;
2)構建含SEQ ID NO. 1核苷酸序列的表達載體； 3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞.形成能生產耐堿性葡萄糖脫氫酶的重組 細胞； 4)培養步驟3)中的重組細胞； 5)分離、純化得到多肽，即耐堿性葡萄糖脫氫酶。 本發明的有益效果是本發明以葡萄糖脫氫酶保守序列為基礎，克隆分離了耐堿 性葡萄糖脫氫酶基因。該基因對于制備用于生產耐堿性葡萄糖脫氫酶的轉基因微生物或動 植物，并回收獲得該基因編碼的酶非常有用。
圖1是葡萄糖脫氫酶克隆流程3
圖2是重組葡萄糖脫氫酶純化示意圖； 圖3是重組葡萄糖脫氫酶pH穩定性示意圖。
具體實施例方式
首先，本發明提供了分離的，編碼耐堿性葡萄糖脫氫酶活性的多肽的多聚核苷酸 分子，該核苷酸分子是從嗜堿性芽孢桿菌中分離到的，具有SEQ. ID NO. 1的核苷酸序列，它 編碼具有261氨基酸閱讀框的多肽，推測分子量為27810道爾頓。 本發明還涉及一種重組載體，該載體包含本發明的分離的核苷酸分子，以及包含 有重組載體的宿主細胞。同時，本發明包括構建該重組載體和宿主細胞的方法，以及用重組 工程技術生產耐堿性葡萄糖脫氫酶的方法。 本發明進一步地提供了一種分離的耐堿性葡萄糖脫氫酶或多肽，其具有SEQ. ID
NO. 2氨基酸序列，或至少70 %相似，更佳地，至少具有90 % ， 95 % ， 99 %的相同。 在本發明中，"分離的"DNA是指該DNA或片斷已從天然狀態下位于其兩側的序列
中分離出來，還指該DNA或片斷已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開而且已經與在細胞
中伴隨其的蛋白質分開。 在本發明中，"耐堿性葡萄糖脫氫酶基因"指編碼具有耐堿性葡萄糖脫氫酶活性的 多肽的核苷酸序列，如SEQ. ID NO. l的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指該序列中 有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于公知的 密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼 出SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴 謹條件下與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 1 核苷酸序列同源性至少70 % ，較佳地至少80 % ，更佳地至少90 % ，最佳地至少95 %的核苷 酸序列。 在本發明中，"分離的"蛋白的多肽是指其至少占樣品總物質的至少20 % ，較佳地 至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或濕重計)。純度可以用任何合適 的方法進行測量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天 然狀態下的伴隨其的組份。 在本發明中，"耐堿性葡萄糖脫氫酶"指具有耐堿性葡萄糖脫氫酶活性的SEQ ID N0.2序列的多肽。該術語還包括SEQ ID N0.2序列的變異體，這些變異體具有與天然葡萄 糖脫氫酶相同的功能。這些變異體包括(但不限于)若干個氨基酸的缺失，插入和/或取 代，以及在C末段和/或N末端添加一個或數個氨基酸，也可以是不影響序列的修飾形式上 的差異。例如，為本領域所公知的，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變 蛋白質的功能。又比如，在C末段和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋 白質的功能。該術語還包括耐堿性葡萄糖脫氫酶的活性片斷和活性衍生物。
其制備方法包括以下步驟 1、分離出編碼耐堿性葡萄糖脫氫酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO. 1 ;
2、構建含SEQ ID NO. 1核苷酸序列的表達載體； 3、將步驟2中表達載體轉入宿主細胞.形成能生產耐堿性葡萄糖脫氫酶的重組細 胞；
4
4、培養步驟3中的重組細胞； 5、分離、純化得到多肽，即耐堿性葡萄糖脫氫酶。 在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒，噬菌體及 反轉錄病毒等。在生產本發明的耐堿性葡萄糖脫氫酶時，可以將耐堿性葡萄糖脫氫酶基因 序列可操作低連于表達調控序列，從而形成耐堿性葡萄糖脫氫酶表達載體。表達載體含有 復制起始點和表達調控序列，啟動子，增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有 可供選擇的標記基因，如a)提供對抗生素或其它毒性物質(氨芐青霉素，卡那霉素，氨甲蝶 呤等)的抗性的蛋白質或b)互補營養缺陷型蛋白質或c)提供復合培養基中沒有的必需營 養成分的蛋白質。各種不同宿主的合適標記基因是本領域中所熟知或生產廠商說明書著名 的。這些表達載體可以用本領域技術人員公知的重組DNA技術制備，如可參考Sambrook等 人，1989或Ausubel等人，1992。 重組表達載體可以用本領域熟知的方法引入宿主細胞，這些方法包括電轉化法， 氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導入宿主細胞的過程稱為"轉化"。通過培養宿主 細胞，誘導所需蛋白的表達，并通過本領域所熟知的蛋白分離技術，如柱層析等得到所需的 蛋白質。也可采用固相技術等人工合成該蛋白質。 在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸 桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞，或各種動植物細胞。 本發明的耐堿性葡萄糖脫氫酶基因全長序列或其片斷通常可以用PCR擴增法，重 組法，或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來 設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法制備的嗜堿性芽孢桿菌DNA為模極，擴增而 得到有關序列。 一旦獲得了有關序列，就可以將其克隆入有關載體，再轉入宿主細胞，然后 通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到大批量的有關序列。 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 :耐堿性葡萄糖脫氫酶基因的克隆 耐堿性葡萄糖脫氫酶基因的克隆采用簡并PCR和反向PCR進行。首先培養嗜堿性 芽孢桿菌，使用LB培養基于30度培養24小時后收集菌體，提取總DNA。根據GenBank中公 布的已知葡萄糖脫氫酶同源基因序列設計其保守區之間的簡并引物，以提取的總DNA為模 版，進行簡并PCR。將簡并PCR獲得的約300bp DNA進行測序。以此300bp DNA序列為基礎， 設計反向PCR引物。將提取的總DNA分別用不同的限制性內切酶進行酶切(Apal、 BamHI、 EcroRI、 HindIII、 Pstl、 Ndel、 Xhol、 Kpnl)，用DNA純化試劑盒純化后，分別于16度進行自 身連接環化，建立了 8個用于反向PCR的自身環化DNA體系。分別以此自身環化產物為模 板，引物為設計的反向PCR引物，進行反向PCR后于Hindi 11酶切環化后的DNA體系中擴增 得到一條約2000bp的DNA片段，測序后用Vector NTI 9. 0中的Contig Express將其與簡 并PCR獲得的序列進行拼接，得到葡萄糖脫氫酶基因的全長序列(SEQ ID NO. 1)。
實施例2 :耐堿性葡萄糖脫氫酶表達載體的構建 根據實施例中基因注釋得到的葡萄糖脫氫酶全長編碼序列(SEQ ID NO. l)，設計能擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點，以便構建 表達載體。以嗜堿性芽孢桿菌DNA為模板，擴增耐堿性葡萄糖脫氫酶基因全長。在保證閱 讀框正確的前提下重組至表達載體pET28a(Novagen)中，再將重組載體轉化至大腸桿菌 DH5a感受態細胞中(轉化方法為CaClJ去或電轉化法)，以抗生素標記法篩選(本例中為 卡那霉素抗性)陽性的重組菌DH5 a -pET28a-GDH。挑取單菌落的工程菌DH5 a -pET28a-GDH 于4ml含30 ii g/ml卡那霉素的LB培養基中振搖培養37。C過夜，提取重組質粒后轉化至表 達載體大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，以抗生素標記法篩選(本例中為卡那霉素抗性) 陽性的重組高效表達菌BL21-pET28a-GDH。
實施例3 :重組耐堿性葡萄糖脫氫酶的表達和純化 挑取單菌落的工程菌BL21-pET28a-GDH于4ml含30 y g/ml卡那霉素的LB培養基 中振搖培養37t:過夜，按1 : 100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含30 ii g/ml卡那 霉素)中培養約3小時，至0D600達0. 5后，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續于37"分別 培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的lml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2xSDS 上樣緩沖液50 ii 1，蒸餾水45 ii 1， 二巰基乙醇5 iU)，懸浮細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘， 12000rpm離心1分鐘，上清加入12% SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的 蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達所需蛋白的工程菌。
按上述方法誘導表達所需蛋白的工程菌后，將細菌離心沉淀，按每100ml菌加入 8ml Binding Buffer,超聲破碎后，15000rpm離心30分鐘后取上清，加入2ml Ni-NTA樹脂 (Invitrogen) ， 30。C振搖結合30分鐘，靜置沉淀，棄上清，沉淀用10ml Wash Buffer洗滌2 次后，上2ml層析柱，然后用ElutionBuffer洗脫目的蛋白，以lml為單位分管收集，合并酶 活最高的幾管。洗脫的上清添加50%的甘油后保存于-80°C ，并進行SDS-PAGE電泳，檢測 純化效果。在27810道爾頓處的蛋白質條帶即為葡萄糖脫氫酶
實施例4 :重組耐堿性葡萄糖脫氫酶性質的測定 將純化后的葡萄糖脫氫酶分別測定其最適反應溫度、最適反應pH、溫度穩定性、pH 穩定性、底物譜和動力學研究。 上述實施例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的精神和 權利要求的保護范圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發明的保護范圍。
基因序列表
〈110>浙江大學 〈120〉耐堿性葡萄糖脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法
〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211>786 〈212>DNA 〈213〉嗜堿性芽孢桿菌 〈400〉 1 atgtettcag attteg朋gg朋朋gttett gttettecag gtgcttc朋c 3ggattegga 60
aaagcaatgg cattecgctt tggtgaggag aaagcaaaag ttetcgttea tttccgctca
gatg朋朋tgaggccaatgc tgttgttgag ggagteaaaa aagcaggtgg ggatgccate180gctgtea朋ggtgatgtgac agttgaagag gatgtcatca acctegteca gactgctgtg240朋te朋tttggaaccctcga tgtgatgatt朋teatgcag gtettg朋朋tccagtegct300tC3C3tg朋3tgccgtteag tgactggaatagagtcatca ateccaattt雄gggtgcg360ttttteggaagtcgag朋gc朋tte朋tecttcgtggaga acgatettea agggtctgtt420atcaatetgtctegtgttca cgaaatgatcccatggcctt tgtttgtgca ctecgcagca■3gt腿ggtgg朋tteagct gatg3cac朋acattegcct teg朋tetgc:tCCte朋gg3540atccgtetca3c朋catcgg gcctggagcg 3tteatecac c朋te朋tgc:gg朋3朋ttt600gcagatccagc朋朋cgtgc agatgteg朋3gcatggtec cgatggggte tetcgg朋朋660cctg朋ga朋ttgcagccgt agcggcatgg cttgcttctt cccaagcteg ctetgteaca720ggaatcactttetttgcaga tggtggaatg actttetetc ctgatttcca agctggtcgt780gggt朋786〈210>2〈211>261〈212>PRT〈213〉耐堿性葡萄糖脫氫酶〈400>2MetTyrSer AspLeuGluGlyLysVallieVallieThrGlyAlaSer151015ThrGlyLeu GlyLysAlaMetAlaLeuArgPheGlyGluGluLysAla202530LysVallie ValAsnPheArgSerAspGluAsnGluAlaAsnAlaVal354045ValGluGly ValLysLysAlaGlyGlyAspAlalieAlaValLysGly505560AspValThr ValGluGluAspVallieAsnLeuValGinThrAlaVal65707580AsnLysPhe GlyThrLeuAspValMetlieAsnAsnAlaGlylieGlu859095AsnProVal AlaSerHisGluMetProLeuSerAspTrpAsnArgVal100105110lieAsnThr AsnLeuThrGlyAlaPheLeuGlySerArgGluAlalie115120125LysTyrPhe ValGluAsnAsplieLysGlySerVallieAsnMetSer130135140SerValHis GluMetlieProTrpProLeuPheValHisTyrAlaAla145150155160SerLysGly GlylieLysLeuMetThrGinThrLeuAlaLeuGluTyr165170175
7
AlaProLysGlylieArglieAsnAsnlieGlyProGlyAlalieAsn180185190ThrProlieAsnAlaGluLysPheAlaAspProAlaLysArgAlaAsp195200205ValGluSerMetValProMetGlyTyrlieGlyLysProGluGlulie210215220AlaAlaValAlaAlaTrpLeuAlaSerSerGinAlaSerTyrValThr225230235240GlylieThrLeuPheAlaAspGlyGlyMetThrLeuTyrProAspPhe245250255GinAlaGlyArgGly260
權利要求
一種耐堿性葡萄糖脫氫酶基因，其特征在于，它是編碼具有耐堿性葡萄糖脫氫酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列。所述核苷酸序列具有SEQID NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，所述突變形式包括缺失、無義、插入、錯義。
2. —種權利要求1所述耐堿性葡萄糖脫氫酶基因編碼的多肽，其特征在于它是具有 SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生 物。
3. —種權利要求2所述多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1) 分離出編碼耐堿性葡萄糖脫氫酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO. 1。2) 構建含SEQ ID NO. 1核苷酸序列的表達載體。3) 將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞.形成能生產耐堿性葡萄糖脫氫酶的重組細胞。4) 培養步驟3)中的重組細胞。5) 分離、純化得到多肽，即耐堿性葡萄糖脫氫酶。
全文摘要
本發明公開了一種耐堿性葡萄糖脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法，本發明以嗜堿性芽孢桿菌G10為基礎，克隆分離了耐堿性葡萄糖脫氫酶基因。該基因對于制備用于生產耐堿性葡萄糖脫氫酶的轉基因微生物或動植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。另外，本發明還提供了具有耐堿性葡萄糖脫氫酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同體。同時，本發明還提供了制備，分離，純化具有耐堿性葡萄糖脫氫酶活性的多肽的方法。
文檔編號C12N15/63GK101717777SQ200910102159
公開日2010年6月2日 申請日期2009年8月24日 優先權日2009年8月24日
發明者丁海濤, 杜怡青, 趙宇華, 陳雪嬌 申請人:浙江大學