毛竹微衛星分子標記的開發與應用的制作方法

專利名稱：毛竹微衛星分子標記的開發與應用的制作方法
毛竹微衛星分子標記的開發與應用
技術領域：
本發明涉及一種植物DNA分子標記技術，具體為毛竹微衛星分子標記的開發技術及其在剛竹屬其他竹種的應用。
背景技術：
毛竹(/VyV/ostoc/y^ /w6eirera)是禾本禾斗(Gramineae)竹亞禾斗(Bambusoideae)岡lJ竹屬(尸*//0^"^")植物，是我國竹類資源中最主要的竹種之一，其分布廣、生長快、利用多，具有重要的經濟和生態價值。竹子由于缺乏有效的有性繁育系統，多以地下莖延伸為主的無性繁殖，因而常規的育種技術無法加以利用，導致竹子的育種進程停滯不前，成為竹產業發展的主要瓶頸。分子輔助育種或將成為竹子育種的重要手段。其中微衛星標記(SSR, Simple Sequence Repeat)作為以DNA聚合酶鏈式反應(PCR, Polymerase Chain Reaction)技術和測序技術為基礎的分子標記，是構建高密度分子遺傳圖譜、分析物種分類與演化、染色體結構、遺傳多樣性、品種保護與純度鑒定的有效工具，被認為是當前種內遺傳變異研究中分辨率最高、揭示力最強的分子標記。迄今，竹類植物中的微衛星分子標記的開發利用甚少，國內只有李淑嫻在2002年利用水稻微衛星標記引物隨機擴增竹子基因組，但未對條帶進行測序確認為竹子微衛星的報道；此外，印度報道Nayak和Rout通過構建和篩選印度刺竹(5aw6wra fln^^"flcefl)的基因組文庫，得到6個微衛星分子標記。國內外尚無毛竹微衛星分子標記相關的報道。
發明內容
針對現有技術尚未開發毛竹微衛星標記的現狀，本發明要解決的問題是利用公共數據庫中現有的毛竹基因組序列，應用生物信息學方法，開發出毛竹微衛星分子標記，并應用于剛竹屬其他竹種，進一步開發出能夠廣泛應用于剛竹屬竹種的微衛星分子標記。
解決本技術問題的技術方案是
本毛竹微衛星分子標記的開發方法包括如下步驟(1)毛竹DNA序列的獲得用毛竹的拉丁文學名作為關鍵詞，在美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫中檢索并下載獲得；(2)含有微衛星DNA序列的篩選用單機版微衛星分析程序和在線微衛星位點分析軟件，對下載的序列進行篩選，獲得含有微衛星位點的毛竹DNA序列；(3)引物設計和微衛星位點驗證①引物設計用引物設計軟件設計擴增含有微衛星位點的DNA聚合酶鏈式反應引物，引物含有堿基數控制在18—22個，兩引物退火溫度差〈4。C，擴增的DNA片段在350個堿基以內；②微衛星驗證利用上述引物進行DNA聚合酶鏈式反應擴增、擴增產物的電泳分離、銀染檢測、微衛星位點的再擴增、亞克隆和測序確認工作，最后得到19對毛竹微衛星標記引物，其退火溫度在46。C一59。C。
獲得19對毛竹微衛星標記的引物分別是
PBM002:5，-ATGGAGC ATTCATTTGAG-3'5,- TTGACAAGTTTGGAGGGT-3'
PBM004:5，-CGATGAAGTTGCCTGTGG-3'5，- TCAAGTCGCATTGGAGTA-3'
PBM007:5,-CTCGAGGTGAAGTTAC ATTA-3'5，- TCGTAGAGCACTATCCATTT-3，
PBM011:5，-TAAAGAAGTATAATGTATTCG-3'5，- AGCTGTTTTAGCATCTATGTT-3
PBM013:5，-TTTTACTAACGTGCCCGTATT-3'5，- GGAGGATCGCTGGATTGG-3'
PBM014:5，-GCCGTCCAAACGCTCCTT-3'5，- CACCCATCCATCTTATGCTAT-3，
PBM016:5,-CCCACAGAAGGTCGCACTA-3'5，陽CCGCCGAGAACGTCTACAT-3，
PBM017:5，-TATGCCTCC AATAATCCG-3'5，隱AAGGCGTAGCCACCGAAT-3，
PBM018:5,-GACGACGAGTGTAACGCTGAG-3'5 ，- AGGATGATGCCGGTGAGG-3'
PBM019:5，-TCCTAGCCCTACCCTGTCC-3'5，- CACGGTGCTCGCTTAAATAG-3，
PBM020:5，-TCGCATCTAAACAACATC-3'5，- GAGAAGAAGAAAGGAGGA-3'
PBM021:5，-AGGGTGTTATTTGCTATTGT-3'5,- AAATCCGACGCTGGAGGC-3'
PBM022:5，-AAAGATGTTGCCTTGTTC-3 ，5，- GTGCATGTCTATTCCCTC-3'
PBM023:5，陽TTTCATGGAGGGCGACAG-3' 5，■ GCCGACCAGGAAACAAACGAA-3，
PBM025:5，-GTTGTGCCC AGCACTTTA-3'5，- TGACGCCACTCATTTCTT -3'
PBM026:5,-CTATCATCAAATGTGCCTCAA -3，5，- CCGAGCCTCACTTTCTGC-3'
PBM027:5，-AAAGC AACCACGCCATTA-3'5，- TCGGAGGAGAAGGAGAAG-3'
PBM028:5,誦CAGGTAGTCGTCTTATCGAGT-3 ，5，- ATAAGTCAATTTCGAATGAA-3'
PBM030:5，_GTTGCCCGTGGTTACTGT-3' 5 ，- CGTGAGCCATCTGAGTTT-3'編號分別為PBM002、 PBM004、 PBM007、 PBMOll、 PBM013、 PBM014、PBM016、 PBM017、 PBM018、 PBM019、 PBM020、 PBM021、 PBM022、 PBM023、PBM025、 PBM026、 PBM027、 PBM028、 PBM030的微衛星核苷酸序列兩端的引物的退火溫度分別為48°C、 48°C、 53°C、 50。C、 53。C、 52。C、 56°C、 55。C、52。C、 59。C、 46°C、 55。C、 47°C、 58°C、 47°C、 50。C、 49。C、 53°C、 50。C。
所說的引物，應用于篌竹、烏芽竹、雷竹、水竹、假毛竹和桂竹6個剛竹屬代表竹種微衛星的開發，通過擴增和測序確認獲得了 102條含有微衛星位點的剛竹屬DNA序列見表(2)。
本發明的有益效果是相對于其他微衛星的開發方法，具有簡單、快速、穩定、高效和低成本等優點，為毛竹等剛竹屬竹種的分子輔助育種提供了有力的工具，同時有助于竹類植物遺傳學和分子生物學的進一步研究。
具體實施方式
下面對本發明作進一步詳述，本發明毛竹微衛星分子標記的開發及其應用經
過下列步驟
一，毛竹序列的獲得
用毛竹的拉丁學名"尸/^//0對"￡%5戶6Mcem"為關鍵詞，在美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫(GenBank: 11 0://\￥\￥ 11(^.111111.11 1.§(^/)進行檢索，把得到的巳經登錄了的毛竹DNA序列以.fasta文件形式全部下載下來。二，毛竹DNA序列的篩選
利用單機版微衛星位點分析程序(MISA)和在線微衛星位點分析軟件(Microsatellite Repeats Finder),對下載的DNA序列進行篩選，得到含有微衛星位點的毛竹DNA序列。三，引物設計和毛竹微衛星位點驗證1，引物設計
在含有微衛星位點的DNA序列上，利用引物設計軟件Primer Premier 5(PRIMIER Biosoft International, CA， USA )設計DNA聚合酶鏈式反應擴增引物，設計引物的大小在20個堿基左右，擴增片段長度在100-300堿基，兩條引物的退火溫度相差不超過4°C。當一條DNA序列中含有兩個微衛星位點，且相距較遠時，每個位點分別設計引物；當兩個微衛星位點在同一條序列中相距較近時，引物設計時就盡量使兩個位點在一對引物的擴增范圍內。2，微衛星位點驗證
①DNA聚合酶鏈式反應擴增通過PCR方法用設計好的微衛星標記引物擴增毛竹基因組DNA，擴增反應體系和程序如下反應體系為20微升，其中包括10x緩沖液2微升，MgCl2(25毫摩爾/升)1.2微升，脫氧核糖核苷酸(10毫摩爾/升)0.6微升，DNA聚合酶(5單位/微升)0.25微升，DNA模板50-100納克，引物(25毫摩爾/升)0.5微升。聚合酶鏈式反應的反應程序為94。C預變性5分鐘，32個循環(94。C變性40秒，各引物退火溫度下復性40秒，72 。C延伸90秒)，最后72 。C延伸10分鐘后4。C保存。從而獲得擴增產物。各引物的退火溫度詳見表l。
② 電泳分離和銀染檢測
擴增產物中加變性緩沖液，用4%變性聚丙烯酰胺膠(厚度0.4毫米)和lxTBE電泳緩沖液，在美國C.B.S.公司生產的測序膠電泳系統中進行，預電泳30分鐘后上樣100瓦恒功率電泳約2小時后銀染檢測，銀染方法過程主要如下電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中；加入10%醋酸，在搖床上輕微震蕩30分鐘進行固定，然后加入去離子水漂洗3次，每次5分鐘；將凝膠置入0.1%硝酸銀染色液的染色盤中，在搖床上輕微震蕩30分鐘，然后用去離子水漂洗10秒鐘；將凝膠置入0.32%碳酸鈉的顯色盤中，在搖床上輕微震蕩直至條帶清晰以及條帶數不再增加為止；加入固定液，終止顯色反應，用蒸餾水漂洗幾分鐘；去除凝膠和玻璃板上的水珠，放在乳白光燈箱上觀察并用數碼相機拍照。
③ 微衛星位點的再擴增和亞克隆
根據微衛星位點的特有電泳條帶特征初步判定電泳圖片，并通過割膠測序進一步確認。具體的步驟是割下聚丙烯酰胺凝膠中的銀染信號最強的微衛星位點上的條帶置于管中，加10微升TE溶液(IO毫摩爾/升Tris-HCl， 1毫摩爾/升EDTA,pH8.0)后在PCR儀上94°C加熱30分鐘，然后離心取上清液作為二次PCR模板，在與上述相同的PCR反應體系和反應程序下，用各位點相對應的微衛星引物進行擴增，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行分離，對目的條帶用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)進行回收，回收產物用pMD18-T載體(TAKARA)進行16。C過夜連接，轉化ToplO感受態細胞(TAKARA)后進行亞克隆，最后挑取陽性克隆培養，用質粒提取用試劑盒(QIAGENPlasmidMiniKit，QIAGEN)提取質粒后進行測序。 測序確認
將上述所得的質粒，用測序試劑盒(BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingKit, ABI)在96孔PCR板上做測序PCR反應。反應體系為20微升，包括質粒DNA， 1微升(200納克)；BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction mix, 1微升；5x測序緩沖液，4微升；測序引物(20微摩爾/升)，l微升；滅菌去離子水，13微升。反應條件為96°C 1分鐘，25個循環(96。C 10秒，50°C 5秒，60°C 4分鐘)，最后4°C保溫。
PCR反應結束后用酒精/EDTA/NaAc法對測序產物進行純化。具體的步驟如下每個反應管中加入2微升的125毫摩爾/微升EDTA、 2微升的3毫摩爾微升NaAe和50微升100%酒精，震蕩混勻4次，室溫放置15分鐘；3,000個離心力離心30分鐘后倒置96孔板，離心至185個離心力時停止離心；每管加入70微升的70%酒精，1,500個離心力4°C下離心15分鐘后倒置96孔板，離心至185個離心力時停止離心；重復1，500個離心力下的離心過程1次；室溫揮發凈酒精，加入10微升去離子甲酰胺溶解DNA;溶解后的樣品在95°C變性4分鐘，迅速置冰中冷卻4分鐘后，上樣，在ABI公司出產的測序儀(ABI3100AvantGenetic Analyzer)上領J序。
四，毛竹微衛星分子標記在剛竹屬其他竹種的應用
通過PCR方法用毛竹微衛星標記引物擴增剛竹屬其他6個竹種基因組DNA、電泳分離與銀染檢測、微衛星位點的再擴增與亞克隆、測序確認等步驟，具體方法如上述三2。
8表1毛竹微衛星分子標記DNA聚合酶鏈式反應擴增引物及其退火溫度
編號3'引物序列5'引物序列退火溫度 (°c)
PBM002ATGGAGCATTCATTTGAGTTGACAAGTTTGGAGGGT48
PBM004CGATGAAGTTGCCTGTGGTCAAGTCGCATTGGAGTA48
PBM007CTCGAGGTGAAGTTACATTATCGTAGAGCA.CTATCCATTT53
PBM011TAAAGAAGTATAATGTATTCGAGCTGTTTTAGCATCTATGTT50
PBM013TTTTACTAACGTGCCCGTATTGGAGGATCGCTGGATTGG53
PBM014GCCGTCCAAACGCTCCTTCACCCATCCATCTTATGCTAT52
CCCACAGAAGGTCGCACTACCGCCGAGAACGTCTACAT56
PBM017TATGCCTCCAATAATCCGAAGGCGTAGCCACCGAAT55
PBM018GACGACGAGTGTAACGCTGAGAGGATGATGCCGGTGAGG52
PBM019TCCTAGCCCTACCCTGTCCCACGGTGCTCGCTTAAATAG59
PBM020TCGCATCTAAACAACATCGAGAAGAAGAAAGGAGGA46
PBM021AGGGTGTTATTTGCTATTGTAAATCCGACGCTGGAGGC55
PBM022AAAGATGTTGCCTTGTTCGTGCATGTCTATTCCCTC47
PBM023TTTCATGGAGGGCGACAGGCCGACCAGGAAACAAACGAA58
PBM025GTTGTGCCCAGCACTTTATGACGCCACTCATTTCTT47
PBM026CTATCATCAAATGTGCCTCAACCGAGCCTCACTTTCTGC50
PBM027AAAGCAACCACGCCATTATCGGAGGAGAAGGAGAAG49
PBM028CAGGTAGTCGTCTTATCGAGTATAAGTCAATTTCGAATGAA53
PBM030GTTGCCCGTGGTTACTGTCGTGAGCCATCTGAGTTT50表2:毛竹微衛星分子標記的開發與應用基因序列表
〈110〉浙江林學院
<120>毛竹微衛星分子標記的開發與應用 〈130〉植物DNA分子遺傳標記技術
〈歸 102
<170> Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211> 209
<212> 隱
<213> Phyllostachys kwangsiensis <220〉
<221〉 repeat—region
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〈400〉 1
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cacgaacaat atatatatgg acacccgttt cgtactcccg ggagtatgta ctcccacttc 120
cgatatacca gttaaacgca catattatac ttctttatca tttttagtat acttaaatac 180
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〈210〉 2
〈211〉 291
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<222> (69) . (80) <223>
<220>
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<220>
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〈220〉
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<223>
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〈213> Phyllostachys heteroclada <220〉
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〈210〉 12
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taaagaagta taatgtattc gttaaagtgg tatattggaa gtgggagtac atactcccaa 60
gagtacgaaa caggcgtcct atatatatat atattgattg attgattgtc aagcctaaaa 120
atgtttgact犯catagatg ctaaaacagc t 151
<210> 18
〈211〉 229
<212〉 ■
<213> Phyllostachys nidularia <220>
<221> repeat—region
<222> (86)..(117) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region 〈222〉 (120)..(159)<223>
<400〉 18
taaagaagta taatgtattc gtttccaagt ggtatattgg aagtgggagt acatactccc 60
aagagtacga aacaggcgtc ctacatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 120
atatatateit atatatatat atatatatat atatatatag acacgacatg attgattgat 180
tgattgtcaa gcctaaaaat gtttgactaa catagatgct aaaacagct 229
<210〉 19
〈211〉 161
<212〉 隠
<213〉 Phyllostachys atrovaginata
〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (120).. (129) <223〉
<400> 19
ttttactaac gtgcccgtat ttaggatggt tttgctgatg tgtcacgcag acagacggat 60
gtggcgctcc tagacatctc ctcacatcac gttttcttct tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct attcctctat ccccaatgcc agcgatcctc c 161
<210〉 20
<211> 163
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia
<220>
<221> repeat_region
<222〉 (122)..(131) <223〉
<400> 20
ttttactaac gtgcccgtat ttagggtggt ttcgctgatg tgtcacgctg tgaggcggac 60
gtggcgctcc tagtcgtctc ctcacatcat gttttcttcc tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct ctattcctgt atccccaatg ccagcgatcc tcc 163
<210〉 21<211〉 162
<212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉
〈221> repeat—region
<222〉 (122).. (129) <223>
<400〉 21
ttttactaac gtgcccgtat ttaggatggt tttactgatg tgtcacgctg acagacggat 60
gtggcgctcc tagtcatctc ctcacatcac gttttcttct tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct atttcctcta tccccaatgc cagcgatcct cc 162
<210〉 22
<211> 171
〈212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys bambusoides <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (122).. (129) <223〉
<400〉 22
ttttactaac gtgcccgtat ttagggtggt tttgctgatg tgtcacgctg tcaggcggac 60
gtggcgctcc tagtcatctc ctcacatcat gttttcttcc "tcacatcacc ttttcttccc 120
atctctctct ctctctctct attcctctat ccccaatgcc agcgatcctc c 171
<210〉 23
<211〉 292
<212〉 腿
<213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27) . (46) <223〉<220>
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (176)..(187) 〈223〉
〈400〉 23 gccgtccaaacgctccttcttctgaactctctctctctctctctctcagc tcttcctcct60
cagctcgccgtcgccgtcgcctgatcgttcaccgcttcgcttcacaggga tcagtgctgt120
gacagttgctgtgtgg33Ctcttgttttagtgttgtatccacatttatga tgtatcatca180
tcatcatcttcttttttgaagtatttgtttttctttcttgtgcttgatat ggtatggcaa240
agttga卿ggc郷cagtg犯caa犯gtatstagcat犯g3tgg6ltggg tg292
<210> 24
<211〉 244
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27).. (34) 〈223〉
<400〉 24
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctcggctc ttcctcctct gctcgccgtc 60
gccggatcgt tcaccgcttc gcctcgcagg gatcagtgat gtgatagtag ttgctgtgtg 120
gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg tatttgaagt ctttgttttt "tctttcctgt 180
gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga csgacagaag tacatagcat aagatggatg 240
ggtg 244
<210〉 25
<211> 283
<212〉 ■
<213> Phyllostachys bambusoides 〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27).. (40)〈223〉
〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (170).. (178) <223〉
<400〉 25
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gtcgccgtcg cctgertcgtt caccgcttcg tgtgtggaac tcttgtttta gtcttgtatc tcttttttta agtatttgtt tttctttctt ggcagacagt gaacaaaagt atatagcata
ctctctctct cagctcttcc tcagctcgcc 60
cttcacaggg atcagtgctg tgacagttgc 120
cacatttatg atgtattatc atcatcatct 180
gtgcttgata tggtatggca aagttgaaga 240
卿tggatgg gtg 283
〈210〉 26
<211> 244
<212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys b咖busoides
<220〉
<221〉 repeat_region
〈222〉 (27) . (34) <223〉
<400〉 26
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg gtttcatatg gtattgcaaa gttgaeiggga ggtg
<210〉 27 <211〉 274 <212> DNA
<213〉 Phyllostachys atrovaginata
ctctcggccc ttcctcctct gctcgccgtc gatcagtgat gtgatagtag ttgctgtgtg tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgt cagacagaag tacatagcat aagatggatg
60 120 180 240 244
<220>
<221〉 repeat—region<222> (27)..(40) <223〉
〈220〉
<221> repeat—region <222> (158),.(169) 〈223>
〈400〉 27
gccgtccaaa cgctccttct gcctgatcgt tcaccgcttc ctcttgtttt agtgttgtac aagtatttgt ttttctttct tgaacaaaag tatatagCELt
tctgaactct ctctctctct gcttcacagg gatcagtgct ccacatttat gatgtatcat tgtgcttgat atggtatggc aagatggatg ggtg
<210〉 28
〈211〉 244 <212〉腿
<213> Phyllostachys atrovaginata
cccagctcgc cgtcgccgtc gtgacagttg ctgtgcggaa catcatcatc ctctttttta asagttgasg aggc3gac3g
60 120 180 240 274
<220>
<221〉 repeat—region
<222> (27).. (34) <223〉
<400〉 28
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctcggccc gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gatcagtgat gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg tatttgaagt gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga cagacagaag ggtg
ttcctcctct gctcgccgtc gtgatagtag ttgctgtgtg ctttgttttt tctttcctgt tacatagcat a3gatggatg
60 120 180 240 244
〈210〉 29
<211〉 274
<212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys praecox
<220〉<221〉 repeat—region 〈222〉 (27).. (42) 〈223〉
<220>
<221> repeat—region 〈222> (161)..(169) <223>
〈400〉 29
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctctctct
gcctgatcgt tcaccgcttc gcttcacagg gatcagtact
ctcttgtttt agtgttgtat ccacatttat gatgtattac
aagtatttgt ttttctctct tgtgcttgat atggtatggc
tgaacei3犯g tatatsgc3t aagatggatg ggtg
ctcagctcgc cgtcgccgtc gtgacagttg ctgtgtggaa catcatcatc ttcttttttg aaagttgaag aggcagatag
60 120 180 240 274
〈210〉 30
<211> 244
<212> DNA
<213〉 Phyllostachys praecox
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (27),. (34) <223〉
<400〉 30
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga ggtg
<210〉 31 <211> 316 <212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia
ctctcggctt ttcctcctct gctcgccgtc
gatcagtgst gtgatsgt3g ttgctgtgtg
tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgc
cagacagaag tacatagcat aagatggatg
60 120 180 240 244〈220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (27) .(68) <223〉
<220>
〈221> repeat—region <222> (201).. (212) 〈223〉
<400〉 31 gccgtccaaacgctccttcttctgaactctctctctctct ctctctctctctctctctct60
ctctctctcagctcttcctcctcagctcgccgtcgccgtc gcctgatcgctcaccgcttc120
gcttcacagggatcagtgctgtgacagttgctgtgtggaa ctcttgttttagtgttttat180
ccacatttatgatgtattatcatcatcatcatcttctttt tgaagtatttgtttttcttt240
cttgtgcttgatatggtatggcaaagttgaa^ggca>gac agtg幼caaa agtatstagc300
3t犯geitggELtgggtg316
<210〉 32
<211〉 298
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (27)..(50) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (180).. (194) <223〉
<400〉 32
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctctctct ctctctctct cagctcttcc 60
tcctcagctc gccgtcgccg tcgcctgatc gttcaccgct tcgcttcaca gggatcagtg 120
ctgtgacagt tgctgtgtgg aactcttgtt ttagtgttgt atccacattt atgatgtatc 180
atcatcatca tcatcttctt tttgaagtat ttgtttttct ttcttatgct tgatatggta 240tggcaaagtt gaagaggcag acagtgaaca aaeigtatata gcataagatg gatgggtg 298
<210> 33
〈211〉 244
<212〉 ■
<213〉 Phyllostachys nidularia
〈220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (27)..(34) 〈223〉
<400〉 33
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gaactcttgt tttagtgttg tacccacatg gtttcatatg gtattgcaas gttgaaggga ggtg
ctctcggctc ttcctcctct gctcgccgtc 60 gatcagtgat gtgatagtag ttgctgtgtg 120 tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgt 180 C3gac3gaag tacat3gcat aagatggatg 240
244
<210〉 34
<211〉 294
〈212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys kwangsiensis
〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (69).. (78) 〈223〉
〈400〉 34 gccgtccaaacgctccttcttctg犯ctctctctctctctctctctctcagctcttcctc60
ctcetgctcgccgtcgccgtcgcctgstcgttcaccgcttcgcttcacagggatcagtgct120
gtgacggttgctgtgtggaactcttgttttagtgttgtatccacatttatgatgteittat180
catc3tcatcttcttttttgaagtatttgtttttctttcttgtgcttga/tatggtatggc240
aaagttgaagaggc卿cagtgaacaaaagtata/tagcata卿"t卿tgggtg294
<210> 35 <211〉 244<212> DNA
<213〉 Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉
〈221> repeat—region
<222> (27).. (48) 〈223>
<220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (181)..(189) <223〉
<400> 35
gccgtccaaa cgctccttct tctgaactct ctctcggctc ttcctcctct gctcgccgtc 60
gccggatcgt tcaccgcttc gcctcacagg gatcagtgat gtagtagtag ttgctgtgtg 120
gaactcttgt tttagtgttg tatccacatg tatttgaagt ctttgttttt tctttcctgt 180
gtttcatatg gtattgcaaa gttgaaggga cagacagaag tacatagcat aagatggatg 240
ggtg 244
<210〉 36
<211〉 104
<212> DNA
<213〉 Phyllostachys heteroclada <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (23).. (58) <223〉
〈400〉 36
cccacagasg gtcgcactat acag3gagag agagagagag agagagagag agagagaggc 60 acaggatcgg gatggcgata ccttgatgta gacgttctcg gcgg 104
<210〉 37
<211〉 94
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys bambusoides<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (23).. (48) 〈223〉
<400> 37
cccacagaag gtcgcactat acagagagag agagagagag agagagaggc acaggatcgg 60 gatggcgata ccttgatgta gacgttctcg gcgg 94
<210〉 38
<211> 86
〈212〉 醒
〈213> Phyllostachys atrovaginata
<220〉
<221〉 repeat—region
<222> 咖..(40) 〈223〉
<400〉 38
cccacagaBg gtcgceict3t acag3gag3g 3g3g3gsgag gcacaggatc g3gatggcga 60 taccttgatg tagacgttct cggcgg 86
<210〉 39
<211〉 88
〈212〉 ■
<213〉 Phyllostachys nidularia
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (23)..(40) <223>
<400〉 39
cccacagasg gtcgcactat acagagag3g agagagagag gggcacagga tcaggatggc 60 gataccttga tgt卿cgtt ctcggcgg 88
<210> 40〈211〉 88
〈212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys kwangsiensis <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (23).. (40) <223>
<400〉 40
cccacagaag gtcgcactat acag3gagag agagagagag aggcacagga tcgagatggc 60 gataccttga tgtagacgtt ctcggcgg 88
<210〉 41
<211> 126
<212> DNA
<213〉 Phyllostachys praecox
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (66).. (73) <223〉
< 41
cccacagaag gtcgcactac agccacagcc cttacaggaa tcgtctcgca atcaagggac 60
gcactagaga gaggaaggca cacagggcgc gggacggcga taccttgatg tagacgttct 120
cggcgg 126
<210> 42
<211〉 242
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys heteroclada
〈220〉
<221〉 repeat_region <222> (93).. (119) <223>〈400> 42
tatgcctcca ataatccgct caacgtcata cggaggtgag gatgatcttg aacgacacct ccgcggcgcc gccgcccgcc gccatggggt cgagtggttc acctcacctc ggttgcggtt
〈210> 43 <211〉 230 <212〉 ■
<213〉 Phyllostachys heteroclada
tctattaaaa gtgacccggg agcttggggt 60 tccctcctcc tcctcctcct cctcctcctg 120 gtgggtgttg ggggaggggg gtcg卿cgc 180 tgcgtgatcg atagattcgg tggctacgcc 240
242
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (92)..(112) 〈223〉
<400> 43
tatgcctcca ataatccgct caacgtcata ggaggtg3gg atgatcttga scgacacctt gccgccacct gccgccatgg agtgtgggtg ctcgcctcgg tcacggtttg cgtgatcgat
<210> 44
<211〉 240
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys bambusoides
gct3ttaasa gtg犯gggga gcttggggtc 60
ccctcctcct cctcctcctc ctaccgcgcc 120
ttgggggggt cgagacgccg agtggttcgc 180
agattcggtg gctacgcctt 230
<220〉
<221> repeat—region
<222〉 (92)..(118) <223〉
<400〉 44
tatgcctcca ataatccgct caacgtcaca gctattaaaa gtgaagggga gcttggggtc 60
ggaggtgagg atgatcttga acgacacctt ccctcctcct cctcctcctc ctcctcctcc 120
cgccgcggtg tcgtcgccgc catggggtgt gggtgttgag gggggggggt cgagacgccg 180
agtggttcgc ctcgcctcgg tcgcggtttg cgtgatcgat agattcggtg gctacgcctt 240
30〈210> 45
〈211> 245 <212>腿
〈213> Phyllostachys atrovaginata 〈220>
〈221> repeat—region
<222> (93).. (112) 〈223>
〈400〉 45
tatgcctcca ataatccgct caacgtcata gctattaaaa gtgaagcggg agcttggggt 60
cggaggtaag gatgatcttg aacgacacct tccctcctcc tcctcctcct cctcctcctc 120
ctgccgcggc gccgccgccc gccgccatgg ggtgtgggtg ttgggggagg ggggtcgaga 180
cgccgagtgg ttcacctcac ctcggttgcg gtttgcgtga tcgatagatt cggtggctac 240
gcctt 245
<210> 46
〈211〉 230
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (92).. (112) <223>
<400> 46
tatgcctcca ataatccgct caacgtcaca tctattaaaa gtgaagggga gcttggggtc 60
ggaggtgagg atgatcttga acgacacctt ccctcctcct cctcctcctc ctaccgcgcc 120
gccgccacct gccgccatgg agtgtgggtg ttgggggggt cgagacgccg agtggttcgc 180
ctcgcctcgg tcacggtttg cgtgatcgat agattcggtg gctacgcctt 230
<210> 47
〈211〉 285
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys heteroclada<220>
〈221> repeat—region 〈222> (244).. (252) 〈223>
〈400〉 47 gacgacgagt gt幼cgctgagaagtcctcaaaatcccctctaggtcagtc atgctctcca60
tcagtgc3gs catcctattstgagtttcctcaaagaaatcattctgaatt tgctccatct120
caagtaatct gcctcaagtctcattctgaaattcaacttgttcggccttg atttcttgca180
aagagctaag aatgagctgctgattttgaagaatctgtgc240
catcagcagc agtagcaacagcaggaacctcaccggcatcatcct285
<210〉48
〈211〉285
〈212〉DNA
〈213>Phyllostachys bambusoides
〈220〉
<221〉repeat—region
<222〉(244) . (252)
〈223〉
<400〉 48 gacgacgagt gt肌cgctgaggggtcctcaaactctctgcc犯gtca/tga aagctctcca60
tcagggcagg catcctgttatgagactcatcgaagaaatcattttgagtt cgctccatct120
cacgtaatct gcctcgagtctcactctgaaattcagcttgttcagccttg atttcttgca180
aagagctaag tatgagttgctgattctg幼gaatctatgcaagagtgcta> tcagcaggag240
catcaacagc agtagcaateigcaggagcctcaccggcatcatcct285
<210> 49
<211> 285
<212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys atrovaginata <220〉
<221〉 repeat—region
〈222〉 (244).. (252) <223><400> 49 gacgscg3gtgtaacgctgaggagtcctca aaatcccctc taggtcactcatgctctcca60
tC3gtgC3g3catcct3tt3tgagtttcctcaaaga犯tc eittctg犯tttgctccatct120
c犯gt犯tctacctcgagtctcattctgaa attcaacttg ttcagccttg atttcttgca180
aagagctaagaatgagctgctgattttgaa gaatctatgc aagagtgcta tcagtaggaa240
catcagcagca^gtagc肪c3gcaggaacctcaccggcatc atcct285
〈210>50
〈211〉285
〈212〉DNA
〈213〉Phyllostachys praecox
<220〉
〈221>repeat—region
〈222〉(244) . (252)
〈223〉
<400〉 50 gacgscgagtgtaacgctgaggagtcctcaaaatcccctc t犯gtcagtcatgctctcca60
tcagtgcagacatcctattatgagtttcctcagagaaatc attctgaatttgctctatct120
caagtaatcttcctcgagtctcattctg犯attcagcttg ttcagtcttgatttcttgca180
犯tgagctgctgattttg犯gaatctatgc aagagtactatC3gC3gg肪240
cat卿cagcgceiggagcctcaccggcatc atcct285
<210〉51
<211〉285
<212〉DNA
<213〉Phyllostachys nidularia
<220〉
<221〉repeat—region
〈222〉(244),. (252)
<223〉
〈400〉 51 gacgacgagtgtaacgctgeiggagtcctcaaaatcccctc taggtcagtcatgctctcca60
ttagtgcagacatcctattatgagtttcctc犯eigaaatc aittctg犯tttgctccatct120
caagt犯tctgcctcgagtctcattctg犯attcaacttg ttcagccttgatttcttgca180aagagctaag aatgagctgc tgattttgaa gaatctgtgc aagagtgcta tcagtaggaa 240 catcagcagc agtagcaaca gcaggaacct caccggcatc atcct 285
<210> 52
〈211> 285
〈212> DNA
<213> Phyllostachys bambusoides 〈220>
<221> repeat—region
<222〉 (244)..(252) 〈223>
〈400〉 52
gacgacgagt gtaacgctga ggggtcctca aactctctgc caagtcatga aagctctcca 60
tcagggcaga catcctgtta tgagactcat cgaagaaatc attctgagtt cgctccatct 120
cacgtaatct gccttgagtc tcactctgaa attcagcttg ttcagccttg atttcttgca 180
aagagcteiag aatgagttgc tgattctgaa gaatctgtgc aagagtgcta tcagcaggag 240
catcagcagc agtagcaata gcaggagcct caccggcatc atcct 285
<210> 53
〈211〉 189
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys heteroclada <220〉
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (141).. (155) <223〉
〈400〉 53
tcctagccct accctgtccc cttttcggtc acgccgcccg tccctgcctc cgccgcgccc 60
gagcgccccc tttttctgcc ccttctccgt ggatctcgcc gcttctcgtc gcccgccatt 120
aaggccaccg cggcaagcct ctccctcctc ctcctccggc ccccctagcc tatttaagcg 180
3gC3CCgtg 189
<210〉 54 <211〉 202〈212> 腿
〈213〉 Phyllostachys bambusoides
〈220>
〈221〉 repeat—region 〈222> (154)..(165) 〈223>
<400〉 54 tcctagccct
ctgccgcttc
agccgccatt
gcctatttaa
accctgtccc gtctccaccg cggcgtcacc gcccatgcct tggcaccgcg ccatacctcc aatggccgac tcgactgcca tgcctcctcc
gCg3gC3CCg tg
tcccgcctcc gccgcactcg tccccatgcc gcgcgggtca tcctcctggg caccccagtc
60 120 180 202
〈210> 55
〈211〉 191
〈212〉 腿
<213〉 Phyllostachys atrovaginata
<220〉
<221〉 repeat—region
<222> (138).. (152) <223〉
<400> 55 tcctagccct
tgcgccctct
aaagccgacc
cgagcaccgt
accctgtccc gtctcccccg tgccatccgt ttttctcctc ttccccgcgc ggtcaagccg tccacctctc ctcctcctcc tcctttgggt
ccccgcctcc gtcgcgcccg gacccccccc acccgccatt ctccctgggg cctatttaag
60 120 180 191
<210〉 56
<211〉 193
<212〉 DM
<213> Phyllostachys nidularia
<220〉
<221〉 repeat—region <222〉 (146).. (157)〈223>
<400> 56
tcctagccct accctgtccc actttcggtc acgccgctca tccccgcctc cgccgcgccc gtgcaccccc cctttttgcc ccttcgccgc gattctcgcc gcttctcgcg gcccgccatt aaagccggtg cgacaacctc tccccctcct cctcctctgg gcctccccga gccctattta agcgagcacc gtg
〈210〉 57
〈211> 189
〈212> 腿
<213〉 Phyllostachys kwangsiensis
60 120 180 193
<220>
〈221〉 repeat—region
〈222〉 (142). .(153) <223>
<400〉 57
tcctagccct accctgtccc cttttcggtc gcgcgccccg cttttcccac actccacgcg agccgacctc cacctttccc cctcctcctc agcaccgtg
gcgcagcccg tcctcgcctc cgccgcagcc 60 gtaaagcctg cacccgccgc tcgccattaa 120 ctccgggtct ccctggggcc tatttaagcg 180
189
<210> 58
<211〉 117
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys heteroclada
<220〉
<221> repeat—region
<222〉 (89).. (100) <223>
<400〉 58
tcgcatct犯acaacstcaa aacagcgggg a犯tg犯ttg atscccttgg agscgcgtgei 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
〈210> 59〈211> 117
<212> DNA
<213> Phyllostachys bambusoides <220>
<221> repeat—region
〈222> (89).. (100) 〈223>
<400> 59
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaatgaattg atacccttgg agacgcgtga 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
〈210> 60
〈211> 117
<212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys atrovaginata <220>
〈221> repeat—region
〈222〉 (89)..(100) <223>
<400〉 60
tcgcatctaa acaacatcaa ascagcgggg aaacgsattg atacccttgg agatgcatga 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgata ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
<210> 61
〈211〉 117
<212〉 DNA
<213〉 Phyilostachys praecox <220〉
<221> repeat—region
<222> 卿 . (100) <223〉
〈400> 61
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaacgaatgg atacccttgg agacgcgtga 60
37aacgctgaac aaaaacccat gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
<210> 62
<211> 117
<212> DNA
〈213> Phyllostachys nidulaxia 〈220>
〈221> repeat—region
<222> (89)..(100) 〈223>
〈400> 62
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaacaaattg atacccttgg agatgcgtga 60 aacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
〈210〉 63
<211> 117 〈212>腿
〈213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (89).. (100) 〈223〉
〈400〉 63
tcgcatctaa acaacatcaa aacagcgggg aaataaattg atacccttgg agatgcgtga 60 Eiacgctgaac aaaaacccac gaagatgatc ttcttcttct cctcctttct tcttctc 117
<210〉 64
<211〉 301
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys heteroclada <220>
<221〉 repeat—region
〈222> (147)..(155)<223〉
〈400> 64 3gggtgtt3tttgctattgtccaaccttgccacatgttat atattggcct ttggcccatt60
ggaatsgatc3gatgt3ttattctaacatggtatcagagc catgg朋eicc ctaeitcatag120
犯3CCCt3CCtccttgaccaacaaccgccgccgccactgc ccccgcgcca agcctcctac180
tgctcttctcttccttggaaccggtcta^gccacccgagt gccgcctcca tccgagcagc240
tg鄉tcgtgcggcgcctctacctgagcgccgcctccacg tcggcctcca gcgtcggatt300
t301
<210〉 65
〈211〉 279
〈212〉 DNA
〈213> Phyllostachys bambusoides 〈220〉
〈221> repeat—region
<222> (140)..(151) 〈223>
〈400> 65
agggtgttat ttgctattgt ccaaccttgt acatattata tattggcctt tggcccattg 60
gaatagacaa gatgctttat tccaaacatg gtatcagagc catagaaacc ctaaccatga 120
aaaccctacc tcttgaccag ccgccgccgc cgctgtcctg ttgctcctct ccccccagat 180
ccgcgcctga tttttggtgt cgagctctta. ccgtgccggc ctccttctcc gtcggccttc 240
atccgagcag gcccgagcgt cgcctccagc gtcggattt 279
〈210> 66
〈211〉 264
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys atrovaginata <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (160).. (171) <223〉
<400> 66
agggtgttat ttgctattgt gtttaacctt gtacatgtta tatattggcc tttggcccat 60
39tagaatacac aagatgcttt attccaaata tggtatcaga gctatagaaa ccctagccat 120
agaaacccta cctcttagcc aacagctgct accactgtag ccgccgccgc cattgcacat 180
cagcgtgcgg ccgcgcgcgc ccacaccagc ctctgctcac ggctcctctc cgccgcctcc 240
acatcggcct ccagcgtcgg attt 264
〈210〉 67
〈211> 331
<212> DNA
〈213> Phyllostachys praecox <220>
<221> repeat—region
<222> (145).. (153) <223>
<400> 67
鄉gtgttatttgctattgtccaatcttgt acatgttata tetctagcctt tgacctattg60
gatgcattattccaactggt atcggagtca tggaaaccct agctatagaa120
accctacctccttgaccaaccaccgccgcc gccaccatcc ctgcgccgag cttcttcccg180
ctgctcttctctctctcggattcgtgccaa cccgagcgcc gcctcctcaa ctccagccag240
cgtttgctccgcgcctctagcgacgcctcc acgccggcct cccgcgccag attcacaccg300
gcgcctgctccatgcctccagcgtcggatt t331
〈210> 68
〈211〉 146
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222> (77).. (92) <223〉
<400〉 68
aaagatgttg ccttgttcat aaatgttgta tgttcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgatggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146〈210> 69
<211> 146
<212〉 腿
<213> Phyllostachys bambusoides 〈220〉
〈221> repeat—region
<222> (77)..(92) 〈223>
<400> 69
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta tgttcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgagggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
<210> 70
<211> 146
<212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys atrovagirmta <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (77).. (92) <223〉
<400〉 70
aaagatgttg ccttgttcat aatggtcgta tgctcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgatggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
〈210〉 71
<211〉 146
〈212〉 腿
<213> Phyllostachys praecox <220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (77)..卿〈223>
<400> 71
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta agttcaatta ttcactgtac ttgctgagtc 60
tcggactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgacgacggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
〈210> 72
<211> 146
〈212〉 DNA
〈213> Phyilostachys nidularia
<220〉
〈221> repeat—region
<222> (77)..卿 <223>
<400〉 72
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta agttcaatta ttcattgtac ttgctgagtc 60
tcgaactcat tcttgctttg tttgtttgtt tgtttatttt aggtgatcgt tgatgatggc 120
tctattggga gggaatagac atgcac 146
<210〉 73
〈211〉 138
<212〉 DNA
<213> Phyllostachys kwangsiensis
<220〉
<221〉 repeat—region
<222> (77).. (88) <223>
<400> 73
aaagatgttg ccttgttcat aattgttgta tgttcaatta ttcactgtac ttgctaagtc 60
tcggactcert tcttgctttg tttgtttgtt ttaggtgatc gttgatgatg gctctattgg 120
gagggaatag acatgcac 138
<210> 74 <211> 208〈212>腿
<213> Phyllostachys heteroclada <220>
<221> repeat—region
〈222〉 (98)..(112) 〈223>
〈400> 74
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
<210> 75
〈211> 208
〈212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys bambusoides 〈220〉
〈221> repeat—region
〈222〉 (98).. (112) <223〉
<400> 75
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgcc tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
<210> 76
<211〉 208
<212> DNA
<213> Phyllostachys atrovaginata <220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (98)..(112)
43<223>
<400> 76
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
〈210> 77
〈211〉 208
<212> ■
<213> Phyilostachys praecox
〈220〉
〈221> repeat—region
〈222〉 (98). .(112) <223>
〈400〉 77
tttcatggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
tagggttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
<210> 78
<211〉 208
<212> ■
<213〉 Phyllostachys nidularia
<220>
<221〉 repeat—region
〈222〉 (98).. (112) <223〉
<400〉 78
tttcEitggag ggcgacaggg tgctcgccta ccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt 60
tccctttctc ctcacttgct tcctccgttc aattcaattc cgttccgttc cgttccaatc 120
t鄉gttatt attacatgta ttggcattcc cctccggatg gccatgtcga atcgattctt 180
cctagctttc gtttgtttcc tggtcggc 208
44<210> 79<211> 208〈212> DNA<213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220><221〉 repeat—region<222> (98)..(112) <223>〈400> 79 tttca_tgg￡tg ggcgac鄉gaactcgcctaccacggcccc ctcctctacg aggccaaggt60tccctttctc ctcactggaatcctccgttcaattcaattc cgttccgttc cgttccaatc120tagggttatt attacatgtattggcattcccctccggatg gccatgtcga atcgattctt180cctagctttc gtttgtttcctggtcggc208<210〉80<211〉281<212>DNA<213〉Phyilostachys heteroclada<220〉<221>repeat—region<222〉(231).. (255)<223〉<400〉 80 gttgtgccca gcactttagaagaaggttsgc鄉ggcagg caaccaatta gsgggsttga60gagagaatag agattgaataattgcatgac tttctaagca tgatcttgta120tgtcttccat ttatttgctgcatgtttttagttttttgta ggagcttact tgattacgtt180atattacatt tttctatgagcttacttgattacgctatat aaattgattt atttcatttc240atttcatttc atttcaggacaccaagaaatgagtggcgtc a281<210> 81〈211〉 281<212> DNA<213> Phyllostachys bambusoides〈220><221> repeat—region <222> (231)..(255) <223〉〈柳> 81gttgtgccca gcactttag3 ag3aggttag caagggcsgg ctacccctta gagggattgg 60aagagaatag agattgaata aaataaccaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt '180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgctatat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281〈210> 82<211> 281〈212> DNA〈213> Phyilostachys atrovaginata <220><221〉 repeat—region<222〉 (231).. (255) 〈223〉〈德82gttgtgccca gcactttaga agaaggttag caggggcagg caaagaatta gagggattgg 60gagagaatag 3gattgaata aaataactaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt 180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgcta/tat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281<210> 83<211〉 281<212> DNA<213> Phyllostachys praecox <220><221〉 repeat—region<222〉 (231).. (255)<223>〈400〉 83gttgtgccca gcactttaga agaaggttag caggggcagg caaccaatta gagggattgg 60gagagaatag agattgaata aaa/taactaa attgca/tgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt 180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgctatat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281〈210〉 84〈211〉 281<212> DNA〈213〉 Phyllostachys nidularia 〈220>〈221> repeat—region<222> (231),. (255) 〈223〉〈■ 84gttgtgccca gcactttaga agaaggttag caagggcagg caaccaatta gagggattgg 60gagagaatag agattgaata aaatagctaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta gttttttgta ggagcttact tgattacgtt 180atattacatt tttctatgag cttacttgat tacgctatat taattgattt atttcatttc 240atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281<210> 85<211〉 281<212〉 ■<213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉<221〉 repeat—region<222〉 (231).. (255) <223〉<400〉 85gttgtgcccB gcactttaga agaeiggttag csggggteigg caeisgastts gagggattgg 60 gagagaatag agattgaata aaataactaa attgcatgat tttctaagca tgatcttgta 120tgtcttccat ttatttgctg catgttttta attttttgta tgagcttact tgattacgtt 180 atattacatt tttctatgag cttacttggt tacgctatat taattgattt atttcatttc 240 atttcatttc atttcaggac accaagaaat gagtggcgtc a 281〈210> 86〈211〉 144〈212> DNA〈213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉〈221> repeat—region〈222〉 (95).. (114) 〈223>〈400〉 86ctatcatcaa atgtgcctca atatttatgt tttctaatca cggctggggg tggataacga ta3tg3gc3g犯eigtgaggc tcgg<210〉 87<211> 268<212〉 陽<213〉 Phyllostachys heteroclada <220〉<221> repeat—region<222〉 (248).. (265) <223〉<400> 87aaagcaacca cgccattaat atactcttgg cggtccatct atgatacgca tgtaacaaat tacgtactca tcctatttac caaacatact cataaagggt tatagatcgt taccctcag3 agaatcctct ccttctcctt ctcctccg〈210〉 88 <211> 28148gaattttaaa attcaaacca ccttcccatt gccagctcgg ctcggctcgg ctcgttaagcctcacacggt tcataccgta catccagttt tagtgtcaaa ttagattaat taatcacaac taaattgatt agctattaat ttattgcaaa gctcacgacg aaaataccaa atatatcttg60 120 14460 120 180 240 268〈212> DNA〈213> Phyllostachys bambusoides<220>〈221> repeat—region <222> (259)..(276) 〈223>〈400> 88aaagcaacca cgccattaat gtactcttga ctcacacggc tcacaccgta catccagttt 60tggtccatct atacgcatgt aacaaatcag tgtcaaatta cattaataaa ccacaagtac 120aaacccttct taattattga ccaaacatac ttaaattgct tagcgattaa cctagagcaa 180atataaaggg ttaaagatcg ttaccctagg agctcacgac aaaygggcca aatatcctct 240gagatcctcg ggaatccttt ctccttctcc ttctcctccg a 281<210> 89<211> 280 <212>誰<213> Phyllostachys atrovaginata<220><221〉 repeat—region 〈222> (248).. (277) <223〉<400> 89aaagcaacca cgccattaat gtactcttga tagtccatct acgatacaca tgtaacaaat tgcgtacttt ttctatttac caaacatact tataaagggt tatagatcgt taccctcaga agaatcctct ccttctcctt ctccttctcc<210〉 90<211> 285<212〉 ■<213〉 Phyllostachys praecoxctcccacagt tcacaccgta catccagttt 60tagtgtcaaa ttagattaat taaccgcaag 120taaattgatt agagattaat ttatagcaaa 180gctcatgatg aaaataccaa atatctctcg 240ttctcctccg 280<220〉49<221> repeat—region 〈222> (253)..(261) 〈223>〈400〉 90 aaagcaacca cgccattaatatactcttgactcacacggttcac已ccgta catccaattt60cggtccatct acactacacatgcaacaaattaattagtgtcaaatteLgeit tetataaaxxa120caagtacgta ctcttcctattgaccaaacatacttatattg3ttagcgat taactta/tag180caaacateaa gggttatsgattgttacccttagagctcatgacgaaaata ctaaatatcc240ctcgagattc ctctcctcctccttctccttctccttctcctccgei285<210〉91〈211〉271<212>DNA<213>Phyllostachys nidularia<220>〈221〉repeat—region<222〉(250)., (267)<223〉<400〉 91 aaagcaacca cgccattaatgtactcttgactcacacagctctcaccgta catccagttt60tggtccatct atacgcatgttgtcaetattacattaataac ccgc肪gtac120aaactcttct taattattgattaaattgcttaacgatata acctagagca180aatataaagg gttaaagatcgttaccctcggagctcacgacaa^幼tacc 3犯tatcccg240cgagattcct ctccttctccttctcctccg3271<210> 92<211> 258<212〉 DNA<213〉 Phyllostachys kwangsiensis <220><221〉 repeat—region〈222〉 (237).. (254) <223〉<400> 92
aaagcaacca cgccattaat gtactcttga cggtccatct acgctacaca tgtaaca肪t cctatttacc aaacatactt aaattgatta atagatcgtt accctcg犯g ctcacgacgei cttctccttc tcctccga
〈210> 93
〈211〉 157
〈212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys heteroclada
ctcacacgat tcacaccgta aatccagttt 60 tagattaata aaccgcaagt acgtactctt 120 gcgattaatt tatagcaaac ataaagggtt 180 aaatact犯a tatctctcga gaatcctctc 240
258
〈220〉
〈221 > r印eat一reg i on
〈222〉 (102〉.. (m〉 〈223〉
〈400> 93
caggtagtcg tcttalcgag tttttcttga atttatagtt tga犯gtatt tttatgaccg ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt
<210〉 94
〈211〉 157
〈212〉 纖
<213> Phyllostachys bambusoides
aattgacata gtttgattta atatcatttt 60 agctaatgag ccgagccgag ccgagccgag 120 gacttat 157
<220>
<221> repeat一region
〈222〉 (108)., (122)
〈223〉
<400> 94
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga atttatagtt tg犯agtatt tttatgaccg ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt
aattgacata gtttgattta atatcatttt G0 agctaatgag ccgagctgag ccgagccgag 120 gacttat 157
〈210〉 95 〈211〉 157〈212> 腿
〈213> Phyllostachys atrovaginata 〈220>
〈221> repeat—region
〈222> (102).. (121)
〈223>
<400> 95
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt tttatgaccg agctaatgag ccgagccgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
〈210> 96
〈211〉 157
〈212〉 DNA
〈213〉 Phyllostachys praecox <220>
<221〉 repeat_region
<222〉 (108)..(122) <223>
<400> 96
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt ttt3tgaccg agctaatgag ccgagctgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
〈210> 97
<211〉 157
〈212〉 DNA
<213〉 Phyllostachys nidularia 〈220>
<221〉 repeat—region
<222〉 (102)..(121〉 〈223〉< 97
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt tttatgaccg agctaatgag ccgagccgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
〈210> 98
〈211> 157
〈212> DM
<213> Phyllostachys kwangsiensis 〈220〉
〈221〉 repeat—region
〈222> (102).. (121) <223>
〈婦 98
caggtagtcg tcttatcgag tttttcttga aattgacata gtttgattta atatcatttt 60
atttatagtt tgaaagtatt tttatgaccg agctaatgag ccgagctgag ccgagccgag 120
ccagggtgaa ttccaatttc attcgaaatt gacttat 157
<210> 99
<211〉 374
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys heteroclada <220〉
<221〉 repeat—region
<222> (122).. (127) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region
<222〉 (165)..(179) <223〉
<220〉
<221〉 repeat—region 〈222〉 (208).. (213)
53〈223〉 〈400〉 99
gttgcccgtg gttactgtct catccttctc atgctgccgg ttttaatggc acaagcagcc 60
actgcttggg gctttataga gaaaagttat cacaggcggt ttcagccaca犯ccgtctat 120
gatatatact tatcacagac gattttagcc acaaaccgtc tgtgatatat acttatcaca 180
gacggttgca gccacaaacc gtctatgata tatacttatc gcagacgatt tcagccacaa 240
accgtctgtg ataggttcct atcacagacg ttttcagtta ataaccgtct gtgagagtat 300
gcatcacaga cggtttgaaa actgtctatg atgacctcat gtctttactg acccataaac 360
tcagatggct cacg 374
〈210〉 100
〈211> 255
<212〉 DNA
〈213> Phyllostachys bambusoides <220〉
<221> repeat—region
〈222〉 卿..柳 <223>
〈220〉
<221> repeat—region 〈222〉 (77)..(86) <223〉
〈400〉 100
gttgcccgtg gttactgtct catccttctc atgctgcgtg gacgatcccc ccaaagtggc 60 tgagagacta cgaacaatat atatatgatg ccggatttaa tggcacaagc agccactgct 120 tagggcttta tagagaaaag tcatcacaga cggtttgtgg ctgaaaccgt ctgtgaaagt 180 atgcatcaca gacggttcaa aactatctgt gatgacctca tgtcatcact gacccataaa 240 ctcagatggc tcacg 255
〈210> 101
<211〉 299
〈212〉 ■
<213> Phyllostachys atrovaginata〈220>
〈221> repeat—region
〈222〉 (62).. (67) <223〉
<220>
〈221> repeat—region
<222〉 (81).. (86) <223>
<400> 101 gttgcccgtg gtteictgtctcatccttctc atgctgcgtggatgattcccccaaagtggt60
tgagagacta cgaacaatacatatatgatg ccggttttaatggcac犯gcagccactgct120
tggggcttta tagagaa朋gtcatcacaga agatttcagccaca犯ccgtctatgatagg180
ttcctatcat agacggtttcagttaataac cgtctgtaaaagtatgcatcacagacggtt240
tgaaaaccgt ctgtgatgacctcsitgtcat cactgaccceitaaactcetgatggctcacg299
〈210〉102
<211〉220
〈212〉DNA
〈213〉Phyllostachys kwangsiensis
<220〉
<221>r印eat一region
〈222〉卿..(71)
<223〉
<400〉 102 gttgcccgtg gttactgtctcatcctcaca atcgcccgaaagtgactaggggacatgaac60
aata/tatata tgaagccagttttaaaggca caagcaaccactgcttggtc120
gaatacteitc acagacagtttcatccac幼actgtttgtgatagta1;gc8tctgtgatga180
tctcatgtca ttactgatctataaact卿atggctcacg220
5權利要求
1，一種毛竹微衛星分子標記的開發方法，其特征包括如下步驟(1)毛竹DNA序列的獲得用毛竹的拉丁文學名作為關鍵詞，在美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫中檢索并下載獲得；(2)含有微衛星DNA序列的篩選用單機版微衛星分析程序和在線微衛星位點分析軟件，對下載的序列進行篩選，獲得含有微衛星位點的毛竹DNA序列；(3)引物設計和微衛星位點驗證①引物設計用引物設計軟件設計擴增含有微衛星位點的DNA聚合酶鏈式反應引物，引物含有堿基數控制在18-22個，兩引物退火溫度差＜4℃，擴增的DNA片段在350個堿基以內；②微衛星驗證利用上述引物進行DNA聚合酶鏈式反應擴增、擴增產物的電泳分離、銀染檢測、微衛星位點的再擴增、亞克隆和測序確認工作，最后得到19對毛竹微衛星標記引物，其退火溫度在46℃-59℃。
2，用權利要求1所述的毛竹微衛星分子標記的開發方法，其特征是獲得19 對毛竹微衛星標記的引物分別是PBM002 PBM004 PBM007 PBM011 PBM013 PBM014 PBM016 PBM017 PBM018 PBM019 PBM020 PBM021 PBM022 ATGGAGCATTCATTTGAG-3，.CGATGAAGTTGCCTGTGG-3' -CTCGAGGTGAAGTTACATTA-3， .TAAAGAAGTATAATGTATTCG-3， TTTTACTAACGTGCCCGTATT-3' .GCCGTCCAAACGCTCCTT-3，.CCCACAGAAGGTCGCACTA-3' TATGCCTCCAATAATCCG-3,.5，- TTGACAAGTTTGGAGGGT-3' 5，- TCAAGTCGCATTGGAGTA-3' 5， - TCGTAGAGCACTATCCATTT-3， 5 ，- AGCTGTTTTAGCATCTATGTT-3 ， 5'- GGAGGATCGCTGGATTGG-3' 5，- CACCCATCCATCTTATGCTAT-3' 5，- CCGCCGAGAACGTCTACAT-3' 5，- AAGGCGTAGCCACCGAAT-3'，-GACGACGAGTGTAACGCTGAG-3， 5，- AGGATGATGCCGGTGAGG-3'.5，- TCCTAGCCCTACCCTGTCC-3， 5，- TCGCATCTAAACAACATC-3， 5，- AGGGTGTTATTTGCTATTGT-3， 5 ，- AAAGATGTTGCCTTGTTC-3'.5,隱CACGGTGCTCGCTTAAATAG-3' ;，-GAGAAGAAGAAAGGAGGA-3' 5，- AAATCCGACGCTGGAGGC-3， 5，- GTGCATGTCTATTCCCTC-3'PBM023: 5 ，- TTTCATGGAGGGCGACAG-3' 5 ， - GCCGACCAGGAAACAAACGAA-3' PBM025: 5，- GTTGTGCCCAGCACTTTA-3' 5，- TGACGCCACTCATTTCTT -3' PBM026: 5，- CTATCATCAAATGTGCCTCAA -3' 5，- CCGAGCCTCACTTTCTGC-3' PBM027: 5,- AAAGCAACCACGCCATTA-3' 5，- TCGGAGGAGAAGGAGAAG-3' PBM028: 5，- CAGGTAGTCGTCTTATCGAGT-3' 5，- ATAAGTCAATTTCGAATGAA-3' PBM030: 5，- GTTGCCCGTGGTTACTGT-3' 5 ，- CGTGAGCCATCTGAGTTT-3'
3，如權力要求2所述的毛竹微衛星分子標記的開發方法，其特征是編號分 別為PBM002、 PBM004、 PBM007、 PBMOll、 PBM013、 PBM014、 PBM016、 PBM017、 PBM018、 PBM019、 PBM020、 PBM021、 PBM022、 PBM023、 PBM025、 PBM026、 PBM027、 PBM028、 PBM030的微衛星核苷酸序列兩端的引物的退火 溫度分別為48。C、 48°C、 53°C、 50°C、 53°C、 52°C、 56。C、 55°C、 52°C、 59°C、 46°C、 55。C、 47°C、 58。C、 47。C、 50°C、 49°C、 53°C、 50°C。
4，如權利要求2所述的毛竹微衛星分子標記的應用，其特征是所說的引物， 應用于篌竹、烏芽竹、雷竹、水竹、假毛竹和桂竹6個剛竹屬代表竹種微衛星的 開發，通過擴增和測序確認獲得了 102條含有微衛星位點的剛竹屬DNA序列見 表(2)。
全文摘要
一種毛竹微衛星分子標記的開發，經過毛竹DNA序列的獲得，含有微衛星位點的篩選，引物設計和微衛星位點的驗證三步驟，最后獲得19對微衛星分子標記引物，探索出其適宜的退火溫度為46-59℃，再將毛竹微衛星引物經DNA聚合酶鏈式反應應用于其他6種剛竹屬竹種，擴增并測序確認繼而獲得102條含有微衛星位點的剛竹屬DNA序列。采用本方法開發竹類的微衛星分子標記，具有簡單、快速、穩定、高效和低成本的優點，為竹子的輔助育種提供了新的工具。
文檔編號C12P19/00GK101629196SQ20091010212
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月13日 優先權日2009年8月13日 公開號200910102125.發明者盧江杰, 周明兵, 湯定飲 申請人:浙江林學院 被以下專利引用 (1),