專利名稱：：一種乙酸萘酯酶的凈化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種乙酸萘酯酶的凈化方法，尤其是一種可用于有機(jī)磷農(nóng)藥快速測(cè)定的乙酸萘酯酶的凈化方法。(二)
背景技術(shù)：
：測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法主要有色譜法和酶抑制法，色譜法雖然可靠，但耗時(shí)、成本高，需要受過(guò)專門訓(xùn)練的技術(shù)人員操作，只適合在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不適合在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在用酶抑制法快速測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥中常用的酶為乙酰膽堿酯酶，乙酰膽堿酯酶從動(dòng)物血液或組織中提取。雖然動(dòng)物乙酰膽堿酯酶比較靈敏，但容易失活，價(jià)格昂貴，且操作需要一定的技術(shù)，熟練掌握有一定的難度，不太適合在蔬菜基地快速檢測(cè)使用和大面積推廣使用。現(xiàn)有公開的測(cè)定果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的植物源性酯酶(在目前公開的資料中將這類酶稱為植物酯酶，根據(jù)酶學(xué)分類和命名，這種命名方法不夠確切。本方法中根據(jù)該酯酶催化的底物(乙酸萘酯)和酶學(xué)分類、命名原則，將該酯酶命名為乙酸萘酯酶)的提取方法，由于酶源的處理、提取液的選擇、酶源浸泡時(shí)間以及酶源質(zhì)量與提取液比例的選擇等條件優(yōu)化不足的原因，所提取出的酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限較高。申請(qǐng)人在之前的申請(qǐng)200710071204.4中公開了一種乙酸萘酯酶的提取方法，以蒸餾水為提取液，從含有乙酸萘酯酶的種子中提取得到酯酶粗提液，然后經(jīng)硫酸銨分段鹽析，所得酶液經(jīng)透析除鹽，再將透析后的酶液濃縮、冷凍干燥得到乙酸萘酯酶。該方法能夠制得對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感、對(duì)農(nóng)藥的最低檢出限較低的酯酶。所述乙酸萘酯酶可催化下列反應(yīng)"-乙酸萘酯+水"^—"-萘酚+乙酸a-萘酚+固藍(lán)鹽B—顯色產(chǎn)物+氯化鋅+氯化氫但是，200710071204.4中公開的乙酸萘酯酶的提取方法，所提取出的酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限仍然較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能用于快速測(cè)定果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的乙酸萘酯酶的凈化方法，以提高酶的活性，降低最低檢出限，提高檢測(cè)靈敏度，使有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定更加可靠。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種乙酸萘酯酶的凈化方法，以蒸餾水為提取劑提取得到的乙酸萘酯酶粗提液先經(jīng)過(guò)硫酸銨分段鹽析，然后透析除鹽，所得酶液進(jìn)行凈化，所述凈化方法如下以0.150.25mol/LNaCl溶液為洗脫液，使所得酶液過(guò)SephadexG-lOO葡聚糖凝膠柱，收集含有乙酸萘酯酶的洗脫液，冷凍干燥即得乙酸萘酯酶。本發(fā)明采用凝膠柱層析，通常先取酶液樣品進(jìn)行洗脫試-驗(yàn)，以獲知乙酸萘酯酶被洗脫下來(lái)的時(shí)間段，然后剩余酶液采用同樣洗脫條件進(jìn)行洗脫，收集該時(shí)間段內(nèi)的洗脫液，即為含有乙酸萘酯酶的洗脫液，經(jīng)后處理即可得到乙酸萘酯酶。本發(fā)明所述的凈化方法具體推薦按照如下步驟進(jìn)行(1)取酶液，以0.150.25mol/LNaCl溶液為洗脫液，使酶液過(guò)SephadexG-lOO葡聚糖凝膠柱，按照時(shí)間梯度分別收集洗脫液，4全測(cè)各時(shí)4段洗脫液的乙酸萘酯酶含量，獲得洗脫液中乙酸萘酯酶含量與保留時(shí)間的關(guān)系圖，記錄出現(xiàn)分離峰的時(shí)間段；(2)然后將剩余酶液按照步驟(1)所述方法進(jìn)行洗脫，收集出現(xiàn)分離峰的時(shí)間,殳內(nèi)的洗脫液，所得洗脫液經(jīng)冷凍干燥得到乙酸萘酯酶。本發(fā)明制得的乙酸萘酯酶一般置于4。C水箱保存。使用前取出，待酶溫恢復(fù)至室溫后，用pH6.38的磷酸緩沖液配制成5U/mg的酶液。本發(fā)明使用的SephadexG-100葡聚糖凝膠柱可采用常規(guī)方法進(jìn)行制備，包括凝膠處理、裝柱、平衡、加樣、洗脫、收集等步驟。其中凝膠處理步驟，通常先根據(jù)層析住的體積和所選用的凝膠溶脹后的床體積，計(jì)算所需溶膠干粉的質(zhì)量，將稱好的SephadexG-100干粉置于過(guò)量蒸餾水中，使之充分吸水溶脹，然后通過(guò)抽濾等方法排出凝膠內(nèi)部的氣泡。裝柱時(shí)要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時(shí)斷時(shí)續(xù)，否則會(huì)出現(xiàn)斷層。凝膠沉積后，要用平衡液平衡層析柱，一般平衡液為有一定的pH和離子強(qiáng)度的緩沖液(比如磷酸緩沖液)，用恒流泵在恒定壓力下走柱子，壓力通常與洗脫時(shí)的壓力一致，當(dāng)下出口流出液的pH值與平衡液的pH值一致時(shí)，層析柱即達(dá)到了平衡。本發(fā)明在洗脫時(shí)采用恒流泵在恒定壓力下走柱子，保持不同次洗脫在同樣的洗脫條件下進(jìn)行。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法提供的凈化方法采用了凝膠柱層析法，通過(guò)對(duì)凝膠柱和洗脫液的篩選，使得通過(guò)凈化能夠提高酶的活力近IO倍，能夠使最低檢出限降低近10倍，大大提高了檢測(cè)靈敏度，使有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定更加可靠。圖1為本發(fā)明制得的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為本發(fā)明制得的a-萘酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為實(shí)施例2制得的酶活與時(shí)間關(guān)系圖。具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本發(fā)明進(jìn)行柱層析〗吏用的樣品均為按照200710071204.4所述4是耳又方法提取得到的酶液。本發(fā)明中所得酶液中蛋白質(zhì)含量以及酶活力測(cè)定采用如下方法1乙酸萘酯酶總蛋白含量的測(cè)定及蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)考馬斯亮藍(lán)G-250法原理考馬斯亮藍(lán)G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作筒便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍0~1000嗎/mL,是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。(2)蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支10mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定其吸光度值，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖l所示。所述的蛋白質(zhì)為乙酸萘酯酶標(biāo)準(zhǔn)品。表l蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管號(hào)1234567100嗎/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液00.10.20.30.40.50.6(mL)蒸餾水(mL)1.00.90.80.70.60.50,4考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5.05.05.05.05.05.05.0(mL)蛋白質(zhì)含量(嗎)010.020.030.040.050.060.0(3)樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定吸取0.5mL酶液加入到10mL具塞刻度試管中，力卩0.5ml水，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，記錄吸光度值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X(嗎)。以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做空白。結(jié)果如表2所示。2乙酸萘酯酶的活力測(cè)定(1)a-萘酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用無(wú)水乙醇將a-萘酚配成0.01mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.01mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液OmL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL，用pH6.38的磷酸緩沖溶液定容至6mL,從中取3.1mL,35°C恒溫水浴10min后，加入0.9mL1562mg/L固藍(lán)B鹽水溶液，以蒸餾水為參比，于550nm處測(cè)定吸光度，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。7(2)乙酸萘酯酶的活力測(cè)定取pH6.38的磷酸緩沖溶液和酶液各1mL放在一個(gè)10mL容量瓶里，再取lmL基質(zhì)顯色液(體積比為1:9的1250mg/L乙酸-a-萘酯乙醇溶液與1562mg/L固藍(lán)B鹽水〉容液)；故于一個(gè)試管里，然后將2個(gè)管同時(shí)在35。C恒溫水浴中孵溫10min后，將試管中的溶液迅速倒入容量并瓦里，蒸餾水定容至10mL后，在550nm下進(jìn)行動(dòng)力學(xué)掃描，以蒸餾水為參比。記錄反應(yīng)30min時(shí)在550nm下的吸光度值。從a-萘酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)吸光度值查得a-萘酚的含量，然后根據(jù)酶活力的定義計(jì)算酶活力。結(jié)果如表2所示。酶活力以單位U計(jì)，其定義為單位時(shí)間(1min)內(nèi)植物酯酶與底物反應(yīng)所得產(chǎn)物a-萘酚的變化量，1U二liiga-萘酚/min。實(shí)施例1:樣品酶液的提取從小麥粉中提取乙酸萘酯酶的步驟如下(1)粗提將小麥粉在4。C用蒸餾水浸泡15h，小麥粉與水的質(zhì)量比為1:10，取其上清液；所得的上清液以4500r.p.m,04。C離心，耳又其上清液，即得酯酶粗提液；(2)硫酸銨分段鹽析在冰浴中，緩慢攪拌酯酶粗提液中，并加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨的飽和度約為50%;上述所得溶液于4500r.p.m，04。C冷凍離心，保留沉淀；加入pH6.38的磷酸緩沖溶液溶解沉淀，并用pH6.38的磷酸緩沖溶液稀釋4倍；(3)透析將上步經(jīng)過(guò)石克酸銨沉淀的酶液裝入透析袋中，用其體積20倍的蒸餾水透析24h,其間換水5次，直至用1。/。BaCl2無(wú)法測(cè)出硫酸根為止。分別測(cè)定步驟(1)得到的酯酶粗提液和步驟(3)得到的酶液的酶活及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表2所示。實(shí)施例2:凈化第一步稱取10g的SephadexG-100干粉，加200mL去離子水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細(xì)微顆粒，然后將凝膠液放進(jìn)抽濾瓶中，進(jìn)行抽真空處理，直到凝膠液中沒(méi)有氣泡出現(xiàn)為止。第二步將層析柱(柱規(guī)格為1.6x50cm,裝填高度40cm)清洗干凈垂直固定到層析架上，力。1/3體積的無(wú)離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有10%的凝膠液倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱。第三步柱層析上樣前必須對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，以pH8.0磷酸緩沖液為平衡液，將pH8.0磷酸緩沖液滴入層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1mL/min,當(dāng)下出口流出液的pH值與pH8.0磷酸，爰沖液的pH值一致時(shí)，層析柱達(dá)到了平衡。第四步將實(shí)施例1步驟(3)所得的酶液上柱。上樣前，關(guān)閉層析柱下端的出口，用移液槍吸取lmL酶液，加入到層析柱凝膠的頂端，在啟動(dòng)恒流泵之前，始終關(guān)閉層析柱下端的出口；恒流泵啟動(dòng)后，調(diào)節(jié)層析柱下端的出口，保證在凈化過(guò)程中，層析柱中的液面始終維持在凝膠上端的0.5-1cm處。第五步用恒流泵將0.2mol/LNaCl溶液以lmL/min的恒定流速泵入層析柱中，進(jìn)行洗脫酶液，用離心管收集洗脫液，收集量為5mL/管。對(duì)收集的每管洗脫液進(jìn)行酶活力分析測(cè)定。以時(shí)間為4黃坐標(biāo)，酶的比活力為縱坐標(biāo)，作酶活(比活力)與時(shí)間的關(guān)系圖(見圖3),得到兩個(gè)分離9峰，記錄出現(xiàn)每個(gè)分離峰的時(shí)間段。將剩余酶液在上述洗脫條件下進(jìn)行洗脫，收集兩個(gè)分離峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間段內(nèi)的洗脫液I和洗脫液II,測(cè)定洗脫液I和洗脫液II的酶活及蛋白質(zhì)含量，然后將收集到的洗脫液I和洗脫液II分別冷凍干燥，置于4。C水箱保存。測(cè)定結(jié)果如表2所示，洗脫液I和洗脫液II對(duì)應(yīng)的組分I和組分II的比活力由粗酶的0.563U/mg分別提高到了4.685U/mg和4.148U/mg,純化倍數(shù)分別提高了約8.3和7.4倍。表2SephadexG-100凝膠層析凈化乙酸萘酯酶的結(jié)果測(cè)試體積酶活蛋白質(zhì)比活力純化倍數(shù)(mL)(U)(mg)(U/mg)粗酶10.1280.2270.5631鹽析+透析后10.3000.1861.6122,864組分(I)10.6450.1374.6858.316組分(n)10.7070.1704.1487.362實(shí)施例3:乙酸萘酯酶對(duì)幾種有機(jī)磷農(nóng)藥最低檢出限的測(cè)定1、參考GB/T18630-2002的方法，將蔬菜樣品〗察去表面泥水，剪成1cn^左右的碎片，稱取5g置于燒杯中，加10mL丙酮浸泡5min，振蕩，加0.2g活性炭，搖勻，過(guò)濾。在蔬菜(生菜)樣品中噴施曱胺磷、敵敵畏、辛硫磷、馬拉硫磷、樂(lè)果五種農(nóng)藥，噴施的濃度均為0.5mg/kg，放置過(guò)夜后參照蔬菜樣品提取液的制備方法得到蔬菜中農(nóng)藥的提取液，同期未噴施農(nóng)藥的蔬菜樣品作為對(duì)照。2、將實(shí)施例1得到的酶液用0.2mol/L、pH6.38的磷酸緩沖液配制成5U/mg的酶液；將實(shí)施例2中洗脫液I得到的乙酸萘酯酶從冰箱中取出，待酶溫恢復(fù)至室溫后，用0.2mol/L、pH6.38的磷酸緩沖液配制成5U/mg的酶液。3、分別取曱胺磷、敵敵畏、辛硫磷、馬拉硫磷、樂(lè)果五種農(nóng)藥，每種農(nóng)藥用0.2mol/L、pH為6.38的磷酸緩沖溶液配制一系列濃度的抑制劑(農(nóng)藥溶液)，濃度設(shè)置如下0.001mg/L,0.005mg/L，O.Olmg/L,0.05mg/L,0.lmg/L，0.5mg/L，l.Omg/L,5.0mg/L,10.0mg/L。4、將96孔板置于BIO-RADModel680酶標(biāo)儀中，取230顯色基質(zhì)液(體積比為1:9的1250mg/L乙酸-a-萘酯乙醇溶液與1562mg/L固藍(lán)B鹽水溶液)加入到96孔板中待用。取180jxL酶溶液加入到0.5mL的離心管中。按濃度從高到低依次取20(iL的抑制劑以及噴農(nóng)藥和未噴農(nóng)藥的蔬菜4是取液，分別加入到含有酶溶液的離心管中作為實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)，在作為空白組的離心管中(加有180I^L酶溶液)加入20(iL的0.2mol/L、pH為6.38的石壽酸溶液。將酶與抑制劑的混合溶液置于35。C水浴恒溫30分鐘后，取20|iL酶與抑制劑或緩沖液的混合溶液力。入到盛有顯色基質(zhì)液的96孔板中立即讀數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)平行，以吸光度平均值表征酶活。根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率抑制率(％)=(A空白一A樣品)/A空白建立抑制率-抑制劑濃度工作曲線，利用噴農(nóng)藥和未噴農(nóng)藥的蔬菜提取液的吸光度值計(jì)算抑制率，從工作曲線上即可查得相應(yīng)的蔬菜提取液中殘余的農(nóng)藥濃度。以酶活被抑制10%作為農(nóng)藥的最低斗企出限。計(jì)算所得的凈化前后乙酸萘酯酶對(duì)幾種有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限如表3。表3凈化前后乙酸萘酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢出限<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、一種乙酸萘酯酶的凈化方法，以蒸餾水為提取劑提取得到的乙酸萘酯酶粗提液先經(jīng)過(guò)硫酸銨分段鹽析，然后透析除鹽，所得酶液進(jìn)行凈化，其特征在于所述凈化方法如下以0.15～0.25mol/LNaCl溶液為洗脫液，使所得酶液過(guò)SephadexG-100葡聚糖凝膠柱，收集含有乙酸萘酯酶的洗脫液，冷凍干燥即得乙酸萘酯酶。2、如權(quán)利要求1所述的乙酸萘酯酶的凈化方法，其特征在于所述的凈化方法如下(1)取酶液，以0.150.25mol/LNaCl溶液為洗脫液，使酶液過(guò)SephadexG-100葡聚糖凝膠柱，按照時(shí)間梯度分別收集洗脫液，檢測(cè)各時(shí)段洗脫液的乙酸萘酯酶含量，獲得洗脫液中乙酸萘酯酶含量與保留時(shí)間的關(guān)系圖，記錄出現(xiàn)分離峰的時(shí)間段；(2)然后將剩余酶液按照步驟(1)所述方法進(jìn)行洗脫，收集出現(xiàn)分離峰的時(shí)間段內(nèi)的洗脫液，所得洗脫液經(jīng)冷凍干燥得到乙酸萘酯酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種乙酸萘酯酶的凈化方法，以蒸餾水為提取劑提取得到的乙酸萘酯酶粗提液先經(jīng)過(guò)硫酸銨分段鹽析，然后透析除鹽，所得酶液進(jìn)行凈化，其特征在于所述凈化方法如下以0.15～0.25mol/LNaCl溶液為洗脫液，使所得酶液過(guò)SephadexG-100葡聚糖凝膠柱，收集含有乙酸萘酯酶的洗脫液，冷凍干燥即得乙酸萘酯酶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法提供的凈化方法能夠提高酶的活力近10倍，能夠使最低檢出限降低近10倍，大大提高了檢測(cè)靈敏度，使有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定更加可靠。文檔編號(hào)C12N9/16GK101597599SQ20091010055公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年7月7日優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日發(fā)明者劉維屏,盛唐,張安平,林春綿,胡曉燕,高偉亮申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)