雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲v期幼蟲55kd抗原單克隆抗體的制作方法

專利名稱：雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲v期幼蟲55kd抗原單克隆抗體的制作方法
雜交瘤細(xì)胞株
及其產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原單克隆抗體 就鄉(xiāng)
本發(fā)明涉及一種可產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原單克 隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原
單克隆抗體的方法。 蘿煮就
廣州管圓線蟲病(Angiostrongyliasis cantonensis)是指由廣 州管圓線蟲幼蟲在人體內(nèi)移行，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的以急性劇烈 頭痛為主要表現(xiàn)的嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎 (Eosinophilicmeningitis or Meningoencephalitis, EM)。至1945
年臺灣報(bào)道的第一例病例以來，該病陸續(xù)在我國大陸報(bào)道并呈逐年上 升趨勢，隨后分別在溫州、福建出現(xiàn)集體小范圍暴發(fā)流行，發(fā)病率達(dá) 到44.8%。 2003年廣州管圓線蟲病被衛(wèi)生部列為新發(fā)傳染病，但未引 起足夠的重視，缺乏對該病系統(tǒng)的認(rèn)識、高效的檢測手段和規(guī)范的診 療措施。2006年6月北京的局部暴發(fā)流行，發(fā)病人數(shù)之多、涉及范 圍之廣，給大眾敲響了警鐘，引起了社會各界人士的普遍關(guān)注。隨著 人們飲食習(xí)慣改變，廣州管圓線蟲病逐年攀升，己對我國公共衛(wèi)生和 人民健康造成嚴(yán)重的威脅，使我國政府部門和醫(yī)療機(jī)構(gòu)承受巨大的經(jīng) 濟(jì)損失與社會輿論壓力。
廣州管圓線蟲病的誤診率高，目前主要靠從病人腦脊液中檢測到幼齡 成蟲的蟲體來確診。由于該病的臨床癥狀與許多中樞神經(jīng)紊亂性疾病 很相似，且廣州管圓線蟲病病原學(xué)確診率又較低(<10%)，給臨床診 斷帶來很大困難。所以免疫學(xué)方法作為輔助診斷手段在廣州管圓線蟲病的診斷上具有重要價(jià)值。但國內(nèi)至今對該病的診斷還停留在抗體檢 測階段，因存在下列問題①感染后抗體的出現(xiàn)較晚，②完全治愈后 抗體仍會在體內(nèi)存在較長時間，無法進(jìn)行現(xiàn)癥感染診斷和療效考核， ③同其它蠕蟲感染有較高的交叉反應(yīng)等，限制了這些免疫診斷方法的 可靠性。
發(fā)辦容
本發(fā)明的目的在于為克服現(xiàn)有早期診斷廣州管圓線蟲病技術(shù)的不 足而提供一種雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原單克隆抗體。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的可產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼 蟲55 KD抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，名稱為 ACV1 ( Angiostrongylus cantonensis V stage larva 1,)。該細(xì)胞株已于2009 年4月29日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC一 C200930。
雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原的單 克隆抗體制備方法包括以下步驟
(1) 電滲法分離廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD蛋白；
(2) 以從步驟(1)分離得到的蛋白作為免疫原免疫動物；
(3) 取免疫動物脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)
胞；
(4) 從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動物腹水液中分離并純化 所需單克隆抗體。
雜交瘤細(xì)胞株ACV1可產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原的 單克隆抗體，此抗體可與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原具有較高 的結(jié)合特異性及親和力，將此單克隆抗體應(yīng)用于廣州管圓線蟲循環(huán)抗 原水平的檢測，提供了早期診斷廣州管圓線蟲病的方法。
由上述雜交瘤細(xì)胞ACV1產(chǎn)生的抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗 原單克隆抗體命名為ACV McAb。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為雜交瘤細(xì)胞的染色體核型觀察結(jié)果。
圖2為經(jīng)純化的雜交瘤細(xì)胞ACV1產(chǎn)生的單克隆抗體的SDS-PAGE 檢測結(jié)果。
圖3為純化的單克隆抗體與廣州管圓線蟲V期幼蟲抗原的結(jié)合特 異性的Western Blot檢測結(jié)果。 ,沐實(shí)嚴(yán)方義
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 雜交瘤細(xì)胞株ACV1及其產(chǎn)生的抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD 抗原單克隆抗體的獲得
1、 抗原制備從(^^"77ar^3 福壽螺體內(nèi)分離出廣州管 圓線蟲III期幼蟲，經(jīng)口感染SD大鼠，21天后從大鼠腦組織中檢獲 廣州管圓線蟲V期幼蟲，用生理鹽水漂洗5次，按常規(guī)方法提取廣州 管圓線蟲V期幼蟲抗原，跑12% PAGE膠(不加SDS)，將55 KD大 小蛋白條帶切膠后于電壓300V條件下電滲純化1小時，收集上清后 PBS透析24h。用Lowry法測定抗原的蛋白質(zhì)含量(4.0 mg / ml)，置 —2(TC保存。此外，將鼠血清置于—2CTC保存。
2、 免疫動物
選取6 8周齡雌性BALB/c小鼠(免疫動物還可以為小鼠、大鼠、 兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動物)，用200 Pg抗原/只免 疫2個月以上。第一次免疫加福氏完全佐劑(0.1 ml/只)，第二次 以后加福氏不完全佐劑，免疫間隔時間為3周。細(xì)胞融合前3天，取 鼠尾靜脈血，用間接ELISA法測定效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠尾靜脈 加強(qiáng)免疫一次。
3、 細(xì)胞融合
(1) 詞養(yǎng)細(xì)胞的制備將一只正常BALB/c小鼠處死，無菌狀態(tài) 下取出脾臟，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加無血清 RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，約為5X10VmL。
(2) 免疫脾細(xì)胞的制備將步驟2加強(qiáng)免疫三天后的BALB / c小肪，剪碎，置于平皿
中研磨，加無血清RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)活細(xì)胞數(shù)， 約為1X108個/mL。
(3) Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的處理取指數(shù)生長期的Sp2/0細(xì)胞，離 心，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗一次并懸浮于其中，計(jì)活細(xì)胞數(shù)， 約為2X107/mL。
(4) 免疫脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合將步驟(3)的Sp2/0 骨髓瘤細(xì)胞與步驟(2)的免疫脾細(xì)胞按l: 5比例混合均勻，離心， 盡量倒凈上清；然后在37。C水浴條件下，加入50%聚乙二醇(麗 1450)進(jìn)行細(xì)胞融合；再加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌，用HAT 選擇培養(yǎng)液(向含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入IOOX氨 基喋呤儲存液(HAT)， Sigma公司)重懸后與步驟(1)的飼養(yǎng)細(xì)胞混 合，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在5% C02孵箱中培養(yǎng)。自第七天 開始觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞生長至肉眼可視時，在顯微鏡 下將HAT選擇培養(yǎng)液換成含HT選擇培養(yǎng)液(含2XHT的RPMI 1640 培養(yǎng)基)，在C02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。約3天后可用ELISA法檢測培養(yǎng) 上清中抗體活性的高低，對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。
4、雜交瘤細(xì)胞的篩選
采用ELISA法篩選抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原抗體的 雜交瘤細(xì)胞，具體方法為
(1)用50 mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)稀釋步驟1的抗原至5 u g/L，加入到96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行包被，每孔IOO ul， 4°C 12 24 小時，用PBS-T緩沖液(80Q mL蒸餾水中溶解8 g NaCl， 0. 2 g KC1， 1. 44 g Na2HP04， 0. 24 g KH2HP04，用HC1 i周節(jié)pH至7. 4，然后加lmL Tween-20，用水定容到1 L，室溫保存)洗三遍；
(2) 用10%小牛血清進(jìn)行封閉，每孔IOO ul， 37°C 30分鐘， 用PBS-T緩沖液洗三遍；
(3) 向96孔板中添加步驟3的雜交瘤細(xì)胞上清，每孔100 u 1， 37°C l小時，用PBS-T緩沖液洗三遍；(4) 向96孔板中添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠第二抗體， 每孔50ul， 37°C 30分鐘，用PBS-T緩沖液洗三遍；
(5) 加堿性磷酸酶底物溶液(0.2 M Tris液50 ml, 0.1 N鹽酸 40mL, MgCl2 6H20 0.2 g，左旋咪唑2 mg， lX疊氮鈉5mL，調(diào)pH 至8.3，加水至IOO mL)， 37。C顯色15分鐘，加2 N H2S04，終止反
應(yīng)，測定0D450值，0D450值為陰性對照2. l倍的為陽性雜交瘤細(xì)胞。
5、 陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化及細(xì)胞庫的建立
(1) 陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化用有限稀釋法(K6hler G和C. Milstein. ， 1975， Nature 256:495)對步驟4篩選出的陽性孔的雜 交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆，使分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞單克隆 化，從而使其能分泌均一的單克隆抗體，同時也避免了不分泌抗體的 雜交瘤細(xì)胞過度生長而使分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞丟失。反復(fù)克隆化至 所有單個克隆的陽性率為100%,選取強(qiáng)陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，大量凍 存作為原始細(xì)胞庫。部分細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月以上，用下述步驟 6的方法檢測雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。
(2) 細(xì)胞庫的建立在對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化過程中，由 融合細(xì)胞、 一次亞克隆、二次亞克隆及體外連續(xù)培養(yǎng)3個月以上穩(wěn)定 分泌抗體的三次亞克隆細(xì)胞組成原始細(xì)胞庫。取原始細(xì)胞庫中三次亞 克隆的雜交瘤細(xì)胞株全面檢測，大量培養(yǎng)凍存，建立主細(xì)胞庫。取主 細(xì)胞庫的細(xì)胞大量培養(yǎng)，經(jīng)抗體活性及支原體復(fù)查合格后，凍存，每 批不少于20管，建成工作細(xì)胞庫。每次生產(chǎn)時取l管復(fù)蘇，用于制 備腹水抗體。
6、 雜交瘤細(xì)胞的鑒定
(1)抗體分泌穩(wěn)定性檢測對經(jīng)篩選獲得的其中一株強(qiáng)陽性單克 隆細(xì)胞株(命名為ACV1)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取部分細(xì)胞用生理鹽水調(diào) 整濃度為2X10e個/mL，將其接種于小鼠腹腔，接種細(xì)胞數(shù)為1X106 個/只。約7 10天形成腹水，至腹水增多，腹部特別膨隆時，處死 小鼠，取腹水，離心后取上清并用ELISA法測腹水效價(jià)。另取部分細(xì) 胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月后，用與上述同樣的條件對小鼠進(jìn)行腹腔接種，取腹水，離心后取上清并測腹水效價(jià)，結(jié)果二次ELISA測定結(jié)果 均達(dá)到1:105，表明該強(qiáng)陽性單克隆細(xì)胞株ACV1具有較好的抗體分泌 穩(wěn)定性。
(2) 雜交瘤細(xì)胞染色體分析對細(xì)胞株ACV1傳代培養(yǎng)36 48小 時后加入秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)4 6小時后收集細(xì)胞，加入已預(yù)溫至37 。C的0. 075 M KC1溶液懸浮細(xì)胞，37匸水浴15 20分鐘作低滲處理； 將細(xì)胞用甲醇/冰醋固定液三次固定后，懸浮在固定液中，4°C 12 24小時，然后離心，去上清，留少許固定液將細(xì)胞懸浮，混勻后滴 在剛從冰水中取出的載玻片上，吹散，通過火焰數(shù)次，自然干燥，用 10% Giemsa染色液染色10 20分鐘，洗去染液，自然干燥，鏡下 觀察雜交瘤細(xì)胞的染色體核型，顯微拍照。雜交瘤細(xì)胞的染色體核型 觀察結(jié)果見圖1，雜交瘤細(xì)胞ACV1平均染色體數(shù)目為102條左右， 接近Sp2/0細(xì)胞和脾細(xì)胞染色體數(shù)目之和(BALB / c小鼠脾細(xì)胞染色 體數(shù)目為40條，Sp2/0細(xì)胞的平均染色體數(shù)目為64條左右)，證明 該雜交瘤細(xì)胞株是由Sp2/0細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞融合而來的，且傳代后 的雜交瘤細(xì)胞呈現(xiàn)相同的染色體檢測結(jié)果，證明雜交瘤細(xì)胞在傳代過 程中攜帶抗體染色體產(chǎn)生基因，沒有喪失抗體分泌能力，并能將這種 能力遺傳給予細(xì)胞。
(3) 抗體亞型鑒定采用單克隆抗體亞型檢測試盒(ImmunoType TM Kit, Sigma)劑對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行免疫球蛋白亞型的鑒定， 具體方法為用PBS以1:1000比例稀釋各類抗體(按常規(guī)方法制備 的抗小鼠IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgA及IgM)，然后用稀釋抗 體包被96孔酶標(biāo)板(每孔IOO ul，每類抗體兩個孔)，37'C溫育1 小時后，棄包被液，洗滌3次，按IOO lU/孔的量加入單克隆細(xì)胞 株ACV1的培養(yǎng)上清，室溫溫育1小時后洗滌3次，按0. lmL /孔的 量加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (江蘇碧云天公司)，室溫 溫育30分鐘后，洗滌3次，按IOO "l/孔的量加入辣根過氧化物 酶底物反應(yīng)液(lmg/ml TMB)，室溫10 15分鐘，出現(xiàn)藍(lán)色即為陽性 結(jié)果，最后按50 ul/孔的量加入3 N NaOH終止反應(yīng)。結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞ACV1分泌的抗體為IgG2a亞類。
7、單克隆細(xì)胞株ACV1的抗體的大量制備及特異性鑒定
(1) 獲取抗體腹水選取20 22 g BALB/c小鼠(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí) 驗(yàn)動物中心提供)，雌性，腹腔注射降植垸，0.5 ml /只； 一周后， 將培養(yǎng)的對數(shù)生長期的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞懸液離心，沉淀細(xì)胞懸于 無血清RPMI 1640，重復(fù)離心洗滌2次，重懸于無血清RPMI 1640， 每只小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1X107 /只，同時對側(cè)再注入降植垸與 不完全福氏佐劑的等體積混合物0.5 ml /只。7 10天后待小鼠腹 部顯著膨隆后，收集腹水；將收集的腹水，12 000 rpm離心30秒， 去除底部沉淀和上層油脂，收集中段液體，用ELISA法測腹水效價(jià)， 結(jié)果符合要求，分裝，一2(TC凍存?zhèn)溆谩?br> (2) 抗體的親和層析純化用Pharmacia Biotech.公司的AKTA FPLC蛋白層析儀對經(jīng)初步純化的單克隆抗體進(jìn)行親和純化，具體方 法為先用3倍柱體積的0.02 M PBS(pH 7.0)沖洗HiTrap Protein G 層析柱(lmL， Amersham公司)填料中的乙醇，然后用5倍柱體積的 0.02 M PBS (pH 7.0)平衡層析柱，將2 mL經(jīng)硫酸銨初步純化的抗 體溶液加入層析柱，用5倍柱體積的0. 02 M PBS (pH 7. 0)沖洗層 析柱，收集流出液，當(dāng)紫外線檢測器出現(xiàn)IgG洗脫峰時，迅速用已加 入60 100 u 1 0.05 M Tris-HCl緩沖液(pH9.5)的離心管收集， 最后用5倍體積的0.02M PBS (pH7. 0)沖洗平衡層析柱，收集流出 液，將純化的抗體分裝，一2(TC保存。
(3)抗體純度及濃度測定分別將單克隆抗體腹水及經(jīng)Protein G-S印harose親和層析純化后的抗體按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢 測，檢測結(jié)果見圖2 (泳道M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道ACV:純化 單抗)，結(jié)果經(jīng)親和層析純化后的抗體的電泳圖譜呈現(xiàn)二條區(qū)帶，為 抗體的輕鏈和重鏈，分子量約為24KD和53KD。經(jīng)掃描測定，經(jīng)親和 層析后的抗體純度達(dá)98%以上，獲得了純度較高的單克隆抗體。將20 mL單克隆腹水抗體用上述方法提純后，用PBS調(diào)整至原體積，以PBS
為空白對照，測定抗體溶液的0D450值，計(jì)算出抗體濃度約為10mg/mL。
(4)單克隆抗體特異性鑒定用免疫印跡反應(yīng)(Western Blot) 檢測上述純化的單克隆抗體與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原的結(jié) 合特異性。將廣州管圓線蟲V期幼蟲抗原、日本血吸蟲蟲卵抗原、豬 囊尾蚴抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲抗原和旋毛蟲抗原進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以上述純化的單克隆抗體為一抗、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，具體方法可參考文獻(xiàn) (Sambrook， J.，等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版，888頁)，結(jié)果見圖3(泳道1:廣州管 圓線蟲V期幼蟲抗原，泳道2:日本血吸蟲蟲卵抗原，泳道3:豬囊
尾蚴抗原，泳道4:衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲抗原，泳道5:旋毛蟲抗原)，
表明所制備的單克隆抗體只與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原特異 結(jié)合，而不與日本血吸蟲抗原、衛(wèi)氏并殖吸蟲抗原、豬囊尾蚴抗原和 旋毛蟲抗原結(jié)合。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的單克隆細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的單克隆抗 體具有較好的結(jié)合特異性，將該抗體命名為ACV McAb。
8、 ACV McAb與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原的親和力測定 采用非競爭性ELISA法測定ACV McAb與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原的親和力，具體方法為用0.05 mol/L、 pH 9. 6碳酸鹽緩沖 液將廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原稀釋至濃度分別為1000、 500、 250、 125 ng/mL，然后加入酶標(biāo)板，100 y 1 /孑L， 4"C包被12 24 小時；棄去抗原溶液，用PBS (含0.05。/。Tween 20)洗板3次；每孔 加入150 ul含l^牛血清白蛋白的PBS， 37。C封閉0.5小時，加入 系列稀釋的純化單克隆抗體ACV McAb (從1:1000開始按102倍比進(jìn) 行稀釋)，100 ul/孔，37'C孵育1小時，洗板3次；加入HRP標(biāo)記 的二抗羊抗鼠IgG(1:2000)， 100 u 1 /孔，37。C孵育0. 5小時，洗 板3次；加入底物lmg / mL TMB，用底物緩沖液(O. 01%&02)稀釋，100 u 1 /孔，室溫避光放置5 10分鐘；最后用2mol / L H2S04終止反應(yīng)，測定各孔450 nm的^值，繪制測定曲線4條，讀出每一包被抗原的 最大吸光度"值)l / 2所對應(yīng)的抗體濃度，利用Beatty計(jì)算公式 (Beatty 瓜 Beatty BG, Vlahos WG, " <3丄 Measurement of monoelonal antibody by non-competitive enzyme immunoassay[J]. J Immunol Med， 1987, 100(1-2):173-178.)確 定純化后的ACV McAb的親和常數(shù)K值，結(jié)果K值為10.26X109 mol-、 與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原也具有較高的親和力。
上述實(shí)施例中的檢測結(jié)果表明本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的 單克隆抗體ACV McAb與廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原具有較高 的結(jié)合特異性及親和力。
廣州管圓線蟲循環(huán)抗原水平的檢測
現(xiàn)用ELISA法用雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的單克隆抗體ACV McAb 對廣州管圓線蟲循環(huán)抗原水平進(jìn)行檢測，包括以下步驟
(1) 包被酶標(biāo)板用50 mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)將用常規(guī)方法 制備的抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原多抗血清稀釋至濃度為1 mg / mL，每孔100 ix 1， 4。C放置12 24小時，然后用10 mM PBS-0. 05 %Tween 20 (pH7. 4)洗三遍；
(2) 封閉己包被的酶標(biāo)板用10%的小牛血清封閉包被的酶聯(lián) 板，100 yl/孔，37。C保溫30分鐘；
(3) 在酶標(biāo)板上分別加入病人血清或廣州管圓線蟲感染小鼠血清 100 u 1 /孔，37。C保溫1小時，然后用10 mM PBS-0. 05%Tween 20 (pH7.4)洗三遍；
(4) 在酶標(biāo)板上加入濃度為0. 2 mg / L單克隆抗體ACV McAb， 100 li 1 /孑L， 37。C保溫1小時，然后用10 mM PBS-O. 05%Tween 20 (pH7. 4)洗三遍;
(5) 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG， 50 ul/ L， 37。C保 溫30分鐘，然后用10 mM PBS-0, 05%Tween 20 (pH7.4)洗三遍;
(6) 加辣根過氧化物酶底物溶液(lmg / mL TMB) ，50 u 1 /孔，37 。C顯色15分鐘；(7) 加2 N H2S04 50 u 1 /孔終止反應(yīng)；
(8) 測定0D450值。
步驟(5)中的二抗也可以是過氧化物酶或堿性磷酸酯酶標(biāo)記的抗
鼠或抗兔抗抗體。
結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(1)廣州管圓線蟲感染小鼠血清均為陽性， 與正常組鼠血清相比具有顯著性差異(尸<0. 01); (2)檢測病人血清， 通過與病原學(xué)檢査、臨床癥狀及發(fā)病史進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)病原學(xué)陽性或 有典型廣州管圓線蟲病臨床癥狀患者血清中的廣州管圓線蟲循環(huán)抗 原水平均較正常組要高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.01)。表明本
發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的單克隆抗體ACV McAb可用于人血清廣 州管圓線蟲循環(huán)抗原水平的檢測。
廣州管圓線蟲循環(huán)抗原的免疫檢測方法還可為放射免疫法、酶聯(lián) 免疫吸附法、夾心式免疫法、免疫沉淀或免疫熒光等。
上述檢測方法中，待測樣品的選擇可以是來自患者的血清和腦脊液。
所述單克隆抗體與樣品發(fā)生相互作用的條件，可依據(jù)檢測方法進(jìn) 行確定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，對于固相反應(yīng)而言，可以將本發(fā)明所述單 克隆抗體固定于固相載體，反應(yīng)通常在室溫下進(jìn)行，檢測過程中需要 洗滌不與本發(fā)明所述單克隆抗體結(jié)合的樣品的步驟。
對于液相反應(yīng)而言，通常可以向處在特定緩沖體系中的待測樣品 中直接加入本發(fā)明的單克隆抗體，然后在適于抗原抗體發(fā)生相互作用 的溫度下(如室溫)進(jìn)行反應(yīng)。
所述檢測方法中第二抗體的選擇取決于本發(fā)明單克隆抗體的來 源。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何根據(jù)單克隆抗體的來源選擇相應(yīng)的第二 抗體。所述第二抗體可以是放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用
選自32P、 1251、 S、 W等；也可以是非放射性同位素標(biāo)記的，包括 但不限于使用選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、鏈霉親 和素等標(biāo)記。本發(fā)明所述檢測方法中使用的檢測劑，取決于檢測過程使用的第二抗體的標(biāo)記物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何選擇合適的檢測 試劑。
上述檢測方法中的反應(yīng)條件及試劑均可按照常規(guī)方法進(jìn)行選擇。 本發(fā)明還提供了一種檢測人廣州管圓線蟲循環(huán)抗原水平的試劑
本發(fā)明所提供的檢測人廣州管圓線蟲循環(huán)抗原水平的試劑盒，可
包括由上述雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD 抗原的單克隆抗體。
所述試劑盒還可包括與上述雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的抗廣州管 圓線蟲V期幼蟲55 KD蛋白的單克隆抗體發(fā)生相互作用的第二抗體。
所述第二抗體可為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG等。
所述第二抗體可為經(jīng)過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶等標(biāo)記酶 標(biāo)記的，優(yōu)選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或 過碘酸法交聯(lián)在抗體上。
試劑盒中還可包括顯色液A液和顯色液B液，所述顯色液A液為 過氧化氫或過氧化脲溶液，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯 胺溶液。
為方便使用，所述試劑盒還可包括檢測用的洗滌液，如PBST等常 規(guī)的洗滌試劑；封閉液，如10%小牛血清等；抗體稀釋液，如50 mM 碳酸鹽緩沖液(pH 9.5)等。
權(quán)利要求
1、一種可產(chǎn)生抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55KD抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述雜交瘤細(xì)胞株為ACV1。
2、 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生抗廣州管 圓線蟲V期幼蟲55 KD抗原的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包 括以下步驟(1) 電滲法分離廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD蛋白；(2) 以從步驟(1)分離得到的蛋白作為免疫原免疫動物；(3) 取免疫動物脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞；(4) 從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動物腹水液中分離并純化 所需單克隆抗體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:繼續(xù)用Protein G-S印harose親和層析法對步驟(4)獲得的單克隆抗體進(jìn)行純化。
4、 一種檢測廣州管圓線蟲循環(huán)抗原水平的試劑盒，其特征在于 包括由雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55 KD抗 原的單克隆抗體、與雜交瘤細(xì)胞株ACV1產(chǎn)生的抗廣州管圓線蟲V期 幼蟲55 KD蛋白的單克隆抗體發(fā)生相互作用的第二抗體，所述第二抗 體可為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG等，試劑盒中還可包括顯色液A液和 顯色液B液。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述第二抗 體可為經(jīng)過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶等標(biāo)記酶標(biāo)記的，優(yōu)選為 辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯(lián)在 抗體上；所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲溶液，所述顯色液B 液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了雜交瘤細(xì)胞株ACV1及其抗廣州管圓線蟲V期幼蟲55KD抗原的單克隆抗體ACV McAb。該抗體可與廣州管圓線蟲V期幼蟲55KD抗原特異結(jié)合。該抗體制備方法簡單，可由雜交瘤細(xì)胞株ACV1直接分泌產(chǎn)生。此抗體可與廣州管圓線蟲V期幼蟲55KD抗原具有較高的結(jié)合特異性及親和力，將此單克隆抗體應(yīng)用于廣州管圓線蟲循環(huán)抗原水平的檢測，提供了早期診斷廣州管圓線蟲病的方法。
文檔編號C12N5/20GK101654668SQ20091010041
公開日2010年2月24日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者李江輝, 潘長旺, 昕 胡, 峰 譚 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院