生物催化制備(s)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的方法

專利名稱：：生物催化制備(s)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種脂肪酶酶法催化2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解合成西司他丁關(guān)鍵手性中間體(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸的方法。(二)
背景技術(shù)：
S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中間體。西司他丁(Cilsatatin)化學(xué)名(+)-(Z)-7-[(2R)-(2-氨基-2-羧基乙基)硫]-2-[(1S)-(2,2-一甲基環(huán)丙烷甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的腎脫氫二肽酶抑制劑。西司他丁與碳青霉烯類抗生素亞胺培南(Imipenem)制成的復(fù)合劑泰能(Tienam)既有極強(qiáng)的廣譜抗菌活性，又具卩-內(nèi)酰胺酶抑制作用，對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌均有較強(qiáng)的抗菌作用，特別適用于治療多種菌聯(lián)合感染以及需氧菌和厭氧菌的混合感染，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素和治療未知重癥感染的王牌藥物之一。泰能于1985年11月由美國(guó)默沙東公司首先上市。2006年該產(chǎn)品的世界市場(chǎng)銷售額為7.05億美元，在全球暢銷處方藥排名第146位；2007年世界市場(chǎng)銷售額達(dá)7.46億美元，比上年增長(zhǎng)8%;2008年上半年為4.4億美元，比上年同期增長(zhǎng)6%。目前國(guó)內(nèi)該藥品主要依賴進(jìn)口。西司他丁作為一種特異性酶抑制劑，本身沒有抗菌活性，它不但能有效地保護(hù)亞胺培南免遭體內(nèi)腎脫氫肽酶(DPH-I)的破壞，繼而增加泌尿道中未經(jīng)改變的亞胺培南濃度，同時(shí)增強(qiáng)了亞胺培南的抗菌活性。西司他丁還可阻抑亞胺培南進(jìn)入腎小管上皮組織，減少亞胺培南的排泄并減輕藥物的腎毒性。2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸衍生物也是合成擬除蟲菊酯類殺蟲劑的關(guān)鍵中間體，目前已有近50個(gè)品種，產(chǎn)量已占?xì)⑾x劑類產(chǎn)量的20%，發(fā)展前景廣闊。光學(xué)純2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的制備技術(shù)已成為近年來的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)目前多采用化學(xué)法合成消旋產(chǎn)物，然后通過拆分得到S-W-2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸。如有報(bào)道以異戊烯酸為原料，經(jīng)酸的酯化、烯鍵的環(huán)丙烷化、酯水解制得2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸，收率為44.1%。其中，環(huán)丙烷化反應(yīng)采用鋅粉/氯化亞銅-乙酰氯作為催化劑，二溴甲烷作為環(huán)丙烷化試劑，這樣可以在溫和的條件下進(jìn)行反應(yīng)，降低成本。此外用L-肉堿草酸鹽作為手性拆分試劑，經(jīng)?；?、成鹽、部分結(jié)晶、水解得到S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸，收率為16.7%，手性純度大于95%。此路線環(huán)境友好、成本較低，但工藝步驟多，收率非常低。近年來也有采用微生物水解其它種類底物得到S-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸或S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酰月安的報(bào)道，如王梅祥等人(Enzymaticsynthesisofopticallyactive2-methyl-and2，2-dimethylcyclopropanecarboxylicacidsandtheirderivatives.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic2002，18:267-272)利用從土壤中篩選的i/7odococcwsp.AJ270菌種水解2,2-二甲基環(huán)丙烷甲腈得到S-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙垸甲酸，產(chǎn)物e.e.值和水解拆分率分別為82%和39%。金少軍等(R-enantioselectivehydrolysisof2，2畫dimethylcyclopropanecar隱boxamidebyamidasefromanewlyisolatedstrainSrev/6acter/wme//de/7wzVi/sZJB-07021.JournalofAppliedMicrobiology2008,105:1150-1157)以2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺為底物，利用產(chǎn)R型專一性酰胺酶的表皮短桿菌份，'&c^/謂.印zV^7mVfe進(jìn)行不對(duì)稱拆分得到S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺，拆分得率為41.1%，目標(biāo)物e.e.值為99%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用具有高立體選擇性、專一性強(qiáng)的脂肪酶不對(duì)稱水解2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯制備(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的新方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種生物催化不對(duì)稱水解制備式(I)所示(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸的新方法，所述方法以式(II)所示的2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯為底物，以Novozym435脂肪酶為生物催化劑，在水相反應(yīng)體系中于pH6,08.0、2545。C下進(jìn)行生物催化不對(duì)稱水解反應(yīng)，反應(yīng)完全后，反應(yīng)液經(jīng)分離得到(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸產(chǎn)物。本發(fā)明催化2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解的反應(yīng)過程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>所述的Novozym435脂肪酶購(gòu)自丹麥諾維信公司(Novozymes,Denmark)0本發(fā)明所述的水相反應(yīng)體系通?？梢允莗H6.08.0的磷酸鹽緩沖液體系，即所述的反應(yīng)是將2，2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯與Novozym435脂肪酶加入pH值為6.08.0的磷酸緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，通常反應(yīng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，pH6.08.0、2545°C，所述的2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的添加量為25mmol140mmol/L磷酸緩沖液，所述的Novozym435脂肪酶添加量為10g28g/L磷酸緩沖液。為提高本發(fā)明的反應(yīng)速率，通常在本發(fā)明所述的水相反應(yīng)體系中加入一定量的表面活性劑來制備得到(SM+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸產(chǎn)物。加入表面活性劑后使表面活性劑在反應(yīng)體系中的終濃度為1%5%(wt，重量百分?jǐn)?shù))。所述的表面活性劑為下列之一四丁基溴化銨、十六垸基三甲基溴化銨(CTAB)、2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐溫一20(Tween-20)、吐溫一60(Tween-60)、吐溫一80(Tween-80)、.辛基苯酚聚氧乙烯醚(乳化劑OP-10)。進(jìn)一步，本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑為2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)。優(yōu)選所述的反應(yīng)體系中加入AOT的終濃度為2.5%wt。再進(jìn)一步本發(fā)明反應(yīng)體系中所述的2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的添加量?jī)?yōu)選為100mol/L磷酸緩沖液，所述的Novozym435脂肪酶添加量?jī)?yōu)選為16g/L磷酸緩沖液。本發(fā)明進(jìn)行生物催化不對(duì)稱水解反應(yīng)后，所述的分離純化方法為用堿液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至9.0左右，加入等體積的乙酸乙酯萃取，取萃余液，用酸調(diào)節(jié)萃余液pH至2.0左右，加入與萃余液等體積的乙酸乙酯萃取一次或兩次，取乙酸乙酯層，揮發(fā)除去乙酸乙酯后即得產(chǎn)物(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸。具體的，所述方法為以2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯為底物，以Novozym435脂肪酶為生物催化劑，首先將一定量的表面活性劑(2.5%wt)溶于1.0mol/L磷酸緩沖液(pH6.08.0,優(yōu)選為pH7.2)中，然后加入一定量的酶和底物2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯，酶加量?jī)?yōu)選為16g/L緩沖液，底物添加量?jī)?yōu)選為100mmol/L緩沖液，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，于30'C下進(jìn)行生物催化不對(duì)稱水解反應(yīng)；反應(yīng)完全后，以濃度為2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至9.0，加入等體積的乙酸乙酯萃取，取萃余液，然后以濃度為2mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)萃余液pH至2.0，加入與萃余液等體積的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，揮發(fā)除去乙酸乙酯后即得所述的(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸產(chǎn)物。本發(fā)明的有益效果在于，采用脂肪酶催化2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的不對(duì)稱水解反應(yīng)時(shí)，酶的專一性強(qiáng)，催化效率高，無副產(chǎn)物形成，且產(chǎn)物的光學(xué)純度和產(chǎn)率均較化學(xué)法高。由于底物2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的溶解性偏低，加入表面活性劑有利于底物增溶，盡管所得產(chǎn)物的光學(xué)純度略有降低，但達(dá)到相近產(chǎn)率所需的反應(yīng)時(shí)間可由64h縮短至20h。本發(fā)明中所述的產(chǎn)物產(chǎn)率和產(chǎn)物e.e.值測(cè)定采用氣相色譜法。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取，定容后采用氣相色譜分析。本發(fā)明中所用手性色譜柱為CP-Chirasil-DexCB(25mX0.25mm;VarianCo"USA)。色譜條件為載氣為氮?dú)?；檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度為25(TC;柱溫為程序升溫8(TC保留3min，然后以8°C/min升溫至18(TC，保留3min;流速為2ml/min;分流比為15。底物和產(chǎn)物e.e.值計(jì)算方法為反應(yīng)后的底物e.e.值ee^|(SS-SR)/(SS+SR)|X100%。產(chǎn)物e.e.值eep二|(SSP-Srp)/(Ssp+Srp)|X100%。Ss為反應(yīng)后S型底物的峰面積；SR為反應(yīng)后R型底物的峰面積;Ssp為反應(yīng)后S-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的峰面積；SRP為反應(yīng)后R-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的峰面積。產(chǎn)率計(jì)算方法為內(nèi)標(biāo)法以十二烷為內(nèi)標(biāo)物，測(cè)得產(chǎn)物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定時(shí)在樣品中加入一定量的十二垸為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物濃度計(jì)算得出產(chǎn)物濃度。產(chǎn)率二np/ns。X100Q/^為S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸濃度，ns()為初始底物濃度。底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖見圖1。(四)圖1為底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖，S型產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸；.圖中S型底物，R型底物，S型產(chǎn)物，R型產(chǎn)物的保留時(shí)間分別約為3.69min、3.92min、9.42min禾卩9.77min。圖2為實(shí)施例1所得產(chǎn)物的氣相色譜圖。具體實(shí)施方式F面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此本發(fā)明所有的實(shí)施例都是指在10ml磷酸緩沖液體系中進(jìn)行的反應(yīng)。實(shí)施例1:(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的制備平行稱取三份150mgNovozym435脂肪酶置25ml錐形瓶中，分別加入10mlpH為7.0的磷酸緩沖液，然后各加入0.25mmol的底物2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯進(jìn)行不對(duì)稱水解反應(yīng)。反應(yīng)條件為搖床轉(zhuǎn)速200r/min，轉(zhuǎn)化溫度3(TC，轉(zhuǎn)化時(shí)間40h。反應(yīng)結(jié)束后，合并三份反應(yīng)液，取10ml反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，定容至20ml，以氣相色譜分析，如圖2所示。產(chǎn)率的計(jì)算采用內(nèi)標(biāo)法，產(chǎn)物e.e.值和產(chǎn)率分別為94.65%和38.36%。余下的反應(yīng)液按以下方法分離以濃度為2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至9.0，加入與反應(yīng)液等體積的乙酸乙酯萃取，棄乙酸乙酯層，取萃余液，然后用2mol/L的HC1溶液調(diào)節(jié)萃余液pH至2.0，加入與萃余液等體積的乙酸乙酯萃取兩次，取乙酸乙酯層，揮發(fā)除去乙酸乙酯得產(chǎn)物。實(shí)施例27:參照實(shí)施例1的方法，加入表1中所列不同濃度的底物，其他條件相同，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察底物濃度對(duì)不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表1中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，pH值為磷酸緩沖液的初始pH，表中的轉(zhuǎn)化時(shí)間即反應(yīng)時(shí)間，轉(zhuǎn)化溫度即反應(yīng)溫度。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表l:表l實(shí)施例234567底物濃度(mmol/L)4052657890105酶濃度(g/L)1515151515157.07.07.07.07.07.0轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)404040404040轉(zhuǎn)化溫度rc)303030303030產(chǎn)物e.e.值(X)97.4098.9799.1399.2899.2699.28產(chǎn)率(％)35.7034.0132.4930.2329.4327.76實(shí)施例814參照實(shí)施例1方法，在反應(yīng)體系中加入Novozym435脂肪酶的濃度不同，具體如表2中所列，其他條件相同，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察酶濃度對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表2中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，pH值為磷酸緩沖液的初始pH。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表2:表2實(shí)施例891011121314酶濃度(g/L)10131619222528底物濃度(mmol/L)65656565656565pH7.07.07.07.07.07.07.0轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)40404040404040轉(zhuǎn)化溫度rc)30303030303030產(chǎn)物e.e.值(。/。)95.8298.5399.1599.1899.0199.0398.92產(chǎn)率(％)28.5030.1333.1234.8735.9538.2441.76單位酶量產(chǎn)率(%/mg)0.28500.23180.2070.18350.16340.1530.1491實(shí)施例1521參照實(shí)施例1的方法，改變反應(yīng)體系中初始磷酸緩沖液的pH值，如表3所示，其他條件相同，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察緩沖液pH值對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表3中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，pH值為磷酸緩沖液的初始pH。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2226參照實(shí)施例1的方法，改變反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化溫度，其他條件相同，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察轉(zhuǎn)化溫度對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表4中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，pH值為磷酸緩沖液的初始pH。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表4:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例2733參照實(shí)施例1的方法，改變水解反應(yīng)的時(shí)間如表5所示，其他條件相同，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解的影響，表5中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，pH值為磷酸緩沖液的初始pH。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表5:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>轉(zhuǎn)化溫度(°c)30303030303030產(chǎn)物e.e.值(%)99.2499.2399.2299.1699.0894.7993.97產(chǎn)率(％)37.1540.9842.8345.5745.8046.7147.21實(shí)施例3439參照實(shí)施例1的方法，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，通過過濾法回收固定化酶，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后將其用于再次的不對(duì)稱水解反應(yīng)，其他反應(yīng)條件相同，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察固定化脂肪酶催化2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的重復(fù)利用情況，表6中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，pH值為磷酸緩沖液的初始pH。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表6:表6實(shí)施例343536373839酶重復(fù)使用次數(shù)12346酶濃度Cg/L)161616161616底物濃度(mmol/L)656565656565pH7.27.27.27.27.27.2轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)646464646464轉(zhuǎn)化溫度(°C)303030303030產(chǎn)物e.e.值(%)99.1698.9097.8496.8895.2191.94產(chǎn)率(％)45.3332.6831.8525.5916.1012.1015實(shí)施例40添加表面活性劑四丁基溴化銨以增加底物溶解性，提高酶催化不對(duì)稱水解2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的反應(yīng)速率。稱取100mg四丁基溴化銨溶于10mlpH7.2的磷酸緩沖液中，加入lOOmmol的底物2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯，酶加量為160mg，在25ml錐形瓶中進(jìn)行酶催化反應(yīng)。反應(yīng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，定容至20ml，進(jìn)行氣相色譜分析，產(chǎn)物e.e.值為96.25%,產(chǎn)率為42.32%。實(shí)施例4147參照實(shí)施例40的方法，改變表面活性劑種類，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，考察不同表面活性劑種類對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表7中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，磷酸緩沖液的初始pH均為7.2。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表7:.表7.實(shí)施例41424344454647表面活性劑種類CTABAOTSDS-20Tween陽60Tween-80乳化劑OP-10表面活性劑添加量(％wt)110.55底物濃度100100100100100100100酶濃度(g/L)16161616161616轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)24242424242424轉(zhuǎn)化溫度rc)30303030303030產(chǎn)物e.e.值(。/。)97.1198.6397.8393.84卯.3595.7997.52產(chǎn)率(％)39.4539.3529.3612.3230.2011.2340.14實(shí)施例4853參照實(shí)施例40的方法，在反應(yīng)體系中加入表面活性劑AOT的終濃度不同，考察AOT加量對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表8中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，磷酸緩沖液的初始pH均為7.2。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表8:表8實(shí)施例484950515253AOT添加量(％wt)11.522.53酶濃度(g/L)161616161616底物濃度(mmol/L)100100100100100100轉(zhuǎn)化溫度rc)303030303030轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)242424242424產(chǎn)物e.e.值(％)98.6398.6398.6699.0098.9498.61產(chǎn)率(％)39.3543.4245.4145.8245.3344.5617實(shí)施例5458參照實(shí)施例40的方法，在反應(yīng)體系中加入終濃度相同的表面活性劑AOT，改變加入的底物濃度，考察底物濃度對(duì)2，2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表9中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，磷酸緩沖液的初始pH均為7.2。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表9:表9實(shí)施例5455565758AOT加量(％wt)2.52.52.52.52.5底物濃度(mmol/L)6580100120140酶濃度(g/L)1616161616轉(zhuǎn)化溫度rc)3030303030轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)2424242424產(chǎn)物e.e.值(％)96.1796.7398.7798.9899.09產(chǎn)率(％)48.947.7945.9743.2539.50實(shí)施例5963參照實(shí)施例40的方法，改變生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的時(shí)間，考察轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解反應(yīng)的影響，表10中底物濃度為每1升磷酸緩沖液加入2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的毫摩爾數(shù)，酶濃度為每1升磷酸緩沖液加入Novozym435脂肪酶的克數(shù)，磷酸緩沖液的初始pH均為7.2。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取兩次后定容至20ml，采用氣相色譜分析，結(jié)果見表10:表10實(shí)施例5960616263AOT加量(。/。wt)2.52.52.52.52.5酶濃度(g/L)1616161616底物濃度(mmol/L)100100100100100轉(zhuǎn)化溫度rc)3030303030轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)1216202428產(chǎn)物e.e.值(％)98.9399.1298.7498.2796.61產(chǎn)率(％)35.0640.7845.1346,3747.16本發(fā)明為一種生物催化不對(duì)稱水解制備(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的方法，以脂肪酶Novozym435為生物催化劑，在1.0mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液中加入16g/L的脂肪酶Novozym435和65mmol/L的底物2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯，在30。C、200r/min下反應(yīng)64h，產(chǎn)物(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙垸甲酸的e.e.值為99.16%，產(chǎn)率達(dá)45.57%。當(dāng)在緩沖液中加入終濃度為2.5%wt的陰離子表面活性劑AOT時(shí)，可以提高底物2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯在磷酸鹽緩沖液中的溶解性，并提高脂肪酶Novozym435的催化反應(yīng)速率。當(dāng)脂肪酶Novozym435加量為16g/L，底物2,2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯濃度為100mmol/L時(shí)，30°C、200r/min條件下轉(zhuǎn)化20h，產(chǎn)物(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的e.e.值為98.74%，產(chǎn)率達(dá)45.13%。權(quán)利要求1.一種生物催化制備式(I)所示(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的新方法，所述方法以式(II)所示的2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯為底物，以Novozym435脂肪酶為生物催化劑，在水相反應(yīng)體系中于pH6.0～8.0、25～45℃下進(jìn)行生物催化不對(duì)稱水解反應(yīng)，反應(yīng)完全后，反應(yīng)液經(jīng)分離得到(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸產(chǎn)物，2.如權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的反應(yīng)是將2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯與Novozym435脂肪酶加入pH值為6.08.0的磷酸緩沖液中反應(yīng)，所述的2，2-二甲基環(huán)丙垸甲酸乙酯的添加量為25mmo1140mmol/L磷酸緩沖液，所述的Novozym435脂肪酶添加量為10g28g/L磷酸緩沖液。3.如權(quán)利要求1或2所述的新方法，其特征在于所述的反應(yīng)體系中還加入終濃度為l%5%wt的表面活性劑。4.如權(quán)利要求3所述的新方法，其特征在于所述的表面活性劑為下列之一四丁基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、吐溫一20、吐溫_60、吐溫一80、辛基苯酚聚氧乙烯醚。5.如權(quán)利要求4所述的新方法，其特征在于所述的優(yōu)選的表面活性劑為2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉。6.如權(quán)利要求3所述的新方法，其特征在于所述的反應(yīng)體系中加入2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉的終濃度為2.5%wt。7.如權(quán)利要求3所述的新方法，其特征在于所述的2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的添加量為100隱ol/L磷酸緩沖液，所述的Novozym435脂肪酶添加量為16g/L磷酸緩沖液，所述的磷酸緩沖液的摩爾濃度為1.Omol/L。8.如權(quán)利要求17所述的新方法，其特征在于所述的反應(yīng)時(shí)間為1288H。'9.如權(quán)利要求1所述的新方法，其特征在于所述的分離方法為調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至9.0，加入等體積的乙酸乙酯萃取，取萃余液，然后調(diào)節(jié)萃余液pH至2.0，加入與萃余液等體積的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，揮發(fā)除去乙酸乙酯后即得所述的(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。10.如權(quán)利要求9所述的新方法，其特征在于所述的分離方法在調(diào)節(jié)萃余液pH至2.0后，加入與萃余液等體積的乙酸乙酯萃取兩次，取乙酸乙酯層，揮發(fā)除去乙酸乙酯后即得所述的(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物催化制備(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的新方法，所述方法以2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯為底物，以Novozym435脂肪酶為生物催化劑，在水相反應(yīng)體系中于pH6.0～8.0、25～45℃下進(jìn)行生物催化不對(duì)稱水解反應(yīng)，反應(yīng)完全后，反應(yīng)液經(jīng)分離得到(S)-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。采用Novozym435脂肪酶催化2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的不對(duì)稱水解反應(yīng)，酶的專一性強(qiáng)，催化效率高，無副產(chǎn)物形成，且產(chǎn)物的光學(xué)純度和產(chǎn)率均較化學(xué)法高。文檔編號(hào)C12P7/40GK101597626SQ20091010030公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年7月2日優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日發(fā)明者何軍邀,普王,祝加男申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)