專利名稱：：用于檢測小rna的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及小RNA的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：小RNA是非編碼RNA家族(noncodingRNA，簡稱ncRNA)中的重要組成部分，包括微小RNA(microRNA或miRNA)、小型干擾RNA(siRNA)、小核RNA、小時序RNA,piwi蛋白結(jié)合RNA(piRNA)等。研究發(fā)現(xiàn)小RNA在生物體內(nèi)細胞、組織等的發(fā)育、生長、分化，甚至疾病的發(fā)生以及病毒的入侵和防御等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。小RNA發(fā)揮作用的方式也是多種多樣，它們既可以通過修飾DNA直接調(diào)控基因的表達，也可以通過改變基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性等來調(diào)節(jié)蛋白的量等等。而在各種類型的小RNA中，微小RNA又是功能最為重要的一種。微小RNA是生物體內(nèi)源的長度為18-25個核苷酸的一種非編碼RNA分子。它們廣泛地分布在不同的器官中，主要是通過與靶mRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導致mRNA的降解或翻譯抑制。在過去十年中，科學家們從海藻到動物體內(nèi)分離鑒定出了數(shù)千種保守的和非保守的miRNA。雖然很多證據(jù)清楚地表明miRNA在細胞增殖、分化、凋亡、賓育、腫瘤發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移以及病毒感染等等一系列生物學過程中充當很重要的角色，但是我們對miRNA生理學功能的了解還很少。另外，大量的研究發(fā)現(xiàn)miRNA是通過對它們的目標mRNA進行微調(diào)來實現(xiàn)其生理功能的，因而，對miRNA進行準確、定量的分析就成了理解miRNA生理學功能的迫切需要。然而，由于miRNA很短，而且一些miRNA成員之間具有非常相似的序列(例如let-7家族系列)，檢測miRNA是一項非常有挑戰(zhàn)性的工作?？茖W家們在這個領(lǐng)域進行了大量的研究工作，并開發(fā)出了一系列的miRNA檢測方法，如Northern印跡法(Lee，R.C.，F(xiàn)einbaun^R丄.andAmbros，V,1993.TheC.e/egansHeterochronicGenelin-4EntodesSmallRNAswithAntisenseComplementaritytoCe〃75:843—854.;Pfeffer,S"Sewer，A"Lagos-Quintana^M"Sheridan,R"Sander,C"Grasser，F(xiàn).A，裡Dyk，L"Ho,C"Shuman，S.，Chien;M"etal.2005.IdentificationofmicroRNAsoftheherpesvirusfamily.Mi/MreM決o必2:269-276.)、侵染檢狹!)(Allawi，H.T"Dahlberg，J.E.，Olson,S.，Lun山E.，Olson,M.andMa^W.P.2004.QuantitationofmicroRNAsusingamodifiedInvaderassay./JA^410:1153-1161.)、夾板連接(SplintedLigation)(Maroney,P.A.，Chamnongpol，S.,Souret，RandNilsen，T.W.2007.Arapid,quantitativeassayfordirectdetectionofmicroRNAsandothersmallRNAsusingsplintedligation.ifA^13:930-936.)、基于LNA探針的檢測方法(Weinholds,E.,Kloosterman,W.P.，Miska^E.，Alvarez-Saavedra^E.,Berezikov,E.，Bruijn，E.de，Horvitz，H.R.，Kauppinen，S.andPlasterk，R.H.A.200^.MicroRNAExpressioninZebrafishEmbryonicDevelopment.309:310-311.;Kloosterman,W.P"Weinholds，E"Bruijn，E.de，Kauppinen,S.andPlasterk,R.H.A.2006.InsitudetectionofmicroRNAsinanimalembryosusingLNAmodifiedoligonucleotideprobes.Ato.A/e//io&3:27-29.)與上述幾種方法相比，一些實時RT-PCR方法由于具有很高的靈敏度和特異性，正逐漸成為miRNA定量分析的主要方法(Chen，C.，Ridzon，D.A.,Broomer，A丄，ZhoAZ.，Lee，D.H.,Nguyen,J.T"Barbisin,M.，Xu，N.L.，Mahuvakar,V.R"Andersen,M.R.,etal.2005.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem-loopRT—PCR.JVwc/ei'cJc^IsWes.33:el79.;Shi,R.andChiang,V.L.2005.FacilemeansforquantifyingmicroRNAexpressionbyreal-timePCR.fecAw々w"39:519-525.;Raymond,C.K.，Roberts,B.S"Garrett-Engele,P"Lim^L.P.andJohnson,J.M.2005.Simple,quantitativeprimer-extensionPCRassayfordirectmonitoringofmicroRNAsandshort-interferingRNAs.11:1737-1744;Li，J.，Yao，B.，Huang，H.,Wang,Z.，S加，C.，F(xiàn)an，Y"Chang，Q.，Li，S,，Wang，X.,Xi,J..Real-timePCRmicroRNAdetectionbasedonenzymaticstem-loopprobesligation.爿"a/CAe附.DOI:ac900598d(inpress))。除RT-PCR技術(shù)以外，滾環(huán)擴增(RollingCircleAmplification,RCA)是一種在特定DNA聚合酶作用下，滾動復制較短的環(huán)狀單鏈DNA分子的新型等溫DNA擴增技術(shù)(Lizardi，P.M.，Huang,X.，ZhAZ"Braywaxd，P"Thomas,D.C.andWar*D.C.1998.Mutationdetectionandsingle-moleculecountingusingisothermalrollingcircleamplification.A/b加wgenerics19:225-232.;Zhang,D.Y.,Brandwein，M.，Hsuih，T.C.,Li，H.1998.Amplificationoftarget-specific,ligation-deppndentcircularprobe.211:277-285.)。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，RCA已被證明在目標DNA、mRNA甚至蛋白質(zhì)的一系列檢測中具有優(yōu)勢。Jonstrap等人基于鎖式探針(PadlockProbe)和滾環(huán)擴增(RollingCircleAmpl迅cation，RCA)技術(shù)，發(fā)展出了一套miRNA的檢測系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，目標miRNA分子同時充當鎖式探針環(huán)化的媒介和RCA的前體(Jonstrup，S.P"Koch,J.andKjems,J.2006.AmicroRNAdetectionsystembasedonpadlockprobesandrollingcircleamplification.iJAM12:1747—1752.)。最近，Cheng等人通過使用分支滾環(huán)擴增(branched-RCA)技術(shù)改善了這個方法的靈敏度。我們知道，通常中間位置的單個核苷酸錯配很容易被C-探針(C-probe)連接識別，但是端位的錯配則可能導致較差的鑒別。此外，同時分辨出一組高度相似的miRNA(如let-7系列)如僅通過連接酶本身的特異性來實現(xiàn)仍然是一項艱巨的任務。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種易于制備的小RNA檢測試劑盒，以及使用此試劑盒檢測小RNA的簡單、高度靈敏、高度精確且低成本的方法。在本發(fā)明中，術(shù)語"小RNA"指的是核苷酸數(shù)目較少的RNA，包括但不限于微小RNA(microRNA,簡稱miRNA)、小型干擾RNA(shortinterferingRNA，簡稱siRNA)、小核RNA(smallnuclearRNA，簡稱snRNA)、小時序RNA(smalltemporalRNA，簡稱stRNA)、piwi蛋白作用的RNA(Piwi-interactingRNA,簡稱piRNA)等。本發(fā)明的實施例中涉及的主要是miRNA，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預見到，本發(fā)明的檢測探針以及使用此探針檢測小RNA的方法并不限于miRNA，而應當理解為上面定義的"小RNA"。RT-PCR引物是指一種引物，其含有與目標小RNA中的序列互補的識別序列，除識別序列外，RT-PCR引物的其他部分序列并無特殊要求，其5'端被磷酸化以便在后續(xù)的連接步驟中形成一個環(huán)形的單鏈DNA。橋探針(本發(fā)明中亦稱C-探針、DM橋探針)是一種探針，其含有能與RT-引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即下文所稱"單鏈DNA")的5'端和3'端互補的識別序列，從而當橋探針與RT-引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交之后，RT-引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'端和3'端處在相鄰的位置，通過DNA連接酶的作用，RT-引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物便可首尾相接形成一個DNA圓環(huán)。RAM引物是分支擴增(RamificationAmplification,RAM)需要的引物，一共兩條(即本發(fā)明所稱的"第一引物"和"第二引物")。本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的。準備包含目標小RNA的體系，該體系可以是包含目標小RNA的任何體系，例如可以是分離提純的RNA樣本、總RNA樣本、細胞提取物、完整的細胞、組織提取物或體外轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物等。設計并合成RT-引物，該RT-引物具有一段識別序列，該識別序列可以與目標小RNA的一部分序列互補配對。優(yōu)選地，RT-引物的3'端的一段識別序列與目標小RNA5'端的一段序列互補配對。在這一步，不包含可與RT-引物互補配對的序列的核酸分子將不能與RT-引物雜交，從而被排除，不會再進入后續(xù)的檢測步驟中，而目標小RNA將與RT-引物互補配對，形成雜交產(chǎn)物，該雜交產(chǎn)物在DNA聚合酶的作用下，以目標小RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，合成出目標小RNA未配對核苷酸序列的互補鏈，從而得到RNA-DNA雜交鏈(參見圖1A)。至此，目標小RNA的核苷酸序列的信息已全部轉(zhuǎn)移至RT-引物上，用核糖核酸酶降解掉RNA-DM雜交鏈中的目標小RNA，從而得到單鏈DNA(該單鏈DM包括兩部分序列，一部分來自RT-引物，另一部分來自以目標小RNA為模板的反轉(zhuǎn)錄)。如果將該單鏈DNA首尾相接(即5'端與3'端相接)，將形成一個DNA圓環(huán)，設計并合成一個橋探針，該橋探針的部分或全部序列能與上述DNA環(huán)的包括連接點在內(nèi)的一部分序列互補。將該橋探針加入含有上述單鏈DNA的體系中后，橋探針將與單鏈DNA雜交，使單鏈DNA首尾相接形成一個圓環(huán)，得到開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物。之所以稱其為"開放式"橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物，是因為其中的單鏈DNA的5'端與3'端并未真正通過化學鍵連接起來，而僅僅是由于與橋探針雜交而處在比較靠近的位置。由于單鏈DNA的5'端與3'端彼此接近，在DNA連接酶的作用下，5'端與3'端便很容易形成新的磷酸二酯鍵從而形成一個閉合的環(huán)，我們將這個閉合的DNA環(huán)與橋探針形成的雜交產(chǎn)物稱為"封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物"(圖1A)。與橋探針雜交這一步將進一步排除掉非目標小RNA，這是因為某些同系列的小RNA序列很相似，例如小鼠的let-7a3'端的第2-5個核苷酸序列與let-7d3'端的1-4個核苷酸序列完全相同(表2和圖4B)，若RT-引物的識別序列從let-7a的3'端開始且核苷酸數(shù)為5個以下，則兩者都會與RT-引物雜交并都能進行隨后的反轉(zhuǎn)錄，但是在隨后的與橋探針雜交的步驟中，由于let-7d的5'端首個核苷酸便與let-7a的不相同(圖4B)，let-7d將不能與橋探針雜交形成開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物，從而let-7d在此步驟中將被排除出去(圖4A)。接下來對所獲得的封閉式橋探針-單鏈DM雜交產(chǎn)物進行實時定量分支擴增(RamificationAmplification)檢測，此過程需要DNA聚合酶以及兩個引物(分別稱為第一引物和第二引物)，優(yōu)選地，兩個引物中至少有一個引物(例如第一引物)的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中未配過對且源自目標小RNA的一部分或全部核苷酸序列互補，這樣可以進一步地排除掉經(jīng)過前兩次篩選剩余下來的非目標小RNA。舉例來說，let-7a與let-7f5'端和3'端的核苷酸序列都相同，僅僅是處于中間位置的一個核苷酸不相同(表2和圖4B)，若對let-7a進行上述檢測，則依然不能將let-7f與let-7a區(qū)分開來。let-7a中與let-7f相異的核苷酸處于let-7a的中間位置，在進行了上述兩個步驟之后處于環(huán)形單鏈DNA未配過對且源自芎標小RNA的核苷酸序列上，因此針對這一段核苷酸序列設計實時定量分支擴增所需要的第一引物(或第二引物)，則第一引物(或第二引物)只能與基于let-7a得到的封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物結(jié)合，從而只有當體系中存在let-7a的時候，才會出現(xiàn)分支擴增的熒光信號，因此分支擴增的引物更進一步地提高了本發(fā)明的小RNA檢測方法的特異性。如上所述，本發(fā)明的小RNA檢測方法通過RT-引物、橋探針和RAM引物(第一引物或窠二引物)三個步驟的篩選，使得本發(fā)明的小RNA檢測方法具有非常高的靈敏度，可以將僅有一個核苷酸不同的小RNA區(qū)分開來，并且可以將成熟RNA與它們對應的前體區(qū)分開來，運用本發(fā)明的小RNA檢測方法可以對少至103個(z印toraole)的小RNA進行定量檢測。本發(fā)明的小RNA檢測方法由于具有很高的靈敏度、很強的特異性和很寬的動態(tài)范圍，在醫(yī)學診斷分析、基準測試以及現(xiàn)場測試等很多領(lǐng)域有潛在的應用價值。7本發(fā)明技術(shù)方案總結(jié)如下-1.一種用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將包含目標小RNA的體系與RT-引物接觸，所述RT-引物包含能與目標小RNA的至少一部分序列互補的識別序列，從而所述識別序列與目標小RNA的至少一部分序列互補配對；(2)在第一DNA聚合酶的作用下，以目標小RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，合成出目標小RNA未配對核苷酸序列的互補鏈，從而得到RNA-DNA雜交鏈；(3)用核糖核酸酶降解掉步驟2得到的RNA-DNA雜交鏈中的目標RNA，從而得到單鏈DNA;(4)將步驟3得到的單鏈DNA與橋探針接觸，所述單鏈DNA首尾相接之后，包括連接點在內(nèi)的一部分序列能與所述橋探針的至少一部分序列互補，從而得到開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物；(5)在DNA連接酶的作用下，步驟4得到的開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中的缺口封閉，從而得到封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物；(6)在第二DNA聚合酶以及第一引物和第二引物的作甩下，對步驟5得到的封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物進行實時定量分支擴增。2.根據(jù)第1項所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中未配過對的至少一部分核苷酸序列互補。3.根據(jù)第2項所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中源自目標小RNA的至少一部分核苷酸序列互補。4.根據(jù)第1-3項的任意一項所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于所述RT-引物的識別序列能與目標小RNA3'端的至少一部分序列互補。5.根據(jù)第1項或第4項所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于所述包含目標小RNA的體系選自分離提純的RNA樣本、總RNA樣本、細胞提取物、完整的細胞、組織提取物或體外轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物。6.—種用于檢測已知序列的小RNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括RT-引物、第一DNA聚合酶、核糖核酸酶、橋探針、DNA連接酶、第二DNA聚合酶、用于分支擴增的第一引物和第二引物和該試劑盒的使用說明書；所述RT-引物包含能與目標小RNA的至少一部分序列互補的識別序列，第一DM聚合酶用于目標小RNA的反轉(zhuǎn)錄，核糖核酸酶用于降解RNA-DNA雜交鏈中的目標RNA以獲得單鏈DNA，單鏈DNA首尾相接之后，包括連接點在內(nèi)的一部分序列能與橋探針的至少一部分序列互補，從而能得到開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物，DNA連接酶用于將開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物的缺口封閉，從而能得到封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物，第二DM聚合酶以及第一引物和第二引物可以對封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物進行分支擴增。7.根據(jù)第6項的用于檢測已知序列的小RNA的試劑盒，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中未配對的至少一部分核苷酸序列互補。8.根據(jù)第7項的用于檢測已知序列的小RNA的試劑盒，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中源自目標小RNA的至少一部分核苷酸序列互補。圖l本發(fā)明的小RNA檢測方法示意圖(A)以及檢測let-7a時的靈敏度和動態(tài)范圍(B)圖2使用本發(fā)明的小RNA檢測方法檢測mir-l時的靈敏度和動態(tài)范圍圖3使用本發(fā)明的小RNA檢測方法檢測mir-122時的靈敏度和動態(tài)范圍圖4本發(fā)明的小RNA檢測方法具有高特異性的原理示意圖(A)以及檢測let-7系列miRNA結(jié)果圖(B)圖5本發(fā)明的小RNA檢測方法對總RNA樣本的抗干擾試驗結(jié)果圖圖6本發(fā)明的小RNA檢測方法直接用于總RNA樣本檢測時的動態(tài)范圍圖圖7本發(fā)明的小RNA檢測方法檢測老鼠12種不同組織中mir-122、mir-l、mir-150和mir-143結(jié)果圖(ht:心臟；W:肝臟；SP:脾臟；In:肺；kd:腎；thy:胸腺；CO:結(jié)腸；OV:卵巢；tS:睪丸；br:腦；pan:胰臟；SHI:骨骼肌肉)。同時與商業(yè)化產(chǎn)品NcodeRT-PCR方法做了比較分析。圖8本發(fā)明的小RNA檢測方法檢測老鼠12種不同組織中l(wèi)et-7a結(jié)果圖。同時與商業(yè)化產(chǎn)品NcodeRT-PCR方法做了比較分析。圖9本發(fā)明中的小RNA檢測方法以及傳統(tǒng)的RT-PCR對老鼠體內(nèi)12種組織細胞中的U6表達水平檢測結(jié)果圖。同時就snoRNA135和mir-191的檢測，本發(fā)明中的小RNA檢測方法與商業(yè)化產(chǎn)品NCodeRT-PCR方法做了比較分析。具體實施例方式以下將通過具體的實施例說明本發(fā)明，但是這些具體的實施例不應當理解為對本發(fā)明的限制，對某些細節(jié)進行修改將仍然落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。材料和方法1.成熟miRNA、miRNA前體、探針和引物。let-7系列、mir-122、mir-l、mir-143、mir-150和mir-191等成熟miRNA及其前體的核苷酸序列選自SangerCentermiRbasefhttD:〃microma.sanger.ac.uk/seauences)，而snoRNA135和U6的序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gow戚得。成熟合成miRNA從上海吉瑪公司(ShanghaiGenePharma)購得，所有的miRNA前體通過體外轉(zhuǎn)錄方法制備(見表l)。所有的DNA探針和引物均購自Invitrogen公司(中國上海)。寡核苷酸用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，其核苷酸序列列于表2和表3。核酸的濃度通過NanoDrop分光光度計(ND-IOO,ThermoFisher,MA，USA)在260納米處的吸收讀數(shù)測定。2.組織制備和總RNA提取。參照廠家提供訥說明書，使用TRNzol試劑(Ca估DP405-02，Tiangen,中國，北京)對8周大的小鼠的心臟、腸、肝、脾、肺、腎、胸腺、結(jié)腸癌、卵巢、睪丸、腦、胰腺和骨骼肌等切碎的器官進行提取，以獲取總RNA樣本。簡單地說，將50到100毫克組織樣本充分分散到1mLTRNzol試劑中；然后，每1mLTRNzol試劑中加入0.2mL氯仿，將樣品充分混合15秒并在室溫下培養(yǎng)2-3分鐘；樣品在4'C、12，000xg下離心分離15分鐘，在不擾動底層物質(zhì)的情況下，小心地將上層溶液轉(zhuǎn)移到一個新試管中；加入同體積的異丙醇并混合均勻；樣品在15-30'C孵育20分鐘并在4'C、12,000xg下離心分離IO分鐘；離心分離后，將上清液移除干凈，RNA沉淀物用75y。的乙醇洗滌兩次。最后，將RNA沉淀物風干并用去核酸水(nuclease-freewater)溶解。所有的動物程序都參照"實驗動物管理和使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee,IACUC)"和"經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)"的規(guī)定執(zhí)行。3.dsDNA模板的制備。.50pmol的DNA寡聚物在75'C孵育5分鐘難行退火，然后緩慢冷卻到室溫(約30分鐘)。制備dsDNA模板的反應是在含有10mM三羥甲基氮基甲烷鹽酸鹽(TrisHCl)、50mMNaCl、10mMMgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、25MMdNTPs和5UKlenowFragment(3，-5，exo)(NewEnglandBioLabs,EastwinScientific,中國)的20卞L體積中，在37'C保持一小時進行的。然后，反應混合物加熱到75t:保持20分鐘使酶失活，并緩慢冷卻至室溫以使dsDNA退火。4.體外轉(zhuǎn)錄反應。20nL上述dsDNA模板混合物加入到30jiL含有0.5mMNTPs、40mMTris-HCl、6mMMgCl2、10mMDTT、2mM亞精胺、40-200U核糖核酸酶抑制劑(RibonucleaseInhibitor(TAKARA，中國，大連))和50UT7RNA聚合酶(NewEnglandBioLabs，EastwinScientific,中國)的體外轉(zhuǎn)錄緩沖劑中，反應在37"C進行4小時。在這之后，加入1U不含核糖核酸酶(RNase-free)的DNaseI(Fermentas，中國，深圳)以消化DNA模板。最后使用苯酚/氯仿對多余的鹽和蛋白質(zhì)進行萃取處理以純化轉(zhuǎn)錄反應混合物中的miRNA前體。轉(zhuǎn)錄完成的miRNA前體用2%瓊脂糖凝膠進行檢測，濃度通過使用NanoDrop分光光度計測定260nm處的吸收來確定。5.磷酸化和反轉(zhuǎn)錄反應。在miRNA反轉(zhuǎn)錄之前，RT-引物的5'端需要進行磷酸化修飾。將0.5nmolRT-引物加熱到75'C并保持5分鐘，然后在用激酶處理前在冰上冷凍。50jtL的反應體積含有50mMTris-HCl(pH8.0)、10mMMgCl2、5mMDTT、1mMATP、20UT4多聚核苷酸激酶(TAKARA，中國，大連)和DNA探針，將此反應體系在37"C放置2小時。最后在65'C孵育20分鐘使T4多聚核苷酸激酶失活。從miRNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄酶反應是在10的反應體積中進行的，這個反應體系含有1nL總RNA樣本、50nM5，-磷酸化RT-弓I物、20UPrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶(TAKARA,中國，大連)、50nMdNTPs和lx反應緩沖液(pH8.3，50mMTris-HCl，75mMKC1和3mMMgCl2)，將該體系在4rC下保持30分鐘。然后加入2.5U核糖核酸酶H(Fermentas，中國，深圳)并在37'C處理20分鐘以降解RNA-DNA雜交鏈中的miRNA。6.C-探針的連接。將10反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與1nL橋探針(10pM)形成的混合物在95'C加熱2分鐘，然后緩慢冷卻至室溫以形成開放式的C-探針雜交產(chǎn)物。準備包含20mMTris-HCl(pH7.6)、25mMKAc、10mMMg(Ac)2、10mMDTT、1mMNAD和0.1%的TritonX-100的、總體積為20nL的反應緩沖溶液一份，往其中加入10U嗜熱T叫DNA連接酶(NewEnglandBioLabs，EastwinScientific,中國)和上面得到的開放式C-探針雜交產(chǎn)物并在55'C反應45分鐘以使C-探針中的缺口封閉。7.實時RAM檢測。等溫擴增反應體積為25^iL，其中包括1fiL連接產(chǎn)物混合物、弓l物1和引物2各1.2^M、100dNTPs、20mMTris-HCl(pH8.8〉、10mMKC1、10mM(NH4)2S04、2mMMgS04、0.1%TritonX-IOO、6%二甲基亞砜、6pL1xSYBRGreenl染料(Bio-Vision，中國)和6.4UDNA大片段(largefiagment)聚合酶(NewEnglandBioLabs，EastwinScientific,中國)。反應體系在％-well盤中、65'C下孵育，并用Opticon2DNAEngine(Bio-RadLaboratories,CA，USA)每25秒一個周期實時監(jiān)測100個循環(huán)。所有反應都進行3次。臨界循環(huán)數(shù)CT定義為熒光強度超過設定的臨界值的時候?qū)姆謹?shù)循環(huán)數(shù)。8.NcodeRT-PCR和傳統(tǒng)的實時PCR檢測。為使用實時PCR方法量化miRNA的表達水平'采用了NCodeVILOmiRNAcDNA合成試劑盒(Invitrogen^MaoJianUnitedStarsTechnology,中國)合成了cDNA。簡單地說，在一個反應中，總RNA樣本中的所有miRNA或者snoRNA135使用polyA聚合酶、ATP、SuperscriptIIIRT和一個特別設計的普適RT-引物進行多聚腺苷酸化并且反轉(zhuǎn)錄。采用SYBRGreenERTMqPCRMix(Invitrogen^MaoJianUnitedStarsTechnology,中國)對由上述反應得到的cDNA進行實時PCR擴增；普適RT-弓I物由VILO試劑盒提供，正義引物參照NCodemiRNA數(shù)據(jù)庫(http:〃escience.invitrogen.com/ncode)設計。定量實時PCR的溫度循環(huán)條件為50°C2分鐘，95°C2分鐘，95。C下15秒、60'C下50秒進行40個循環(huán)。小核RNAU6采用傳統(tǒng)的實時PCR方法進行定量。總RNA采用隨機的引物進行反轉(zhuǎn)錄。包括總RNA樣本、25nM隨機引物、100UPrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶(TAKARA,中國，大連)、0.25mMdNTPs和1x反應緩沖溶液(pH8.3，50mMTris-HCl，75mMKC1，3mMMgCl2)的20pL反應體積在42'C下孵育60分鐘。cDNA采用SYBRGreenERqPCRMix進行實時PCR擴增，循環(huán)參數(shù)與miRNA的過程相同。9.數(shù)據(jù)處理方法。一個10倍稀釋系列的合成miRNA被用作如下曲線的標準模板橫軸為不同稀釋程度下miRNA的常用對數(shù)值，縱軸為對應的CT值。線性回歸曲線或者標準曲線通過如下方程構(gòu)建^^ax+6或CT二fl(log^/a"rioO+6。由此，同一個檢測下的未知樣品濃度就可以參照標準曲線確定。實施例1let-7a的檢領(lǐng)j。let-7a的核苷酸序列見表2，其探測過程中使用的RT-引物、橋探針以及分支擴增中的引物l、引物2的核苷酸序列見表3。檢測結(jié)果示于圖1B。由圖1B可以看出，分支擴增曲線的橫軸(初始miRNA數(shù)目的常用對數(shù)值)與縱軸CT值之間呈現(xiàn)出完美的線性關(guān)系(R2=0.997)。由圖可知，本發(fā)明的檢測方法可以檢測到少至103個(zeptomole)let-7a分子，并且其對每個反轉(zhuǎn)錄反應具有至少7個數(shù)量級的動態(tài)范圍。實施例2mir-t的檢測。mir-l的核苷酸序列見表2，其探測過程中使用的RT-引物、橋探針以及分支擴增中的引物l、引物2的核苷酸序列見表3。檢測結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出，分支擴增曲線的橫軸(初始miRNA數(shù)目的常用對數(shù)值)與縱軸Or值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(R2=0.992)。由圖可知，本發(fā)明的檢測方法可以檢測到少至1(^個mir-l分子，并且其對每個反轉(zhuǎn)錄反應具有至少6個數(shù)量級的動態(tài)范圍。實施例Smir-122的檢測。mir-122的核苷酸序列見表2，其探測過程中使用的RT-引物、橋探針以及分支擴增中的引物l、引物2的核苷酸序列見表3d檢測結(jié)果示于圖3。由圖3可以看出，12分支擴增曲線的橫軸(初始miRNA數(shù)目的常用對數(shù)值)與縱軸Or值之間呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系(R2=0.994)。由圖可知，本發(fā)明的檢測方法可以檢測到少至104個mir-122分子，并且其對每個反轉(zhuǎn)錄反應具有至少6個數(shù)量級的動態(tài)范圍。實施例4let-7系列miRNA的檢測。小鼠let-7系列包括let-7a~7g以及l(fā)et-7i—共8個miRNA，它們的核苷酸序列非常接近(參見圖4及表2)，圖4B中用著重號示出了let-7b~g以及l(fā)et-7i核苷酸序列中與let-7a不相同的部分，由圖AB可知，某些miRNA如let-7c、let-7e等只有一個位置的堿基與let-7a不同，因而要將這S個miRNA彼此檢測區(qū)分開來，難度非常大。我們?yōu)閘et-7系列的每一個miRNA設計了各自的RT-引物、橋探針以及分支擴增中的引物1、弓l物2，其核苷酸序列見表3。檢測結(jié)果列于圖4C。由圖4C的檢測結(jié)果來看，本發(fā)明小RNA檢測方法的特異性非常好。圖4C中的數(shù)值是這樣計算得到的以第一行為例，用let-7a的試劑盒檢測let-7ag以及l(fā)et-7i，得到各自Cp值，將每組所測對象(Ct僮最低)的相對表達量設定為100%，其余各miRNA的相對表達量由標準曲線計算得到。由圖4C可知，除用let-7e的試劑盒檢測let-7a以及用let-7e的試劑盒檢測let-7f之外，其他情況下的非特異性信號都小于0.1%。三個相互配合的步驟保證了本發(fā)明小RNA檢測方法的特異性(圖4A)。簡單來說，RT-引物可以區(qū)分小RNA3'端的錯配，而隨后的在C-探針(即橋探針)介導下的反轉(zhuǎn)錄cDNA的連接反應可以區(qū)分小RNA5，端的錯配，而分支擴增中的引物l、引物2(主要是引物1)可以進一步區(qū)分小RNA中間段的錯配6因此，合理的設計RT-引物、橋探針以及分支擴增中的引物l、弓l物2和核苷酸序列，使用本發(fā)明的方法便可以檢測出小RNA序列中單個位點的變異。實施例5本發(fā)明的小RNA檢測方法對miRNA前體的抗干擾能力。miRNA前體是包含整個成熟miRNA序列的穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA分子，它的存在可能會對成熟miRNA的檢測造成干擾。我們測試了let-7a、mir-122和mir-l的前體對它們相應的成熟miRNA檢測的干擾，結(jié)果列于表4中。從表4的結(jié)果可以看出，即使miRNA前體的濃度是對應的成熟miRNA的IOO倍，miRNA前體對檢測信號的貢獻都不會超過背景噪音的大小。因此，本發(fā)明的小RNA檢測方法對miRNA前體的抗干擾能力比TaqManmiRNA檢測方法(Chen^C.，RidzoAD.A.，Broomer，A丄，Zhou，Z"Lee，D'H.，Nguyen，tT"Barbisin,M.,XaN.L"Mahuvakar，V.R"AndersenjM.R.,etal.2005.Real-timequantificationofmicroRNAsbystem~loopRT—PCR.Nuc/ei'c爿cid[s33:el79)強。實施例6本發(fā)明的小RNA檢測方法的抗干擾能力。在實際檢測工作中，小RNA檢測方法要面對來自其他非目標小RNA分子的干擾。如果小RNA檢測方法對生物體內(nèi)各種組織中的總RNA樣本的抗干擾能力很強，則可直接將此方法對總RNA樣本進行檢測，而不用事先對總RNA樣本分離提純。由于mir-122被認為在肝臟中表達含量非常高而在其他組織中表達含量很低，我們研究了非肝臟組織總RNA樣本對mir-122檢測的干擾，結(jié)果示于圖5。圖5A是不同數(shù)量(108、106、104個拷貝)的mir-122在不同量(0、50、100、200ng)的腦組織總RNA樣本干擾下的檢測結(jié)果，而圖5B則是不同數(shù)量(108、106、104個拷貝)的mir-122在100ng來自不同組織(腎、睪丸、腦、心臟和卵巢)的總RNA樣本干擾下的檢測結(jié)果。由上述結(jié)果可知，本發(fā)明的小RNA檢測方法對不多于200ng的總RNA樣本具有很強的抗干擾能力。由此可見，可將本發(fā)明的小RNA檢測方法直接用于總KNA樣本的檢測。實施例7本發(fā)明的小RNA檢測方法直接用于總RNA樣本檢測時的動態(tài)范圍。本實施例檢測了老鼠肺部組織總RNA樣本中的let-7a、心臟組織總RNA樣本中的mir-l、肝臟中的mir-122、脾臟中的mir-150以及卵巢中的mir-143，結(jié)果示于圖6。從圖6可見，被檢測的總RNA樣本的量從0.05ng到500ng—共變化了4個數(shù)量級，而CT值與總RNA樣本的量在此范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R、0.990)。由此可知，本發(fā)明的小RNA檢測方法用于總RNA樣本檢測時也具有很寬的動態(tài)范圍。實施例8采用本發(fā)明的小RNA檢測方法檢測不同組織中的miRNA。本實施例檢測了老鼠12種不同組織中mir-122、mir-l、mir-150、mir-143(示于圖7)以及l(fā)et-7a(示于圖8)的表達水平。同時用傳^的NcodeRT-PCR方法進行了對比檢測。假設每個細胞中含有15pg的總RNA樣本，通過本發(fā)明的檢測方法發(fā)現(xiàn)mk-122主要表達在肝臟中(每個細胞約30000個拷貝)，mir-l主要表達在心臟(每個細胞約l卯OOO個拷貝)和骨骼肌中(每個細胞約500000個拷貝)，mir-150主要表達在脾臟中(每個細胞約22000個拷貝)。相反，mir-143和let-7a則沒有很大的組織依耐性，它們廣泛地表達在各種組織細胞中，數(shù)量從50到3000個拷貝不等。采用傳統(tǒng)的NcodeRT-PCR方法也得出了相似的結(jié)果。實施例9本發(fā)明miRNA檢測方法與傳統(tǒng)RT-PCR(熒光定量聚合酶反應)在檢測內(nèi)參RNA的比較。在實時熒光定量聚合酶鏈式反應中，將不同樣本邁iRNA相對于內(nèi)參進行歸一化對于miRNA的定量測定非常關(guān)鍵。小核RNA(snRNA)U6經(jīng)常被用來作為傳統(tǒng)miRNA或其他RNA檢測的內(nèi)參，我們用本發(fā)明中的小RNA檢測方法以及傳統(tǒng)的R-TPCR對老鼠體內(nèi)12種組織細胞中的U6表達水平進行了檢測，結(jié)果示于圖9。從圖9可以看出，本發(fā)明的小RNA檢測方法檢測U6結(jié)果與傳統(tǒng)的R-TPCR非常接近。最近有研究發(fā)現(xiàn)，snoRNA135和miRNA-191等小RNA作為miRNAqRT-PCR檢測的內(nèi)參比U6更穩(wěn)定，我們同樣用本發(fā)明的小RNA檢測方法以及傳統(tǒng)的NcodeRT-PCR對老鼠體內(nèi)12種組織細胞中的sttoRNA135和miRNA-191的表達水平進行了檢測，結(jié)果見圖9，兩種方法得出的結(jié)果同樣地非常相似。這表明本發(fā)明的小RNA檢測方法可以用來定量檢測不同組織細胞中的小RNA。附表表l'User-designedoligomersfordsDNAtemplatespreparation<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2.本發(fā)明中使用的miRNA，snoRNA135和U6snRNA的核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>m咖-mir-150UCUCCCAACCCUUGUACCAGUGmmu-mir-191CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUGsnoRNA135CUAAAAUAGCUGGAAUUACCGGCAGAUUGGUAGUGGUGAGCCUAUGGUUUUCUGAAGU6snKNAGUGCUCGCUUCGGCAGCACAUAUACUAAAAUUGGAACGAUACAGAGAAGAUUAGCAUGGCCCCUGCGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAAGCGUUCCAUAUUUU表3.miRNA，snoRNA135，U6snRNA的RT-引物、DNA橋探針、RAM引物序列m顯AIDPrimers序列l(wèi)et-7aRT-primerCTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTTTACACTArAGGGCTCAGTGAACTATBridgeprobeCTCTCAGACAATCAGTGAGGTAGTAGGAACPrimer1GTAAAGCTGAGACATGACGPrimer2GGCTCAGTGAACTATACAAClet-7bRT-primerCTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTTTACACTATAGGGCTCAGTGAACCACBridgeprobeCTCTCAGACAATCAGTGAGGTAGTAGGAACPrimer1GTAAAGCTGAGACATGACGPrimer2GGCTCAGTGAACCACACAAlet-7cRT-primerCTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTTTACACTATAGGGCTCAGTGAACCATBridgeprobeCTCTCAGACAATCAGTGAGGTAGTAGGAACPrimer1GTAAAGCTGAGACATGACGPrimer2GGCTCAGTGAACCATACAACleK7dRT-primerCTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCAGCnTACACTTAAGGGCTCAGTGACTATGCTGATTGTCTGACTCGTC^VrGTCTCAGCTrTACACTTAAGGGCTCAGTGACTATGBridgeprobeCTCTCAGACAATCAGAGAGGTAGTAGGAACPrimer1GTAAAGCTGAGACATGACGPrimer2GGCTCAGTGACTATGCAAClet-7eRT-primerCTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTTTACACTTAAGGGCTCAGTGACTATABridgeprobeCTCTCAGACAATCAGTGAGGTAGGAGGAACPrimer1TAAGTGTAAAGCTGAGACPrimer2CAGTGACTATACAACCTClet-7fRT-prhnerCTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTTTACACTATAGGGCTCAGTGAACTATBridgeprobeCTCTCAGACAATCAGTGAGGTAGTAGGAACPrimer1GTAAAGCTGAGACATGACGPrimer2GGCTCAGTGAACTATACAATlet-7gRT-primerCTGATTGTCTGACTCTCATGTCTCAGCTTTACACTATAGGGCTCAGTGACTGTABridgeprobeCTCTCAGAACAATCAGTGAGGTAGTAGAAPrimer1GTAAAGCTGAGACATGAGPrimer2GGCTCAGTGACTGTACAAlet-7iRT-pri加erGTGATTGTCTGACTCGTCATGTCTCACCTTTACACTTAAGGGCTCAGTGAACAGCBridgeprobeCTGGAGTCAGACAATCACTGAGGTAGTAGAA16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ND(NoDetection,無信號)CT>80;mir-122:miRNA122;mir-l:miRNA-l.mir-122mir-l14.5938.3636.6633.2614.7114.7315.1525.26NDNDND25.8226.6627.431X10'0001X10'1X1011X10'oSO92O092009S89SoooooooooooooooooooXXX權(quán)利要求1.一種用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將包含目標小RNA的體系與RT-引物接觸，所述RT-引物包含能與目標小RNA的至少一部分序列互補的識別序列，從而所述識別序列與目標小RNA的至少一部分序列互補配對；(2)在第一DNA聚合酶的作用下，以目標小RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，合成出目標小RNA未配對核苷酸序列的互補鏈，從而得到RNA-DNA雜交鏈；(3)用核糖核酸酶降解掉步驟2得到的RNA-DNA雜交鏈中的目標RNA，從而得到單鏈DNA；(4)將步驟3得到的單鏈DNA與橋探針接觸，所述單鏈DNA首尾相接之后，包括連接點在內(nèi)的一部分序列能與所述橋探針的至少一部分序列互補，從而得到開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物；(5)在DNA連接酶的作用下，步驟4得到的開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中的缺口封閉，從而得到封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物；(6)在第二DNA聚合酶以及第一引物和第二引物的作用下，對步驟5得到的封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物進行實時定量分支擴增。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中未配過對的至少一部分核苷酸序列互補。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中源自目標小RNA的至少一部分核苷酸序列互補。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任意一項所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于所述RT-引物的識別序列能與目標小RNA3'端的至少一部分序列互補。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的用于檢測已知序列的小RNA的方法，其特征在于所述包含目標小RNA的體系選自分離提純的RNA樣本、總RNA樣本、細胞提取物、完整的細胞、組織提取物或體外轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物。6.—種用于檢測已知序列的小RNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括RT-引物、第一DNA聚合酶、核糖核酸酶、橋探針、DNA連接酶、第二DNA聚合酶、用于分支擴增的第一引物和第二引物和該試劑盒的使用說明書；所述RT-引物包含能與目標小RNA的至少一部分序列互補的識別序列，第一DNA聚合酶用于目標小RNA的反轉(zhuǎn)錄，核糖核酸酶用于降解RNA-DNA雜交鏈中的目標RNA以獲得單鏈DNA，單鏈DNA首尾相接之后，包括連接點在內(nèi)的一部分序列能與橋探針的至少一部分序列互補，從而能得到開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物，DNA連接酶用于將開放式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物的缺口封閉，從而能得到封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物，第二DM聚合酶以及第一引物和第二引物可以對封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物進行分支擴增。7.根據(jù)權(quán)利要求6的用于檢測己知序列的小RNA的試劑盒，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中未配對的至少一部分核苷酸序列互補。8.根據(jù)權(quán)利要求7的用于檢測己知序列的小RNA的試劑盒，其特征在于第一引物和/或第二引物的序列與封閉式橋探針-單鏈DNA雜交產(chǎn)物中源自目標小RNA的至少一部分核苷酸序列互補。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于檢測小RNA的方法及試劑盒，屬于小RNA的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的用于檢測小RNA方法主要包括以下幾個步驟1.RT-引物與目標小RNA雜交；2.反轉(zhuǎn)錄；3.在橋探針的介導下，反轉(zhuǎn)錄得到的DNA鏈首尾相接形成一個圓環(huán)；4.在DNA聚合酶和第一引物、第二引物的作用下進行分支擴增實時定量檢測。本發(fā)明的檢測小RNA的方法具有靈敏度非常高、動態(tài)范圍大、抗干擾能力強等優(yōu)點，在與小RNA探測相關(guān)的科學實驗、臨床診斷、現(xiàn)場測試、基準測試等多個領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。文檔編號C12Q1/68GK101633957SQ20091010027公開日2010年1月27日申請日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者波姚,席建忠,娟李申請人:北大工學院紹興技術(shù)研究院