專利名稱：：一種微生物轉(zhuǎn)化制備(s)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重要的手性藥物中間體(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的生物轉(zhuǎn)化制備方法，屬于生物催化
技術(shù)領(lǐng)域：
。(二)
背景技術(shù)：
：(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇是一種重要的手性藥物中間體，可用于合成NK-1受體拮抗劑，該藥物可有效地治療抑郁及其他精神疾病，在治療一系列中樞和末梢神經(jīng)系統(tǒng)抑制中具有纟艮好的潛在療效。目前所知的制備方法主要有三條路徑(1)化學(xué)法。主要是以稀有金屬(銠、釕等)為催化劑合成(8)-1-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇，反應(yīng)收率和ee值均較高，但稀有金屬催化劑的價(jià)格昂貴，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。(2)酶轉(zhuǎn)化法。采用提取純化后的酶(如羰基還原酶)進(jìn)行1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的不對稱還原，優(yōu)點(diǎn)是立體選擇性好，副產(chǎn)物少。但反應(yīng)過程中需要解決輔酶再生問題，外加輔酶的價(jià)格昂貴。如David等采用來自紅平紅球菌i/7wfococcMSeo^rapofe的醇脫氫酶酶法合成(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇，對映體過量值>99.9%,轉(zhuǎn)化率〉98%。但在需要輔因子NADH的醇脫氬酶酶催化還原過程中還需要加入曱酸脫氬酶(formatedehydrogenase,FDH)以實(shí)現(xiàn)輔因子的原位再生，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。(3)微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法。即采用完整的微生物細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行l(wèi)-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的不對稱還原。微生物細(xì)胞含有完整的酶系，該方法不需要對胞內(nèi)酶進(jìn)行提純，催化反應(yīng)中也不需額外添加昂貴的輔酶，因而減少了工序并降低了成本。但現(xiàn)有已知可用于生物不對稱還原制備(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇的菌種(如紅酵母等)，對映體過量值不超過88.5%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了提供一種高光學(xué)純度,工藝簡單和易于工業(yè)化生產(chǎn)的(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的生物制備方法。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括在以l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮為底物、以熱帶假絲酵母(Qm^/a104的發(fā)酵產(chǎn)物為酶源的反應(yīng)體系中，于2834°C下進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(S)-l-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇；所述熱帶假絲酵母(Ow^/"/rap/c"to)104保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209034,保藏日期2009年2月27日；所述發(fā)酵產(chǎn)物為熱帶假絲酵母104經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液或濕菌體；可將濕菌體加入含有l(wèi)-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮底物的緩沖溶液中作為反應(yīng)體系，或直接按需要量將底物加入熱帶假絲酵母104發(fā)酵液中作為反應(yīng)體系。所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為10~90mmol/L，發(fā)酵產(chǎn)物加入量以其所含菌體的濕重計(jì)為50-400g/L。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱重。所述反應(yīng)體系中還添加有終濃度為10~100g/L的麥芽糖作為輔助底物，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系的溶劑為0.1M,pH8.0的磷酸緩沖液，將底物和濕菌體加入緩沖液中，作為反應(yīng)體系。所述不對稱還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為28~34°C,反應(yīng)時間為16~40小時。在此條件下所得的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行手性氣相色譜(GC)分析測定表明，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的主要組分為(S)-1-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇。所述發(fā)酵產(chǎn)物由如下方法制備得到熱帶假絲酵母104接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度2834。C下培養(yǎng)16~30小時后，得發(fā)酵液，或者將發(fā)酵液過濾得到濕菌體。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為常規(guī)適用于熱帶假絲酵母的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖4060g/L,酵母粉10~15g/L，氯化銨25g/L,磷酸二氬鉀0.52g/L，磷酸氯二鉀0.52g/L，硫酸鎂0.1lg/L,溶劑為水，pH值68.5。所述產(chǎn)物分離純化方法如下轉(zhuǎn)化液離心，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述(S)-l-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。具體的，所述方法如下(1)斜面培養(yǎng)取常規(guī)適用于熱帶假絲酵母的斜面培養(yǎng)基，接種Cam&^frap/cato104菌林(CCTCCNo:M209034),30。C斜面培養(yǎng)35天，作為斜面種子；(2)種子培養(yǎng)取常規(guī)適用于熱帶假絲酵母的種子培養(yǎng)基，接入斜面種子，28~34°C，搖床轉(zhuǎn)速100-250r/min，培養(yǎng)10~30小時，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子液以5~10%體積比接種量，接種至常規(guī)適用于熱帶假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基，2834°C，搖床轉(zhuǎn)速100-250r/min，培養(yǎng)1630小時，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液離心，收集濕菌體，用0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物質(zhì)量濃度為10-90mmol/L,菌體濃度為50~400g/L,并添加終濃度為10~100g/L的麥芽糖作為輔助底物，于2834°C、100~250r/min反應(yīng)1640小時；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇。^f尤選的，所述方法^口下(1)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,瓊脂20g/L,溶劑為水，pH6.5，121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面，接種C朋cfe/afrap/cato104菌林，30°C培養(yǎng)35天，作為斜面種子；(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L，NH4C13g/L,KH2P041g/L,K2HP041g/L，MgS04.7H200.4g/L，溶劑為水，pH6.5,12rC滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接入斜面種子，于2834。C、100250r/min培養(yǎng)1030小時，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L,NH4C13g/L,KH2P04lg/L,K2HP041g/L，MgS04.7H200.4g/L,溶劑為水，pH6.5,121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻，以5~10%體積比接種量接種種子液，28~34°C、100-250r/min培養(yǎng)16~30小時，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液離心、收集菌體，用0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物質(zhì)量濃度為10~90mmol/L，菌體濃度為50~400g/L，并添加終濃度為10100g/L的麥芽糖作為輔助底物，28~34。C、100~250r/min反應(yīng)1640小時；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇。底物1-(3，5-二三氟曱基)苯基乙酮與產(chǎn)物(S)-1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的氣相色譜(GC)測定反應(yīng)結(jié)束后，用適量的乙酸乙酯萃取，用GC-2014氣相色譜分析。檢測條件檢測器為FID,色譜柱型號為HPChiral10%Cyclodextrin(30mx0.25mmx0.25|im),載氣為氮?dú)?，色i普柱溫度60°C-160°C，進(jìn)樣器和檢測器溫度分別為220。C和25(TC。產(chǎn)物(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇對映異構(gòu)體過量值(e.e.)測定方法如下產(chǎn)物的對映體過量值由下式計(jì)算e.e.=(C5-+x100%式中，G為(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的濃度，Cw為(R)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的濃度。本發(fā)明方法相對于傳統(tǒng)的化學(xué)不對稱合成法或酶轉(zhuǎn)化法具有以下優(yōu)點(diǎn)①生成的(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇對映體過量值高，達(dá)到99%以上；②生物催化劑為微生物菌體，可以自行發(fā)酵生產(chǎn)，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低廉;③在整個不對稱還原反應(yīng)過程中不需要添加輔酶;④反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。本發(fā)明通過菌種優(yōu)選，確定以熱帶假絲酵母(Ca"^/afra/7/ca/z:s)104作為產(chǎn)酶菌林，在單一水相體系中催化不對稱還原l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮生成(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇，所得產(chǎn)物的對映體過量值在99%以上，具有很好的應(yīng)用前景。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:對實(shí)驗(yàn)室保藏菌抹進(jìn)行了菌種篩選。轉(zhuǎn)化條件為在20mL0.1M,pH8.0的磷酸鈉緩沖液中，添加底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮濃度為5Ommol/L,輔助底物麥芽糖濃度為50g/L,濕菌體濃度300g/L，30°C,搖床轉(zhuǎn)速200r/min條件下轉(zhuǎn)化30h,結(jié)果見表l。表l:不同菌種催化1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的不對稱還原結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)論熱帶假絲酵母Oro//^的p/cafc104(CCTCCNo:M209034)催化1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇的產(chǎn)率和對映體過量值較高，將其作為優(yōu)選菌種。實(shí)施例2:(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇的制備斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L，球脂20g/L,溶劑為水，pH6.5，12rC滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面，接種熱帶假絲酵母CawiWa104菌株(CCTCCNo:M209034),30。C培養(yǎng)35天，作為斜面種子。種子培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L,NH4C13g/L,KH2P04lg/L,K2HP041g/L，MgS04'7H200.4g/L，溶劑為水，pH6,5,121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接入斜面種子，30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)20小時，作為種子液；發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基各組分終濃度為葡萄糖50g/L，酵母粉13g/L,NH4Ci3g/L,KH2P04lg/L，K2HP04lg/L,MgS04'7H200.4g/L，溶劑為水，pH6.5,12rC滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接種種子液，接種量10%體積比，30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)24小時，得發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心、收集菌體，用O.IM，pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮使底物質(zhì)量濃度為50mmol/L，濕菌體加量為300g/L,并添加終濃度為50g/L的麥芽糖作為輔助底物，30°C、200r/min反應(yīng)30小時，反應(yīng)結(jié)束，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，得所述的(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇，產(chǎn)率為70.3%，對映體過量值達(dá)99%以上。實(shí)施例37:用熱帶假絲酵母Ca"^fo/rop/ca/^104菌(CCTCCNo:M209034),4姿實(shí)施例2方法發(fā)酵培養(yǎng)后，將濕菌體加入裝有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩沖液的250mL三角瓶中(濕菌體終濃度為300g/L),并添加終濃度為50g/L的麥芽糖作為輔助底物，底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮濃度為1090mmol/L,于30。C,200r/min轉(zhuǎn)化30h。反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgS04干燥，過濾后，采用氣相色鐠分析(S)-1-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇含量與對映體過量值，結(jié)果見表2。表2:不同底物濃度對產(chǎn)率和對映體過量值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表2可知，底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮的較佳濃度為50mmol/L0實(shí)施例8~13:用Ca"^^104菌(CCTCCNo:M209034),按實(shí)例2方法發(fā)酵培養(yǎng)后，取濕菌體于裝有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩沖液的250mL三角瓶中(濕菌體終濃度300g/L),底物濃度為50mmol/L,并添加終濃度50g/L的不同輔助底物，于30"C，200r/min下進(jìn)行轉(zhuǎn)化30h。反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgS04干燥，過濾后進(jìn)行氣相色鐠分析(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇含量與對映體過量值，結(jié)果見表3。表3:不同輔助底物對產(chǎn)率和對映體過量值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)論從表3可以看出，較佳輔助底物為麥芽糖。實(shí)施例1418:用熱帶假絲酵母C""^i"fra//cflfo104菌(CCTCCNo:M209034)，按實(shí)施例2方法發(fā)酵培養(yǎng)后，將濕菌體加入裝有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩沖液的250mL三角瓶中(濕菌體終濃度為300g/L),底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮濃度為50mmol/L,并添加終濃度為10100g/L的麥芽糖作為輔助底物，于3(TC，200r/min轉(zhuǎn)化30h。反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgS04干燥，過濾后，采用氣相色譜分析(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇含量與對映體過量值，結(jié)果見表4。表4:不同底物濃度對產(chǎn)率和對映體過量值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表4可知，輔助底物麥芽糖的較佳濃度為50g/L。實(shí)施例14~21:用frap/cato104菌(CCTCCNo:M209034)，按實(shí)例2方法發(fā)酵培養(yǎng)后，取濕菌體于裝有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩沖液的250mL三角瓶中(濕菌體終濃度為50~400g/L),底物濃度為50mmol/L，并添加50g/L的麥芽糖作為輔助底物，于30°C，200r/min條件下轉(zhuǎn)化30h。反應(yīng)結(jié)束后離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgS04干燥，過濾后進(jìn)行氣相色譜分析(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇含量與對映體過量值，結(jié)果見表5。表5:不同菌體濃度對產(chǎn)率和對映體過量值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)論從表4可以看出，較佳菌體濃度為300g/L。實(shí)施例27:用Om^/a^c;p/c"to104菌(CCTCCNo:M209034),按實(shí)例2方法發(fā)酵培養(yǎng)后，取300g/L濕菌體于裝有20mL0.1M,pH8.0磷酸緩沖液的250mL三角瓶中，底物濃度為50mmol/L,并添加50g/L的麥芽糖作為輔助底物，于3(TC,200r/min下轉(zhuǎn)化2~48h。反應(yīng)結(jié)束后離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgS04干燥，過濾后進(jìn)行氣相色譜分析(S)-l-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇含量與對映體過量值。結(jié)論較佳的轉(zhuǎn)化時間為30h。權(quán)利要求1.一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括在以1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮為底物、以熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)104的發(fā)酵產(chǎn)物為酶源的反應(yīng)體系中，于28～34℃下進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇；所述發(fā)酵產(chǎn)物為熱帶假絲酵母104經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液或濕菌體；所述熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)104保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNoM209034，保藏日期2009年2月27日。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為10~90mmol/L,發(fā)酵產(chǎn)物加入量以所含濕菌體的濕重計(jì)為50400g/L。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中還添加有終濃度10~100g/L的麥芽糖。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系的溶劑為0.1M，pH8.0的磷酸緩沖液。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)物由如下方法制備得到熱帶假絲酵母104接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度2834。C下培養(yǎng)16~30小時后，得發(fā)酵液，或者將發(fā)酵液過濾得到濕菌體。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖4060g/L，酵母粉10-15g/L,氯化銨25g/L，磷酸二氫鉀0.52g/L,磷酸氫二鉀0.52g/L，碌lJ臾4美0.11g/L,溶劑為水，pH值6~8.5。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下轉(zhuǎn)化液離心，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述(S)-l-(3，5-二三氟曱基)苯基乙醇。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)斜面培養(yǎng)適用于熱帶假絲酵母的斜面培養(yǎng)基接種Caw/Wafrop/cflfc104菌抹，30。C斜面培養(yǎng)3~5天，作為斜面種子；(2)種子培養(yǎng)適用于熱帶假絲酵母的種子培養(yǎng)基接入斜面種子，2834°C,搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min,培養(yǎng)10~30小時，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子液以5~10%體積比接種量接種至適用于熱帶假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基，2834°C,搖床轉(zhuǎn)速100-250r/min,培養(yǎng)16~30小時，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液離心，收集濕菌體，用0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物質(zhì)量濃度為1090mmol/L，菌體濃度為50~400g/L,并添加終濃度為10~100g/L的麥芽糖作為輔助底物，于2834。C、100250r/min反應(yīng)1640小時；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙醇。9.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L,瓊脂20g/L,溶劑為水，pH6.5,121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面，接種G3"W^3frap/cafe104菌抹，3(TC培養(yǎng)3~5天，作為斜面種子；(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖50g/L，酵母粉13g/L，NH4C13g/L,KH2P041g/L,K2HP041g/L,MgS04.7H200.4g/L，溶劑為水，pH6.5,121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻、接入斜面種子，于28~34°C、100250r/min培養(yǎng)10~30小時，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖50g/L,酵母粉13g/L,NH4Cl3g/L，KH2P041g/L,K2HP041g/L，MgS04.7H200.4g/L,溶劑為水，pH6.5,121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻，以5~10%體積比接種量接種種子液，28~34°C、100~250r/min培養(yǎng)16~30小時，得發(fā)酵液；(4)微生物轉(zhuǎn)化將發(fā)酵液離心、收集菌體，用O.IM，pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后，將濕菌體轉(zhuǎn)入0.1M,pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，同時加入底物l-(3,5-二三氟曱基)苯基乙酮，使底物質(zhì)量濃度為1090mmol/L,菌體濃度為50~400g/L,并添加終濃度為10100g/L的麥芽糖作為輔助底物，28~34°C、100~250r/min反應(yīng)1640小時；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇。全文摘要本發(fā)明提供了一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括在以1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮為底物、以熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)104的發(fā)酵產(chǎn)物為酶源的反應(yīng)體系中，于28～34℃下進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。本發(fā)明通過菌種優(yōu)選，確定以熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)104作為產(chǎn)酶菌株，在單一水相體系中催化不對稱還原1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇，所得產(chǎn)物的對映體過量值在99％以上，具有很好的應(yīng)用前景。文檔編號C12R1/74GK101519674SQ20091009642公開日2009年9月2日申請日期2009年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日發(fā)明者何軍邀,俊唐,孫立明,普王申請人:浙江工業(yè)大學(xué)