專利名稱：合浦珠母貝目的基因的定位方法
技術領域：
本發明涉及一種對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法。
背景技術：
珍珠是一種典型的生物礦化產物，它不僅是裝飾品以及醫藥、化妝品的原材 料，而且還是設計和制備新型仿生高性能工程材料的理想模板。因此研究珍珠礦化的分 子機制具有重要的理論和實踐意義。合浦珠母貝(Pinctada fucata Martenssi)，又稱馬氏珠母貝，屬于軟體動物門 (Mollusca)，瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬 (Pinctada),主要分布在我國和日本沿海，是目前世界上用于海水珍珠生產的主要貝類。目前，對珍珠礦化機制的研究主要集中在參與礦化的蛋白或多肽的分離及其基 因的克隆，有關基因的功能研究還存在諸多困難。研究功能基因的定位，將有助于揭 示基因的功能，闡明珍珠質礦化的分子機制，從而為提高珍珠的產量與質量提供 理論基 石出。發明內客本發明的目的是提供一種對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法。本發明提供的對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法，是將合浦珠母 貝進行全胚原位雜交，根據全胚原位雜交的結果對目的基因進行基因定位；所述全胚原 位雜交所用的探針為針對目的基因的探針。所述全胚原位雜交可包括如下步驟1)將合浦珠母貝進行固定；2)將步驟1)得到的合浦珠母貝進行重新水化、去殼和固定；3)將步驟2)的合浦珠母貝進行預雜交；4)將步驟3)的合浦珠母貝進行雜交；5)將步驟4)的合浦珠母貝進行檢測。所述步驟1)可采用如下步驟將合浦珠母貝用4%多聚甲醛溶液4°C固定24h以 上；然后依次用50%甲醇-2%多聚甲醛溶液和甲醇洗滌；所述4%多聚甲醛溶液，溶質為多聚甲醛，溶劑為水或PBS，多聚甲醛的終濃度 為4% (質量百分含量)；所述50%甲醇-2%多聚甲醛溶液，溶質為甲醇和多聚甲醛，溶 劑為水，甲醇的終濃度為50% (質量百分含量)，多聚甲醛的終濃度為2% (質量百分含 量)；所述 PBS 的制備方法如下NaCl 8g，KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2P040.24g, H2O IL,調 pH 值至 7.4。所述用50%甲醇-2%多聚甲醛溶液洗滌的時間具體可為5分鐘；所述用甲醇洗 滌的時間具體可為5分鐘。所述步驟2)可采用如下步驟將步驟1)得到的合浦珠母貝依次用50%甲醇的 PBST溶液、30%甲醇的PBST溶液水化，然后用PBST洗滌，重復一次；然后用0.2mol的EDTA處理，再置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定，最后用PBST洗兩次； 所述50%甲醇的PBST溶液，溶質為甲醇，溶劑為PBST，甲醇的終濃度為50% (質量百分含量)；所述30%甲醇的PBST溶液，溶質為甲醇，溶劑為PBST，甲醇的終 濃度為30% (質量百分含量)；所述PBST制備方法如下在PBS中加入Tween-20使其 終濃度為0.1% (質量百分含量)；所述4%多聚甲醛的PBS溶液，溶質為多聚甲醛，溶 劑為PBS，多聚甲醛的終濃度為4% (質量百分含量)；所述PBS制備方法如下NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, H2OlL,調 pH 值至 7.4。所述步驟2)具體可采用如下步驟將步驟1)得到的合浦珠母貝依次用50%甲 醇的PBST溶液、30%甲醇的PBST溶液水化5分鐘，然后用PBST洗滌5分鐘，重復一 次；然后用0.2mol/L的EDTA水溶液處理半小時，再置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固 定20分鐘，最后用PBST洗兩次，每次5分鐘。以上任一所述方法中，所述目的基因可為nacrein基因。所述nacrein基因的序 列具體可如GENBANK ACCESS ION NUMBER D83523。所述全胚原位雜交中，所用的
探針具體可如序列表的序列1所示。所述合浦珠母貝具體可為附著期的合浦珠母貝。本發明為合浦珠母貝的研究提供了基因定位的方法，為進一步研究合浦珠母貝 的各種分子機制提供了很好的技術。本發明的方法易于操作，無需特殊設備，成本較 低。本發明對珍珠貝的質量和珍珠的品質有重要意義。
圖1為nacrein在附著期的全胚原位雜交結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實 驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說 明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下％如無特殊說明，均指質量百分含量。實施例中所用到的溶液的配方如下一、基礎溶液配方20 X SSC Na3Citrate 2H20 88.2g, NaCl 175.5g, DEPC H2O 至 IL ；抽濾，滅菌。二、實施例中所用溶液的配方(I)PBS NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, DEPC H2O IL ； HCl 調 pH 值至7.4，抽濾，滅菌。(2) 4%多聚甲醛多聚甲醛40g，PBS IL ；加熱持續攪拌至溶液澄清；-20°C保存。(3) PBST PBS中加入Tween-20使其終濃度為0.1 %。(4) 2 X SSCT 20X SSC稀釋10倍，力卩Tween-20,使其終濃度為0.2%。
(5) 0.2 X SSCT2 X SSCT 稀釋 10 倍。(6) HYB-甲酰胺20 X SSC儲液DEPC水=2 1 1配制，然后加入Tween-20使其 終濃度為0.1%，-20°c保存。(7) HYB+:HYB-20ml, yeast RNA IOmg，heparin Img ； -20 °C 保存。(8) MAB maleic acid 11.6g, NaCl 8.8g ；用固體NaOH(約7g)調至pH值為 7.5，4°C保存。(9) MABT MAB中加入Tween-20使其終濃度為0.1 %。(10) 10% blocking solution blocking reagent(羅氏 11096176001) 8g，MAB 72ml。(11)1 2 7 溶液滅活羊血清10%blocking reagent MABT= 1:2: 7(體積比)；用時現配。(12) Staining buffer Tris 12.lg, Mgcl 6H20 10.2g, NaCl 5.85g, Tween-20 1ml,無菌水 IL ；調 PH 值 至 9.5。實施例、對合浦珠母貝中的nacrein基因進行基因定位將附著期的合浦珠母貝(廣西營盤珍珠養殖場)進行全胚原位雜交，具體步驟如 下1、制備探針提取合浦珠母貝的cDNA，進行RT-PCR，獲取目的片段(序列1所示DNA)， 酶切后用地高辛標記。2、幼貝的采集與固定將附著期的合浦珠母貝用4%多聚甲醛固定，于4°C保存，保證固定時間在24h 以上。24h后用50%甲醇-2%多聚甲醛溶液(溶質為甲醇和多聚甲醛，溶劑為水；該 溶液中，甲醇的終濃度為50%，多聚甲醛的終濃度為2%)洗，室溫放置5min，后換成 100%甲醇，室溫放置5min，再置換成100%甲醇，于_20°C保存，待用。3、重新水化，去殼和固定依次用50%、30%甲醇的PBST溶液(溶質為甲醇，溶劑為PBST，且甲醇的終 濃度為50%;溶質為甲醇，溶劑為PBST，且甲醇的終濃度為30%)水化5分鐘，置換 成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次；用0.2mol/L的EDTA水溶液處理半小時，置換 成4%多聚甲醛固定20分鐘，用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。4、預雜交每個管中置換成大約300ul HYB-溶液，60°C水浴5分鐘，避免振蕩。用等體積的HYB+溶液取代HYB-溶液，60°C水浴，預雜交4小時以上。5、雜交
1)吸去預雜交 的HYB+，加上IOOul已加入變性(75°C變性IOmin)探針的HYB+ 溶液(探針濃度約為lng/ul)。2)60°C 溫浴過夜。6、檢測1)將探針回收，并依次用1毫升50%甲酰胺/2XSSCT溶液(溶質為甲酰胺，溶 齊[J為2XSSCT，且甲酰胺的終濃度為50% )，1毫升2XSSCT，1毫升0.2XSSCT洗滌。2)用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動；室溫下加Iml 1 2 7 溶液，時間為一小時；按1 3000的比例在1 2 7溶液中加入酶連地高辛抗體(羅 氏；貨號1745832)，4°C冰箱過夜。3)用Iml含10%熱滅活血清的MABT溶液(溶質為熱滅活血清，溶劑為 MABT，且熱滅活血清的終濃度為10%)置換抗體溶液(抗體可回收利用多次)，放置搖 床上25分鐘；然后用Iml MABT置換，25分鐘；再用Iml MABT溶液置換，一小時以 上；最后用Iml MABT溶液置換，25分鐘。4)用 Iml 含 ImM 左旋米唑的 Staining buffer (用之前在 Staining buffer 中加 IM 的
左旋咪唑儲液，使之終濃度為ImM)洗兩次，每次放置五分鐘。5)將胚胎轉入96孔板中，吸去staining buffer,力卩上180ul BM Purple APSubstrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)(羅氏；貨號11745832910)，四十八孔板 外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，28.5°C溫箱顯色。6)每隔20分鐘觀察胚胎是否開始顯色。7)將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%固定，拍照。 4°C冰箱保存。結果見圖1。由圖1可見，nacrein特異的在外套膜表達。序列表<110>清華大學<120>合浦珠母貝目的基因的定位方法<130>CGGNARY92539<160>1<210>1<211>501<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1cgattgggcc cgacgtcgca tgctcccggc cgccatggcg gccgcgggaa ttcgattgga 60tcgcccttgt gaaggtcctc attattggca aaccatatca caatgcttca ttgcgtgtgg120aattggacag agacaatctc caatcaacat cgtttcttat gatgctaaat ttcttcagcg180tttgccaaag ttgaaattca agccacatat ggagaaatta aaaacagaag tgaccaatca 240
tcagaaccga gctccagagt tcgagccaga ggatggggaa aatctgtacg tgaagctaaa 300
taacctagtg gacggtcatt ataaattcca taatcttcac gttcataatg gtagaaccgg360acgtaaggga tcagaacaca gtgttaacgg tcgtttcaca cctatggagg ctcatttggt420tttccatcat gatgaacaaa cacactttga acctacacgc acaagggcga tcccaatcac480tagtgaattc gcggccgcct g50權利要求
1.一種對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法，是將合浦珠母貝進行全胚 原位雜交，根據全胚原位雜交的結果對目的基因進行基因定位；所述全胚原位雜交所用 的探針為針對目的基因的探針。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述全胚原位雜交包括如下步驟1)將合浦珠母貝進行固定；2)將步驟1)得到的合浦珠母貝進行重新水化、去殼和固定；3)將步驟2)的合浦珠母貝進行預雜交；4)將步驟3)的合浦珠母貝進行雜交； 5)將步驟4)的合浦珠母貝進行檢測。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中將合浦珠母貝用4%多 聚甲醛溶液4°C固定24h以上；然后依次用50%甲醇-2%多聚甲醛溶液和甲醇洗滌；所述4%多聚甲醛溶液，溶質為多聚甲醛，溶劑為水或PBS，多聚甲醛的終濃度為 4% (質量百分含量)；所述50%甲醇-2%多聚甲醛溶液，溶質為甲醇和多聚甲醛，溶 劑為水，甲醇的終濃度為50% (質量百分含量)，多聚甲醛的終濃度為2% (質量百分含 量)；所述 PBS 的制備方法如下NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 OMg, H2O IL,調 ρΗ 值至 7.4。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述用50%甲醇-2%多聚甲醛溶液洗滌 的時間為5分鐘；所述用甲醇洗滌的時間為5分鐘。
5.如權利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中將步驟1) 得到的合浦珠母貝依次用50%甲醇的PBST溶液、30%甲醇的PBST溶液水化，然后用 PBST洗滌，重復一次；然后用0.2Μ的EDTA水溶液處理，再置換成4%多聚甲醛的PBS 溶液固定，最后用PBST洗兩次；所述50%甲醇的PBST溶液，溶質為甲醇，溶劑為PBST，甲醇的終濃度為50% (質 量百分含量)；所述30%甲醇的PBST溶液，溶質為甲醇，溶劑為PBST，甲醇的終濃度 為30% (質量百分含量)；所述PBST的制備方法如下在PBS中加入Tween-20使其終 濃度為0.1% (質量百分含量)；所述4%多聚甲醛的PBS溶液，溶質為多聚甲醛，溶劑為 PBS,多聚甲醛的終濃度為4% (質量百分含量)；所述PBS的制備方法如下NaCl 8g， KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g，H2O IL,調 pH 值至 7.4。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中將步驟1)得到的合浦珠 母貝依次用所述50%甲醇的PBST溶液、所述30%甲醇的PBST溶液水化5分鐘，然后 用所述PBST洗滌5分鐘，重復一次；然后用所述0.2M的EDTA水溶液處理半小時，再 置換成所述4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，最后用所述PBST洗兩次，每次5分 鐘。
7.如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述目的基因為nacrein基因。
8.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述nacrein基因為GENBANK ACCESSIONNUMBER D83523 所示的 DNA。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述全胚原位雜交所用的探針如序列表 的序列1所示。
10.如權利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述合浦珠母貝為附著期的合浦珠母 貝。
全文摘要
本發明公開了一種對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法。本發明提供對合浦珠母貝胚胎發育過程中的目的基因進行基因定位的方法，是將合浦珠母貝進行全胚原位雜交，根據全胚原位雜交的結果對目的基因進行基因定位；所述全胚原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針。本發明為合浦珠母貝的研究提供了基因定位的方法，為進一步研究合浦珠母貝的各種分子機制提供了很好的技術。本發明的方法易于操作，無需特殊設備，成本較低。本發明對珍珠貝的質量和珍珠的品質有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102021227SQ200910093208
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月15日 優先權日2009年9月15日
發明者張榮慶, 方東, 潘聰, 謝莉萍, 黃晶 申請人:清華大學