專利名稱：：甲烷氧化混合菌的保存方法
技術領域：
：本發明涉及一種甲垸氧化混合菌的保存方法。
背景技術：
：甲烷氧化菌是自然界中一類特殊的微生物，以甲烷為唯一碳源及能源，廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲垸氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其獨特的性質和多樣的催化功能，在大宗化學品生產、新功能酶開發、瓦斯氣體治理以及環境污染物的生物修復方面都具有極大的應用潛力。甲烷氧化菌純培養生長極為緩慢，功能不穩定，且甲烷氧化菌純菌資源較少。甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌為主體的不同共生菌體的組合，相比純菌更有利于工業應用。羅明芳等人研究表明，甲垸氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效積累環氧丙烷的能力(羅明芳，等.含有甲烷氧化菌的混合菌群特性研究.微生物學報，2007，47(1):103~109.)。在應用混合菌時，其功能的穩定，取決于穩定的菌群結構。平板傳代過程會丟失混合菌中的大量菌種，所以甲烷氧化混合菌的保存，不能使用純菌保存常用的平板傳代法。因此，迫切需要既簡便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群結構和功能的高效保存方法。
發明內容本發明的目的是提供一種甲烷氧化混合菌的保存方法。本發明提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括將甲烷氧化混合菌菌體置于-70。C-8(TC凍存的步驟。可先離心收集菌體，然后將菌體進行凍存。所述甲烷氧化混合菌菌體的濕重為50mg以上。應用本發明的方法保存甲烷氧化混合菌時，建議每一年轉接活化一次。所述甲烷氧化混合菌的制備方法可包括如下步驟1)采集煤礦或垃圾填埋場的土樣；2)將步驟l)的土樣加入NMS培養基中，于密封瓶中培養；初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小時向密封瓶中置換入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接種步驟2)的培養液至新的NMS培養基，進行傳代；步驟2)的培養液與NMS培養基的體積比為(5-15):(95-85);傳至10代以上，得到甲垸氧化混合菌。所述步驟2)具體可為初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18);每48小時向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲垸和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18)。所述步驟3)具體可為每10天接種步驟2)的培養液至新的NMS培養基，進行傳代(培養方法同步驟2));步驟2)的培養液與NMS培養基的體積比為10:90;傳至第10代，得到甲垸氧化混合菌。所述NMS培養基配制方法具體如下將100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至1L，滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C，得到NMS培養基；每升所述溶液A的配制方法為將鵬310g，MgS(V7H2010g，CaCl2-2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法為Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl2-4H200.02g，CoCl2.6H200.05g，H3BO30.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04'7H200.4g，NiCl2'6H200.Olg，CuS04'5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法為Na2HPCV12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值調至6.8。由于甲垸氧化菌的生長速度遠遠慢于其他細菌，當有非甲烷的碳源存在時，很容易改變甲垸氧化混合菌的菌群結構，從而導致混合菌功能上的變化，所以在甲垸氧化混合菌保存時，不能采用通常的添加保水性有機物(如甘油等)的菌種冷凍保存方法，避免引入其他碳源從而改變菌群結構。本發明提供的保存甲烷氧化混合菌的方法沒有引入其它碳源，可以穩定地保持混合菌群的結構和功能，并且操作方便，需要使用時，將凍存的菌體倒入培養基中培養即可。本發明將在甲烷氧化混合菌的保存及其工業化應用中發揮重要作用。圖1為甲烷氧化混合菌的變性梯度凝膠電泳圖。1:一直傳代培養的甲烷氧化混合菌；2:-80°(:凍存后的甲垸氧化混合菌。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。甲垸去除率的檢測方法如下在250ml的可密封的玻璃培養瓶中分裝50mlNMS液體培養基，在液體培養基中接種lmlOD6^1.0的甲垸氧化混合菌，加蓋密封橡膠塞，在上層空氣中置換入30ml甲垸(使瓶中空氣與甲烷的體積比約為5:1)'。30°C、170rpm空氣浴搖床培養，每24小時用氣相色譜檢測甲垸的剩余量(％，體積百分含量)。每次檢測完甲烷剩余含量之后，打開密封蓋，使內部氣體與外部氣體流通，然后重新加蓋密封橡膠塞，并重新在上層空氣中置換入30ml甲垸(使瓶中空氣與甲垸的體積比約為5:1)，同時用氣相色譜檢測甲垸起始量(％，體積百分含量)。甲烷去除率^甲垸起始量-甲烷剩余量)/甲烷起始量xiooy。。實施例l、甲烷氧化混合菌的獲得一、土樣采集和培養基配制土壤樣品從河南省新峰礦物局的一個高瓦斯煤礦四礦采樣，樣品取自該煤礦排風口處表層5cm深土壤,土壤樣品的基本性質見表l。表1新峰煤礦土壤樣品性質(取樣日期2006年10月9日)檢測參數樣品性質煤礦參數CH4濃度(%v/v)0.3C02濃度(％v/v)0.1空氣流速(mVmin)3800土壤參數土壤含水量(％，質量百分含量)31.4土壤溫度rc)26-27土壤pH9.4甲烷吸收速度(umol/每天每克土壤)3.0用于培養和篩選甲垸氧化混合菌的培養基為NMS培養基，配制方法如下:溶液A(每升):跳10g，MgS04.7H2010g，CaCl2'2H202g，去離子水定容至1L;溶液B(每升):Fe-EDTA0.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl2-4H200.02g，CoCl2-6H200.05g，H3B030.015g，Na-EDTA0.25g，ZnS04.7H200.4g，NiCl2.6H200.Olg，CuS04'5H200.025g，去離子水定容至IL;溶液C(每升):Na2HP04'12H2071.6g，KH2P0426g，去離子水定容至1L，pH值調至6.8，高溫(121°C)滅菌；NMS培養基100ml溶液A，lml溶液B，去離子水定容至1L，高溫(12rC)滅菌；在高溫滅菌后的混合液中加入10ml滅菌后的溶液C(如配置固體培養基則加入15g瓊脂粉)。二、甲烷氧化混合菌的培養搖瓶培養采用250ml螺口搖瓶，裝50mlNMS液體培養基，加入5g土壤樣品，利用帶有聚四氟乙烯密封墊的瓶蓋密封，在上層空氣中置換入30ml甲烷(使瓶中空氣與甲烷的體積比約為5:1);30°C，170rpm空氣浴搖床培養；每48小時重新置換入30ml甲垸(使瓶中空氣與甲垸的體積比約為5:1)。三、甲烷氧化混合菌的傳代每10天接種1(F。的培養液至新的NMS培養基中，作為一次傳代，培養方法同步驟二。對傳至第10代的甲垸氧化混合菌進行群落多樣性鑒定，方法為對穩定菌群的部分變性梯度凝膠電泳(DGGE，DenaturingGradientGelElectrophoresis)條帶進行測序，并使用RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)方法進行克隆建庫分析，通過序列比對分析，表明甲烷氧化混合菌中包括的細菌至少包括下面的菌屬甲基單胞菌屬(#ez^r7o/Ho/jas)、嗜甲基菌屬(#e^^o/7^7iAs)、甲基孢囊菌屬(ifet力y7ocys〃s)、ifetAK7osi""s、甲基桿菌屬(ifet/y7ote"er)、噬氫菌屬(場^ro《e/70/力3卵)、類芽胞桿菌屬(尸aew'力aci7J"s)、鞘脂單胞菌屬(5)3/j'"go歷。"a50、芽孢桿菌屬(feciJJiAs)。實施例2、甲垸氧化混合菌的保存和保存效果鑒定一、甲烷氧化混合菌的保存取50ml實施例l獲得的第10代的甲烷氧化混合菌(培養至對數生長期)，使用滅菌離心管離心上述培養好的混合菌，倒掉上清，收集濕重50mg以上的菌體，直接將盛有菌體的離心管置于-8(TC凍存。二、保存效果鑒定1、甲垸氧化混合菌的活化甲垸氧化混合菌-8(TC凍存六個月后，進行活化，具體如下將凍存的甲垸氧化混合菌接種于50ml的NMS培養基中，置換加入甲烷(使瓶中含有30ml甲垸)，30。C、170rpm空氣浴搖床培養4天，每48小時重新置換入甲烷。將活化后的甲烷氧化混合菌分別進行以下步驟2、3、4的鑒定。同時，將實施例1獲得的第10代的甲垸氧化混合菌一直傳代培養，作為對照，進行如下步驟2、3、4的鑒定。另外，將甘油保存(15%甘油，-80'C凍存六個月)的實施例1獲得的第10代的甲垸氧化混合菌進行同樣的活化，然后進行如下步驟2和步驟3的實驗。2、生長速度鑒定將步驟l的甲烷氧化混合菌接入50mlNMS培養基中，使初始濃度0D660為0.05,每天充入新的甲烷30ml，密封，30°C、170rpm空氣浴搖床培養。培養四天后，-8(TC凍存的甲垸氧化混合菌的0D66。達到1以上，與一直傳代培養6的甲烷氧化混合菌的生長速度相當，而甘油保存的甲垸氧化混合菌的0D,為0.3。結果說明，經本發明的保存方法保存后，甲垸氧化混合菌仍能保持較快的生長速度。3、耗甲垸能力的鑒定檢測步驟l的甲烷氧化混合菌的甲烷去除率。試驗設置3瓶重復，結果取平均值，結果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實驗結果表明，本發明保存方法保存后，甲烷氧化混合菌仍然具有高效的去除甲烷的能力。4、菌群結構的鑒定分別提取步驟1的甲烷氧化混合菌的基因組DNA，通過PCR-DGGE的方法考察微生物群落的變化。PCR擴增所使用的引物如下341f—GC(序列表的序列l):907r(序列表的序列2):5'-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3'。PCR的反應條件為94'C預變性5min，循環過程為94'Clmin、退火溫度lmin、72。C3min(其中退火溫度從6555。C，每個溫度2個循環)，72。C延伸7min。PCR反應產物用l.0%瓊脂糖變性梯度凝膠電泳檢驗。瓊脂糖凝膠電泳條件為6%的聚丙烯凝膠，40%-70%的變性劑梯度，85V恒壓，60°C，840min。走膠結束后，采用SYBRGold(MolecularProbesTM，InvitrogenCo.，CA)染色lh，用紫外檢測并照相。電泳圖見圖l。結果表明，采用本發明的方法保存后的甲垸氧化混合菌的DNA指紋和一直傳代培養的甲垸氧化混合菌非常接近，說明本發明的保存方法能很好的保持菌群結構的多樣性。序列表<110>清華大學<120>甲烷氧化混合菌的保存方法<130>CGGNARY92525<160>2<210>1<211>57<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400>1cgcccgccgcgccccgcgcccgtcccgccgcccccgcccgcctacgggaggcagcag57<210>2<211>20〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223><400>2ccgtcaattcmtttgagttt20權利要求1、一種甲烷氧化混合菌的保存方法，包括將甲烷氧化混合菌菌體置于-70℃～-80℃凍存的步驟。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于每個保存容器中，所述甲烷氧化混合菌菌體的濕重為50mg以上。3、如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述甲烷氧化混合菌的制備方法包括如下步驟1)采集煤礦或垃圾填埋場的土樣；2)將步驟1)的土樣加入NMS培養基中，于密封瓶中培養；初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);每24-72小時向密封瓶中置換入甲垸，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲垸和空氣的體積比為(5-30):(5-40):(30-80);3)每8-12天接種步驟2)的培養液至新的NMS培養基，進行傳代；步驟2)的培養液與NMS培養基的體積比為(5-15):(95-85);傳至10代以上，得到甲垸氧化混合菌。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18);每48小時向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為5:(2.5-3.5):(15-18)。5、如權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，每10天接種步驟2)的培養液至新的NMS培養基，進行傳代；步驟2)的培養液與NMS培養基的體積比為10:90;傳至第10代，得到甲垸氧化混合菌。6、如權利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于所述畫S培養基配制方法如下將100ml溶液A和lml溶液B混合并用水定容至lL，滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C，得到NMS培養基；每升所述溶液A的配制方法為將KN03lOg，MgS(V7H2010g，CaCl2.2H202g，水定容至1L;每升所述溶液B的配制方法為Fe-EDTAO.38g，NaMo040.26g，FeS040.5g，MnCl24H200.02g，CoCl2'6H200.05g，H3B030.015g，Na—EDTA0.25g，ZnS04'7H200.4g，NiCl2'6H20O.Olg，CuS04-5H200.025g，水定容至1L;每升所述溶液C的配制方法為Na2HP04'12H2071.6g，KH2P0426g，水定容至1L，pH值調至6.8。全文摘要本發明公開了一種甲烷氧化混合菌的保存方法。本發明的方法中，包括將甲烷氧化混合菌菌體置于-70℃～-80℃凍存的步驟。本發明提供的保存甲烷氧化混合菌的方法沒有引入其他碳源，可以穩定地保持混合菌群的結構和功能，并且操作方便，需要使用時，將凍存的菌體倒入培養基中培養即可。本發明將在甲烷氧化混合菌的保存及其工業化應用中發揮重要作用。文檔編號C12N1/20GK101638631SQ20091009235公開日2010年2月3日申請日期2009年9月7日優先權日2009年9月7日發明者昊吳,翀張,程楊,皓江,邢新會,冰韓申請人:清華大學