專利名稱：基于免疫毛細管電泳-激光誘導熒光的基因組dna整體甲基化水平分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物學檢測技術領域，具體是一種基于免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術的 DNA整體甲基化水平高效、快速檢測方法。
背景技術：
DNA甲基化是脊椎動物最重要的表觀遺傳修飾形式之一，對于哺乳動物胚胎的正常發育 具有重要作用，與基因表達調控、雌性個體X染色體的失活、遺傳印跡等密切相關。異常 DNA甲基化可以對基因組產生負面的影響，與人類許多疾病相關，是癌癥的重要標識。其中， 基因組整體低甲基化狀態作為異常的DNA甲基化形式之一，在多種癌細胞中均可檢測到， 可以影響染色體結構、增加染色體重組和突變的頻率以及使原癌基因激活等，是癌癥發生的 一個重要機制。
近年來隨著DNA甲基化檢測技術的快速發展，DNA甲基化與人類疾病的研究不斷深入。 對基因組DNA整體甲基化水平的檢測可以實現對癌癥等疾病的診斷，研究各種環境污染物 的致癌機理等。近來DNA整體甲基化分析主要依靠高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE) 等檢測手段，將基因組DNA酶解為單個核苷或堿基，檢測甲基化胞嘧徒占總胞嘧啶的比例， 以此分析基因組DNA的整體甲基化水平。在這些檢測方法中毛細管電泳-激光誘導熒光 (CE-LIF)具有靈敏度高，DNA用量少等優點，但樣品制4過程中DNA酶解操作繁瑣，且 需要對核苷進行化學修飾，限制了其對大規模以及特殊樣品的分析。
本發明將毛細管電泳-激光誘導熒光技術的快速、高靈敏度等優勢與免疫學方法的特異性、 準確性相結合，克服了傳統檢測方法的缺陷，實現對DNA整體甲基化水平的高效、快速檢 測，適用于環境污染物對DNA甲基化影響的快速篩選及癌癥等疾病的表觀遺傳學評估。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術(immuno-CE-LIF)進 行DNA整體甲基化水平的檢測方法。
本發明提供的DNA整體甲基化水平檢測原理如圖1所示，其具體檢測方法依次包括以下 步驟
1) 待檢測DNA與抗體結合反應；
2) 免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術分離檢測DNA-抗體免疫復合物；3)對DNA-抗體免疫復合物進行定量分析，確定待測DNA中整體甲基化水平。
步驟l)所述抗體可以特異性識別甲基化胞嘧啶并與之結合，熒光染料可以標記于一抗， 也可以使用可與一抗結合的熒光標記二抗。
利用免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術進行DNA整體甲基化水平的檢測方法為DNA 與抗體反應混合物進入毛細管，在電泳運行緩沖液中得以分離；熒光標記經過毛細管檢測窗 口被激發光激發，產生的熒光信號由PMT檢測，經過信號轉換在色譜工作站中處理為毛細管 電泳譜圖。若待檢測DNA中沒有甲基化胞嘧啶，則只能檢測到熒光標記的抗體(或抗體復 合物)信號，在毛細管電泳譜圖中只有抗體峰產生；若待檢測DNA中含有甲基化胞啼捉， 則能夠檢測到抗體(或抗體復合物)信號以及DNA-抗體兔疫復合物信號，在電泳譜圖中分 別顯示抗體峰和DNA-抗體免疫復合物峰。
在色譜工作站中進行數據處理，對DNA-抗體免疫復合物峰面積進行積分，根據積分所 得峰面積確定待測DNA的整體甲基化水平。
本發明所提供的DNA整體甲基化水平的檢測方法，具有DNA用量少，檢測靈敏度高， 高效快速等優點，克服了傳統檢測方法DNA操作繁瑣，檢測時間長等缺陷，具有廣泛的應 用前景。本發明可以應用于各種細胞、組織DNA的整體甲基化水平檢測，天然產物、合成 藥物、中草藥中有效成分的篩選，環境污染物對生物體DNA整體甲基化水平影響的快速篩 選以及癌癥等人類疾病的表觀遺傳學評估。
圖l為immuno-CE-LIF技術檢測DNA整體甲基化水平原理圖2為對mM)NA中整體甲基化水平檢測的immuno-CE-LIF電泳圖3為不同濃度>DNA和m入DNA的immuno-CE-LIF檢測結果；
圖4為總XDNA中mXDNA比例不同時的immuno-CE-LIF檢測結果；
圖5為A549細胞基因組DNA整體甲基化水平immuno-CE-LIF電泳圖6為不同濃度A549細胞基因組DNA的檢測結果；
圖7為A549細胞和HepG2細胞經不同濃度5-Aza-dC暴露后基因組DNA整體甲基化水平檢 測結果。
具體實施方式
' 本發明的具體實施方法包括以下幾個步驟
1、 DNA與抗體反應
將待測DNA與熒光標記的甲基化胞嘧啶特異性抗體反應，或待測DNA與甲基化胞嘧啶 特異性抗體和熒光標記的二抗反應，使待測DNA中甲基化胞嘧啶與抗體特異性結合，并帶 有熒光標記。
2、 CE-LIFP分離檢測DNA-抗體免疫復合物
反應混合物通過CE-LIF裝置進行immuno-CE-LIF分析。DNA與抗體反應混合物進入毛 細管，在電泳運行緩沖液中進行分離。熒光標記經過毛細管檢測窗口被激發光激發，PMT檢 測到激發產生的熒光信號，經過信號轉換在色譜工作站中處理為毛細管電泳譜圖。
若待檢測DNA中含有甲基化胞嘧啶，則能夠檢測在毛細管電泳過程中分離的抗體(或 抗體復合物)信號及DNA-抗體免疫復合物信號，電泳譜圖中顯示為兩個峰，分別為抗體(或 抗體復合物)峰和DNA-抗體免疫復合物峰；若待檢測DNA中沒有甲基化胞嘧啶，則只能檢 測到熒光標記的抗體(或抗體復合物)信號，電泳譜圖中僅顯示抗體峰。
3、 對DNA-抗體免疫復合物進行定量分析，分析待測DNA中整體甲基化水平
在色譜工作站中確定抗體(或抗體復合物)峰和DNA-抗體免疫復合物峰，對DNA-抗體 免疫復合物峰面積進行積分，根據目標免疫復合物的峰面積確定基因組DNA中整體甲基化 水平。 ，
下述實例中所用的DNA甲基化處理、細胞暴露及細胞基因組DNA提取方法均為常規實 驗方法。
下述實例中采用甲基化處理的WDNA (m XDNA)是利用細菌來源的DNA甲基轉移酶 M. I處理XDNA，使5J)NA中CpG位點的胞嘧啶完全甲基化，甲基化處理效果通過限制 性內切酶UI對入DNA進行酶切驗證。
細胞暴露實驗為利用不同濃度5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-dC)對A549細胞和HepG2 細胞進行72 h暴露，5-Aza-dC暴露濃度分別為0.01 ^M， 0. 1 一， 1 pM， 5 和10 jiM。
暴露結束后用基因組DNA提取試劑盒提取細胞基因組DNA，紫外分光光度計測定基因組 DNA濃度及純度。 .
實施例1、 XDNA中整體甲基化水平的immuno-CE-LIF檢測本實例采用一抗為鼠來源的5-甲基胞嘧啶單克隆抗體，可特異性識別單鏈DNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)并與之結合；Alexa Fluor 546熒光標記的Fc特異性抗IgGl的F (ab，) 片段為本實例用的二抗。待測ADNA經過95 。C處理5min,雙鏈DNA變性為單鏈，冰上放 置10min以防止單鏈DNA復性，與上述一抗、二抗4'C過夜反應，形成DNA-抗體免疫復合 物。DNA與抗體的反應體系為20 pL，其中一抗和二抗濃度分別為1 pg/mL和2 ng/mL。
反應混合物通過在CE-LIF裝置中進行分離，激發波長為543.5nm，檢測波長為575nm。 本實例采用未涂敷的熔融石英毛細管，內徑25pm，外徑150nm，有效長度21 cm，總長27cm。 電泳運行緩沖液為lxTG(Tris30mM，甘氨酸160 mM， PH8.5)，樣品緩沖液為2xTGA (Tris 14mM，甘氨酸108mM，醋酸10mM，PH 7.5)。CE-LIF分析的進樣電壓和時間分別為15 KV、 5 s，電泳分離電壓為20KV。反應混合物進入毛細管電泳后，抗體復合物與DNA-抗體免疫 復合物在電泳運行緩沖液中得以分離；二抗所帶的Alexa Fluor 546熒光標記經過毛細管檢測 窗口被543.5 nm激發光激發，產生的熒光信號由光電倍增管(PMT)檢測后經過信號轉換在 色譜工作站中顯示為電泳譜圖。
3 ng/mL的m XDNA與抗體在4 。C過夜反應后，按上述條件進行immuno-CE-LIF分析。 附圖2中譜圖1、2和3分別為對抗體混合物，雙鏈m XDNA-抗體反應混合物和單鏈m人DNA-抗體反應混合物的immuno-CE-LIF檢測。譜圖1顯示峰1為抗體復合物峰，峰2由于可以 通過脫鹽處理除去，認為主要是從二抗上脫落的熒光染料，比較譜圖2和3，抗體只能與單 鏈DNA中的5mC反應，在譜圖3中有明顯的DNA-抗體免疫復合物生成(峰2)，但與染料 脫落峰有所重疊；而抗體與雙鏈DNA反應則沒有明顯免疫復合物的生成，其電泳譜圖與單 純抗體相同，證明本實例所用抗體能識別單鏈DNA中5mC并與之結合形成免疫復合物。
改變與抗體反應的m XDNA濃度，按上述方法進行immuno-CE-LIF檢測，同時以未甲基 化處理的XDNA作為陰性對照，檢測未甲基化DNA與抗體是否存在交叉反應。mXDNA濃 度選擇0 pg/mL, 0.1 pg/mL， 0.5 ng/mL， 1嗎/mL， 2 ng/mL， 5 (ag/mL， lOpg/mL和25 pg/mL,以入 DNA濃度對應DNA-抗體免疫復合物峰面積作圖，附圖3顯示隨m X)NA濃度的升高，免疫 復合物峰面積增大，且mXDNA濃度在O.l pg/mL時即可檢測到免疫復合物的存在，mXDNA 濃度為10pg/mL時檢測到免疫復合物的量達到平臺期，證明甲基化胞嘧啶與以一抗結合達到 飽和。與之相對應未甲基化JiDNA濃度達25ng/mL時仍沒有明顯的免疫復合物形成，證明本 發明所選用的一抗能特異性與甲基化胞嘧啶結合，與未甲基化胞嘧啶幾乎不存在交叉反應。
改變m入DNA占總人DNA的比例，m J)NA/ (m J)NA+XDNA)分別為0%， 25%， 50%, 75%和100%，確定總XDNA濃度為1 ng/mL與抗體過夜反應，進行immuno-CE-LIF檢測。附圖4顯示，mXDNA的比例與復合物峰面積存在較好的線性關系(R2=0.99)。
本實例證明immuno-CE-LIF實驗可以有效地用于DNA整體甲基化水平的檢測，具有 DNA用量少，靈敏度高，操作簡便等優點。 '
實施例2、 A549細胞基因組DNA整體甲基化水平的immuno-CE-LIF檢測
50 jig/mL的A549細胞基因組DNA變性為單鏈DNA，與5-甲基胞嘧啶單克隆抗體和熒光 標記二抗在4 。C過夜反應，按實例1所述條件進行immuno-CE-LIF分析。附圖5為對A549 細胞整體甲基化水平的檢測結果，電泳峰型與檢測m XDNA的峰型相似，表明A549細胞基 因組DNA能夠與抗體反應形成明顯的DNA-抗體免疫復合物。附圖6顯示A549細胞基因組 DNA濃度在0-50 ng/mL范圍內時進行CE-LIFP檢測，DNA-抗體免疫復合物的量與DNA濃 度呈現較好的線性關系(R2=0.99)，實例表明本發明能夠用于培養細胞基因組DNA整體甲基 化的檢測。
實施例3、 CE-LIF檢測5-Aza-dC對細胞基因組DNA整體甲基化水平的影響
不同濃度的5-Aza-dC對A549細胞和HepG2細胞暴露72 h后，分別其提取基因組DNA， 50pg/mL的細胞基因組DNA與抗體過夜反應，按上述方法進行immuno-CE-LIF檢測。附圖 7顯示不同濃度5-Aza-dC對A549細胞和HepG2細胞基因組DNA整體甲基化水平的影響， 隨著5-Aza-dC濃度的升高，細胞DNA整體甲基化水平呈下降趨勢。在最高暴露濃度(IO pM) 下A549細胞和HepG2細胞基因組DNA整體甲基化水平分別下降64%和46%，且5-Aza-dC 暴露濃度為0.01 時對DNA整體甲基化水平的抑制(10。/p-20c/。)即可通過本發明檢測得到， 進一步證明了本發明可以應用于基因組DNA整體甲基化水平的快速檢測，實現各種藥物中 有效成分的篩選及環境污染物對生物體DNA整體甲基化水平影響的快速分析。
權利要求
1、一種DNA整體甲基化水平的高效快速檢測方法，其特征在于利用免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術進行檢測。
2、 基于權利要求l所述，其檢測依次包括以下步驟1) 待測DNA中甲基化DNA與抗體反應的選擇性熒光標記；2) 免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術分離檢測DNA-抗體免疫復合物；3) 對DNA-抗體免疫復合物進行定量分析，確定待測DNA中整體甲基化水平。
3、 基于權利2，甲基化DNA的抗體選擇性標記包括兩種方式1) 采用熒光標記的二級抗體標記可特異性識別甲基化DNA的一級抗體；2) 將可特異性識別甲基化DNA的一級抗體直接與反應性熒光染料反應，實現一級抗體 的直接熒光標記。
4、 基于權利3，其特征在于 一級抗體和二級抗體的熒光標記包括有機熒光染料、量子 點、熒光珠、稀土熒光分子等有熒光特性的材料。
5、 基于權利要求2所述，待測DNA包括1) 人和動物各種組織DNA，包括血液、心、肺、肝、腎、膀胱、消化道、腦、脊髓液、 精液等；2) 各種細胞DNA;3) 細菌DNA;4) 各種病人組織DNA。
6、 基于權利l所述的方法，其特征在于本發明可以用于DNA整體甲基化水平檢測試 劑盒的發展。
7、 基于權利l、 2、 3、 4、 5和6所述的方法，其特征在于本發明可應用于天然產物、 合成藥物、中草藥中有效成分的篩選。 '
8、 基于權利l、 2、 3、 4、 5和6所述的方法，其特征在于本發明可應用于環境污染物 對生物體DNA整體甲基化水平影響的快速篩選；應用于癌癥等人類疾病的表觀遺傳學快速 評估。
全文摘要
本發明涉及一種DNA整體甲基化水平的高效快速檢測方法。本發明利用免疫毛細管電泳-激光誘導熒光技術實現對DNA-抗體免疫復合物的分離與檢測，以此定量分析待測DNA中整體甲基化水平。本發明與傳統DNA整體甲基化水平檢測方法相比，無需重亞硫酸鹽處理、DNA酶解及PCR擴增等步驟，具有操作簡便快速、DNA用量少、檢測靈敏度高等優勢，可以實現對DNA整體甲基化水平的高效、快速檢測，適用于各種生物樣品的檢測，環境污染物對DNA甲基化影響的快速篩選及對癌癥等疾病的表觀遺傳學評估。
文檔編號C12Q1/68GK101638689SQ20091009231
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月10日 優先權日2009年9月10日
發明者汪海林, 王曉利 申請人:中國科學院生態環境研究中心