專利名稱：：檢測仔豬常見致病菌的基因芯片、試劑盒及方法
技術領域：
：本發明涉及動物醫學診斷領域，特別是涉及一種檢測仔豬常見致病菌的基因芯片、試劑盒及方法
背景技術：
：我國畜禽生產中傳染病問題嚴重，多種病原感染經常發生，細菌感染是最常見的繼發和多重感染源。長期以來，細菌的分離鑒定一直是實驗室檢驗的難題。細菌鑒定的傳統方法主要有細菌分離培養、生化試驗、血清學試驗等，程序煩瑣，專門的權威檢驗部門通常需要至少4-7天才能得出結果。還有的細菌在體外很難培養、至今無法培養或屬于新發現的細菌，給實驗室分離鑒定帶來了很大的困難。現有的生化試劑盒需要先判定革蘭氏染色陽性或陰性、氧化酶試驗陽性或陰性后才能選擇適合的生化試劑盒，而染色環節和氧化酶試驗也常出現陽性或陰性錯判，進口VITEK、API生化試劑盒價格昂貴，國內的生化試劑盒質量參差不齊，不能適應當前市場和公共衛生的需要。基因芯片技術是20世紀90年代初期發展起來的一種基因分析的高新生物技術，其突出的特點是集成化、微型化、自動化、高通量等。基因芯片檢測的目的片段大多是PCR產物，可以高通量、平行化對多種把基因進行準確鑒定，為微生物菌種識別、毒力因子確定、耐藥性檢測等提供了新的技術平臺，同時在基因表達i普、突變檢測、SNP篩查及藥物篩選等研究中已經得到越來越廣泛的應用。在致病菌檢測方面，目前報道的4全測方法中以特異性引物多重PCR結合基因芯片方法、通用引物結合基因芯片方法等為主。目前，已經建立了基于通用引物的基因芯片檢測系統，選取的靶基因有16SrRNA基因、16-23SrRNA基因區間或23SrRNA基因等。據報道，該方法已經應用于檢測血液和腦脊液中的細菌、腸道致病菌、魚類致病菌、水中致病菌、食品中的致病菌、環境中的致病菌等。研究人員設計出細菌的通用引物>只通過一次PCR擴增就可以得到大部分細菌的目標片段，解決了多重PCR體系對同時檢測和鑒定致病菌數量的限制問題。基于通用引物的基因芯片體系檢測的最大優勢在于可以在不增加引物對的情況下，通過添加特異性探針進而擴大該體系的檢測范圍，提高同時檢測多種目標細菌的能力。23SrRNA作為細菌核糖體RNA基因之一，含有與16SrRNA基因類似的特點，比如在細菌基因組中普遍分布、多拷貝、保守性高，有保守區和可變區域。23SrRNA比16SrRNA基因有更長的序列，其變異性對于許多細菌來說高于16SrRNA，研究表明其在一些細菌鑒別中的優越性高于16SrRNA基因。仔豬階段的豬由于免疫力低，生理系統功能不全，常常感染致病菌而發生各種疾病，導致存活率低，或者影響后續生長發育的質量，給養殖戶帶來很大的風險。與發達國家相比，我國對于仔豬致病菌的檢測仍處在較低水平，因此有必要利用分子生物學技術建立針對多種病原的高通量、快速、準確的檢測體系，研制適合突發傳染病病原檢驗且操作簡便的試劑盒，在較短的時間內對感染性疾病做出正確診斷，防止傳染性疾病傳播，提高我國對動物感染性疾病的控制能力，降低養殖風險。
發明內容本發明針對上述領域的空白和需要，提供一種檢測仔豬常見致病菌的基因芯片、試劑盒及方法，能夠同時檢測目前已知的多種仔豬常見致病菌，為正確防治疫病提供充裕的時間。一種檢測仔豬致病菌的基因芯片，其特征在于芯片基質上設置有仔豬致病菌的23SrRNA特異性探針序列，所述仔豬致病菌及其23SrRNA特異性探針序列如下豬放線桿菌(Ara&)，ATAGCAGTAGACACAGAAGAACGAGC;胸膜肺炎放線桿菌(Ap/ewrap"ewwo"/ae),AGTGATAATGGTTTTGTTAGGAGAAT;多殺性巴氏桿菌(Pmw/tocWa),CCGTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAA;副豬嗜血桿菌(/f:/araTO&),GTAGGTTGTAAGAGTATACCTCCGA;豬鏈球菌(S^ep.ra/;)，TAAGCAGTGAGGTGTGATATGAGTC;支氣管敗血波氏桿菌CBoWete//a6ra"c/z,:s印"ca),ATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGGTG;表皮葡萄球菌(Stop/^/ococc船^/aferm/'^s),GTTTCCTCGAGTCGTTGATTTCACAC;空腸彎曲菌(Ow7炒/oZ^cft^"/),GGATAGAAGAACCCCTGATGCCGTC;產氣莢膜梭菌(C/o欲W"m/^yH"gem'),AACCGAAGTACATGATTCCACGCTGCCA;豬肺炎支原體菌抹(嶺c—^y顧w腳w'促),AGTACCGAATTAAATGACTCTCTGTT;腸道沙門菌(5Wwo加〃"e"/en'c")，CACGTAGGTGAAGTGATTTACTCATG;大腸桿菌(^sc/2en'c//aco/"GTAGGTGAAGCGACTTGCTCGTGGA;和/或大腸桿菌(Esc/en'cA/aco/z')，GCTGATATGTAGGAGAAGTCCCTCGCGG。一種檢測仔豬致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于包括如下兩組寡核脊酸(1)上述基因芯片；(2)如下兩對通用引物23S-F1:5，AACDGGTTRATATTCC3',23S-R1:5'GCTACCTTAGGACCGTTAT3，；23S-F2:5'GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA3',23S-R2:5'TGGTTCACTATCGGTCAATCAG3，,且所述23S-Rl與23S-R2的5'端用Cy3熒光標記。所述試劑盒還包括除通用引物和DNA探針之外的PCR擴增所需試劑和雜交液，所述雜交液的成分為5xSSC溶液，2.5%曱跣胺，0.2%SDS。所述試劑盒還包括PCR陰性對照模板和陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水，所述陽性對照模板為上述任一致病菌的基因組DNA。一種檢測仔豬致病菌的基因芯片方法，包括如下步驟(1)提取待測菌的基因組DNA，(2)用如下兩對通用引物擴增待測菌的基因組DNA，23S-F1:5，AACDGGTTRATATTCC3,，23S-R1:5'GCTACCTTAGGACCGTTAT3';23S-F2:5，GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA3，，23S-R2:5TGGTTCACTATCGGTCAATCAG3，,且所述23S-Rl與23S-R2的5，端用Cy3熒光標記。(3)擴增產物與上述基因芯片雜交，(4)雜交后處理及掃描結果。所述通用引物擴增待測菌的基因組DNA的PCR體系中，通用引物終濃度比為23S-R1:23S-F1等于10,23S-R2:23S-F2等于30;在所述步驟(2)前，先對基因芯片進行如下預處理用0.2%SDS清洗2次，接著以雙蒸水清洗2次，晾干后用于雜交。所述步驟(2)中以所述任一致病菌參考抹的基因組DNA為陽性對照模板，以雙蒸水為陰性對照模板。所述雜交步驟如下擴增產物變性，98。C10min后冰浴10min，將變性的PCR產物與雜交液體積比l:4混勻，取IOnl轉移至所述基因芯片反應區，將所述基因芯片置于雜交盒內，連同雜交盒浸入42°C水浴中反應60min。所述雜交后清洗步驟如雜交后的基因芯片依次在洗液A:lxSSC、0.2%SDS，洗液B:0.2xSSC和洗液C:O.lxSSC中于室溫各洗滌lmin。本發明提供一種能夠同時檢測12種仔豬致病菌的基因芯片，包括該基因芯片的試劑盒，以及利用該試劑盒或者基因芯片檢測仔豬致病菌的方法。(一)本發明的基因芯片制作過程及優點如下從Genbank收集12種目標細菌的23SrRNA全基因或接近完全的基因序列108條，對108條序列按種建庫，用DNAStar軟件的clustalW程序進行比對，選出每種細菌的代表序列1或2條，共14條，對這14條序列進行比對，找出它們的保守區和變異區。利用Biosun2.0軟件(軍事醫學科學院基礎醫學研究所計算生物學中心)，6在變異區對每種細菌的序列數據庫設計各自的種特異性探針，共設計了12種細菌的36條種特異性候選探針,分布在23SrRNA序列的2個變異區域內；借助PrimerPremier5.0軟件在設計出上述36條候選探針序列的2個變異區域外側的保守區設計了2對通用引物，兩對通用引物聯合擴增，能夠擴增出多種細菌的23SrRNA基因序列。利用通用引物對12種目標細菌的參考菌抹(見表l中帶星號的菌抹)的基因組DNA進行PCR擴增，然后將PCR產物分別與雜交液混勻后與點有36條候選探針的基因芯片雜交、掃描及結果分析，扣除背景值，以探針的特異性和熒光信號的強度值(熒光信號強度由強到弱分別為白色，紅色，黃色，綠色)作為最終篩選探針的指標。結果從36條候選探針中選出13條探針(大腸桿菌有2條)，作為該仔豬常見致病菌的終選探針(表6)。終選探針與對應參考菌林PCR乾標的特異性雜交結果見圖6。將12種細菌的終選特異性探針固定在常用的基因芯片基質上，形成檢測這12種致病菌的特異性基因芯片，本發明選取的特異性探針能特異地檢測出屬于同一個菌種的菌林，如表l中沒有帶星號的菌林也能被這些特異性探針捕獲出來，本發明的基因芯片可檢測的范圍包括12種致病菌下屬的多種致病菌抹，集實用性與高效性于一身，可用于高通量地檢測仔豬感染情況，為高效率檢測或鑒別疫情提供了最關鍵的方法。(二)本發明還提供一種檢測12種致病菌的試劑盒，該試劑盒的特征在于包含有本發明提供的上述基因芯片和兩對通用引物。該試劑盒在具備芯片掃描儀的分子生物學實驗室條件下，可方便快捷地檢測待測仔豬的細菌感染狀況，作為優選，在試劑盒中還可以包括除芯片和通用引物之外的PCR試劑和雜交液，使得該試劑盒更便于使用。試劑盒中還包括12種致病菌中任意一種菌的基因組DNA為PCR陽性對照模板，用于排除假陰性；雙蒸水為陰性模板，用于排除污染造成的假陽性。(三)本發明還提供了檢測12種致病菌的檢測方法，該方法主要特征在于采用本發明提供的基因芯片及兩對通用引物PCR。通用引物將待測菌模板進行擴大若干倍，從而提高了菌的檢出靈敏度，盡管芯片可檢測多種致病菌，但PCR只需要兩對引物，并不需要與每種致病菌--對應的多對引物，因此，檢測過程既簡便又靈敏。本發明提供了優化的方案是通用引物中下游引物5，端用熒光進行標記，通用引物濃度比為23S-R1:23S-F1等于10，23S-R2:23S-F2等于30;即以上下游通用引物濃度不對稱的方式擴增待測模板，不對稱PCR的目的是通過多加熒光標記的下游通用引物，少加非熒光的上游通用引物獲得大量的單鏈PCR產物，單鏈PCR產物可提高芯片上單鏈探針雜交的效率。為了提高芯片雜交的準確性，排除假陽性或假陰性，芯片上點有陽性對照探針、陰性對照探針和空白對照。綜上所述本發明提供了一種檢測仔豬常見致病菌的基因芯片，同時提供了試劑盒與優化的檢測方法，能針對多種病原進行高通量、快速、準確的檢測，適合于突發傳染病病原檢驗，提供的試劑盒使檢測方法簡便高效，使獸醫實驗室工作人員能在較短的時間內對感染性細菌病做出正確診斷，防止傳染性疾病傳播，提高我國對動物感染性疾病的控制能力，降低養殖風險。說明書附圖圖1:12種目標細菌的14條23SrRNA代表序列比對結果及通用引物位置標記(后800nt序列未顯示)。圖2:第一對通用引物的擴增產物550bp(能擴增所有目標細菌)。M:DL2000;1:空白；2:胸膜肺炎放線桿菌；3:副豬嗜血桿菌；4.多殺性巴氏桿菌；5:豬放線桿菌；6:大腸桿菌-l;7:大腸桿菌-2;8:腸道沙門菌；9:豬鏈球菌；10:表皮葡萄球菌；11:產氣莢膜梭菌；12:空腸彎曲菌；13:支氣管敗血波氏桿菌；14:豬肺炎支原體菌林。圖3:第二對通用引物的擴增產物250bp(能擴增部分目標細菌)M:DL2000;1:空白；2:胸膜肺炎放線桿菌；3:副豬嗜血桿菌；4:多殺性巴氏桿菌；5:豬放線桿菌；6:大腸桿菌-l;7:大腸桿菌-2;8:腸道沙門菌；9:空腸彎曲菌；10:支氣管敗血波氏桿菌；11:豬肺炎支原體菌林；12:豬鏈球菌；13:表皮葡萄球菌；14:產氣莢膜梭菌。圖4:550bp片段上下游通用引物比例優化雜交信號分析橫坐標表示引物比例，縱坐標表示雜交信號強度，黑色柱子代表表皮葡萄球菌，白色柱子代表副豬嗜血桿菌圖5:250bp片段上下游通用？1物比例優化雜交信號分析橫坐標表示引物比例，縱坐標表示雜交信號強度，黑色柱子代表多殺性巴氏桿菌，白色柱子代表胸膜肺炎放線桿菌圖6:終選探針與對應參考菌林PCR靶標的特異性雜交1:腸道沙門菌；2:大腸桿菌；3:多殺性巴氏桿菌；4:胸膜肺炎放線桿菌；5:副豬嗜血桿菌；6:豬放線桿菌；7:豬鏈球菌；8:表皮葡萄球菌；9:豬肺炎支原體；10:產氣莢膜梭菌；11:支氣管敗血波氏桿菌；12:大腸桿菌；13:空腸彎曲菌。圖7:豬肺炎支原體探針(上)和胸膜肺炎放線桿菌探針(下)靈敏度實驗圖8-1:芯片的特異性評價，實驗菌為表l中部分非目標相關參考林的檢測結果l-金黃色葡萄球菌，2-獸疫鏈球菌，3-鼠傷寒沙門氏菌，4-豬放線桿菌，5-絲狀支原體絲狀亞種，6-豬丹毒絲菌，7-假單胞菌，8-變形桿菌圖8-2:芯片的特異性評價為部分臨床分離林的檢測結果1:支氣管敗血波氏桿菌；2:多殺性巴氏桿菌；3:副豬嗜血桿菌；4:大腸桿菌；5:豬鏈球菌；6:空腸彎曲菌；7:產氣莢膜梭菌；8:腸道沙門菌；9:豬肺炎支原體；10:大腸桿菌；11:胸膜肺炎放線桿菌；12:大腸桿菌。圖9:大腸桿菌和胸膜肺炎放線桿菌探針重復性和4。C保存期實驗l和4:4'C保存3天的芯片；2和5:4'C保存3個月的芯片；3和6:4。C保存6個月的芯片。具體實施例方式主要試劑API生化試劑盒為法國生物梅里埃公司產品TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker(DL2000,MarkerIII)、細菌基因組提取試劑盒均為北京天根生化科技有P艮公司產品。Tris堿、RNaseA、蛋白酶K為Promega公司產品。瓊脂糖凝膠染料Goldview為賽百盛公司產品。醛基片(Telechem)曱酰胺、SDS主要儀器設備PixSys5000芯片點樣儀(CartesianTechnologies,Irvine,CA)芯片掃描儀GenePix4000B(AxonInstrument)梯度PCR儀Eppendorf公司產品。制冰機Grant公司產品。Power-PAC200電泳儀Bio-RAD公司產品。超凈工作臺北京半導體設備一廠生產。DYY-III型電泳槽北京市六一儀器廠生產。GelDoc2000凝膠成像系統Bio-RAD公司產品。5415D臺式離心機Eppendorf公司產品。5804R臺式冷凍離心機Eppendorf公司6131型核酸測定儀Eppendorf公司產品。D-1型自動蒸汽滅菌鍋北京發恩科貿有P艮公司生產。試驗菌林探針篩選用的13個參考菌抹(見表1中帶星號的菌抹)表皮葡萄球菌(S.epi)、葛'J豬嗜血桿菌(Hps)、胸膜肺炎放線桿菌(App)、多殺性巴氏桿菌(Pm)、豬it線桿菌(A.suis)來自澳大利亞昆士蘭州動物研究所，支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、產氣莢膜梭菌(Clp)、腸道沙門菌(SE)、豬鏈球菌(S.suis)、2林大腸桿菌(E.coli)來自中國獸醫微生物菌種保藏中心，豬肺炎支原體菌抹(Mhp)來自美國康奈狄格大學病理生物學系，空腸彎曲菌(Cj)DNA來自丹麥技術大學獸醫學院。芯片特異性評價用的另外33個參考菌林來自澳大利亞昆士蘭州動物研究所、中國獸醫微生物菌種保藏中心、美國康奈狄格大學病理生物學系、中國醫學微生物菌種保藏中心(表l)。芯片特異性和臨床檢驗評價用的61個臨床分離菌林中44株來自本實驗室、17林來自江西農業大學動物科技學院、江蘇省農科院獸醫研究所和哈爾濱獸醫研究所。上述菌林在本實驗室均有保存，公眾在各菌林的原保存中心或實驗室不能獲取時，本實驗室可向其發放，作驗證實驗使用。表l本試驗使用的參考菌株菌抹菌林編號**來源目標細菌*WF83,4074，K17，CVJ13261，D13039,56153，1096*腦249*55，587,1045,1046*NR4,HS145，SW124，HS197,C5,IA-84-17975,SD-84-15995*ARIS印i*ATCC19395,ATCC4617*CVCC83901,*CMCC44439H425,ARIARIARIARIARIARI,CVCCCVCC10Sf豐oco飽"由"5607,55604CVCCC/ayfrWwn;er/"'"gera*CVCC43,CVCC2041CVCC嶺cop/os,tyopwew脂m'ae*ISU232，VPPll，PurdueDBUCCa，涵c欣勿'w"z'*ATCC11108(DNA)VDTU相關細菌爿"i"o6fi("7/ws/wrcfwwsCCUG38924ARI勿^wfta"7/wszWo/ic船CCUG39029ARIe"&r/caserovarATCC25241DBUCtyphimurium鄉c一as/MDBUC"co/cfeMycop/a5TOatfo;arATCC27140DBUCM戸i/a應/z戸/油NCTC10130CVCCr/ran'o;a/toweCVCC43028CVCCS一.做歸ATCC6538CVCC浙印.e拜'邵.zoo印/tifew/cw51CVCC55138CVCCi^ewtfo,wasaerag/wwaCMCC10110CVCCZ/efe/e/to./we臓om'ae46117CMCCJVo她w/油.脂49005/9CMCC*該菌抹用于探針篩選**ARI:澳大利亞昆士蘭州動物研究所，CVCC:中國獸醫微生物菌種保藏中心，DBUC:美國康奈狄格大學病理生物學系，CMCC:中國醫學微生物菌種保藏中心，VDTU:丹麥技術大學獸醫學院。實施例1.基因芯片特異性探針的設計步驟1:目標細菌的23SrRNA序列比對分析從Genbank收集12種目標致病菌的23SrRNA全基因或接近完全的基因序列108條(個別細菌可用的序列太少，本實驗室測序了6條提交給Genbank。A.suis無奈只有我們提交的一條序列)。對108條序列按種建庫，用DNAStar軟件的clustalW程序進行比對，選出每種細菌的代表序列1或2條(共14條)，其中表皮葡萄球菌(S.epi)的代表序列登錄號為CP000029、副豬嗜血桿菌(Hps)為AB303974、胸膜肺炎放線桿菌(App)為NC009053、多殺性巴氏桿菌(Pm)為NC002663、豬i文線桿菌(A.suis)為EU333989，支氣管敗血波氏軒菌(Bb)為NC—002927、產氣莢膜梭菌(Clp)為NC—008621、腸道沙門菌(SE)為EU146942和SEU77919、豬鏈球菌(S.suis)為NC—009442、大腸桿菌(E.coli)為BA000007和EU146962,豬肺炎支原體菌林(Mhp)為X68421,空腸彎曲菌(Cj)為NC—003912對這14條序列進行比對，找出它們的保守區和變異區。利用Biosun2.0軟件(軍事醫學科學院基礎醫學研究所計算生物學中心)，在變異區對每種細菌的序列數據庫設計各自的種特異性探針。共設計了12種細菌的36條種特異性候選探針,分布在23SrRNA序列的2個變異區域。設計出的探針先后用Biosun2.0軟件的BLAST工具和Genbank的BLAST工具進行檢索，同時按照寡核苷酸探針設計的一般原則進行微調，盡量使每種細菌的探針序列與他種細菌的23SrRNA序列的同源性小于75%,探針連續同源的堿基數S18個，使各探針的Tm值相差不過15°C、GC含量在50-70。/。、探針長度接近、避免單一堿基連續重復5次以上、探針分子內部互補堿基少于6bp。對備選探針進行篩選時，各種參數盡量控制在最佳范圍，以保證打印在同一張芯片上的^笨針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果。步驟2:通用引物的設計借助PrimerPremier5.0軟件在設計出的上述36條候選探針序列的2個變異區域外側的保守區設計了2對通用引物。12種目標細菌的14條代表23SrRNA序列的Bios皿2.0比對結果設計出的2對通用引物位置標記見圖1和表2。表2.兩對PCR通用引物引物序列(5'—3，)產物長度位置*上游通用引物AACDGGTTRATATTCC550bp1385-1400nt23S-F1下游通用引物GCTACCTTAGGACCGTTAT1918-1936nt23S-R1上游通用引物GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA250bp212-233nt23S-F2下游通用引物TGGTTCACTATCGGTCAATCAG438-459nt23S-R2*以胸膜肺炎放線桿菌為參考序列，GenBank檢索號為NC—009053。表2的通用引物由賽百盛生物技術公司或軍科院放射所合成，下游通用引物的5'端用熒光染料Cy3進行了標記。12步驟3篩選探針以12種目標細菌的參考菌林(表1中帶星號的13個菌抹)的基因組DNA為模板，用步驟2中的通用引物分別進行PCR擴增，然后將其產物分別與雜交液混勻后與點有36條候選探針的基因芯片雜交、掃描及結果分析，扣除背景值，以探針的特異性和熒光信號的強度值(熒光信號強度由強到弱分別為白色，紅色，黃色，綠色)作為最終篩選探針的指標。結果從36條候選探針中選出13條探針(大腸桿菌有2條)，作為該仔豬常見致病菌基因芯片的終選探針(表3)。終選探針與對應參考菌抹PCR靶標的特異性雜交結果見圖6。表3.仔豬常見致病菌檢測基因芯片終選探針序列OrganismsProbesequence(5'-3，)GC%Tm(°c)Length(nt)GenbankAccessionno.A.suis-lATAGCAGTAGACACAGAAGAACGAGC46.260.926EU333989App-lAGTGATAATGGTTTTGTTAGGAGAAT30.857.726NC—009053Pm-4CCGTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAA40.064.630NC—002663Hps-4GTAGGTTGTAAGAGTATACCTCCGA44.056.625AB303974S.suis-lTAAGCAGTGAGGTGTGATATGAGTC44.058.225NC—009442Bb國lATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGGTG56.071.325NC_002927S.epi-3GTTTCCTCGAGTCGTTGATTTCACAC46.265.426CP000029C.jejuni-lGGATAGAAGAACCCCTGATGCCGTC56.068.325NC—003912Clp-2AACCGAAG丁ACATGATTCCACGCTGCCA50.074.128NC—008261Mhp墨3AGTACCGAATTAAATGACTCTCTGTT34.657.726AE017332SE-1CACGTAGGTGAAGTGATTTACTCATG42.360.326SEU77919E.coli-2GTAGGTGAAGCGACTTGCTCGTGGA56.068.825EU146962E.coli-4GCTGATATGTAGGTGAAGTCCCTCGCGG57.172.228EU146962特異性探針由專業公司采用標準亞磷酰胺化學方法在自動合成儀(ABI8909)上合成。全部的特異性探針在3'端進行氨基修飾，M基團與探針序列之間以間隔臂聚乙二醇磷酰化試劑相連，以排除雜交時的空間位阻來提高雜交熒光信號的強度。合成完畢后，用濃氨水55。C作用15小時脫保護/切割，用OPC柱純化后用紫外分光光度計定量，凍存備用。步驟4制備低密度的基因芯片將100^M的探針序列用2x點樣液(6xSSC,0.1°/。SDS)稀釋至終濃度50^M,取6pl轉移至384孔板。用PixSys5000芯片點樣儀(CartesianTechnologies,Irvine,CA)將探針點到醛基片(Telechem)上,每點體積約為0.5nl，點心間距為500^m，點直徑約為200nm，點樣時保持濕度卯°/。，溫度23'C。點樣后的芯片在使用前于室溫放置至少24h，然后4。C保存待用。終選探針在芯片上的布局見表4。芯片為7x8方陣，每條探針重復點3次。芯片上還點有定位標記鏈(Cy3標記的下游通用引物23S-R1andR2的反向互補鏈序列)、陽性對照探針(PP,未標記的下游通用引物23S-R1的反向互補鏈序列)、陰性對照探針(NP，未標記的一段植物基因序列)和空白對照(滅菌雙蒸水)。表4.終選13條探針的矩陣圖<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2.引物通用性檢驗步驟l.提取DNA取表1中12種目標細菌(即表1帶星號的參考菌抹)的適量培養物，用天根公司細菌基因組試劑盒提取細菌基因組DNA。DNA經紫外分光光度計測定純度及濃度，用lng/nlDNA做PCR。或用煮沸法獲得粗制DNA:取細菌懸液，12，000rpm離心2分鐘，倒凈上清或4兆取菌落，加100400nl雙蒸水震蕩懸浮，OD600為1.0-2.0,置沸水浴中煮沸或金屬浴95-100'C加熱10-15分鐘，水浴10分鐘，12,000rpm離心2分鐘，取2^1上清為PCR模板。分別用每對實施例1設計的通用引物對12種致病菌的DNA做常規單重PCR,驗證通用引物的通用性。反應體系上下游通用引物各1nl(0.4uM)、dNTP2pl(200uM)、模板1-2jil、Taq酶1U、10xBuffer2.5pl、MgCl21.5^1(1.5mM),滅菌去離子水補足至25jil。PCR的反應程序94°C/5min;94。C/30s、54°C/30s、72。C/30s,循環30次；72。C延伸8min。PCR結果見圖2、圖3。第一對通用引物能擴增所有12種細菌的13個樣品，第二對通用引物能擴增7種細菌的8個樣品，說明兩對通用引物聯合擴增具有預期的通用性和針對性，后者擴增的7種細菌涵蓋了A.suis、App和Pm探針相對應的細菌。實施例3.優化擴增體系不對稱PCR的目的是通過多加熒光標記的下游通用引物，少加非熒光的上游通用引物獲得大量的單鏈PCR產物，增加PCR產物與單鏈探針雜交的效率。每對通用引物分別用2種致病菌的基因組DNA為模板進行了3次重復優化試驗。在PCR反應體系中將下游通用引物的終濃度固定為lpM,加入系列稀釋的上游通用引物，使其終濃度遞減(lpM、0.2(iM、O.lpM、0.05pM等)，即上下游通用引物比例呈1:1、1:5、1:10....1:60。兩對通用引物優化的結果為23S-F1:23S-R1為1:10,23S-F2:23S-R2為1:30。兩對通用引物之間的比例優化為1:1。兩對通用引物比例優化雜交信號分析結果見圖4和圖5。表5顯示優化后的PCR反應體系。表5.優化后的PCR反應體系組分體積(pl)終濃度10xPCR反應緩沖液(無MgCl2)dNTP23S—F1，F2(上游)23S—Rl，R2(下游)25mM的MgCl2溶液TaqDNA聚合酶模板DNA加滅菌雙蒸水至2.52lx200[iMO.lp,0.033,1.5mM1.5U1ng*25^1/反應管承模板DNA采用試劑盒提取的基因組DNA(濃度為lng/jil)。將上述各組分加入無菌離心管中，混勻、瞬時離心，PCR反應程序如下步驟溫度時間預變性95°C5min變性94°C30S退火40個循環53°C30S延伸72°C30S終延伸72°C5minHold4°C15實施例4芯片的敏感性評價雜交液含5xSSC、2.5%曱酰胺和0.2。/。SDS洗液A:含1xSSC和0.2°/。SDS洗液B:0.2xSSC洗液C:O.lxSSC步驟1.芯片預處理和PCR擴增實施例1制備的基因芯片用0.2%SDS清洗2次，接著以超純水清洗2次，晾干后用于雜交。用煮沸法提取豬肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌的基因組DNA,將起始濃度為10ng4U的DNA做IO倍系列稀釋至IOfg4d,以系列濃度的DNA為模板，采用實施例3的PCR優化程序及實施例l設計的通用引物進行PCR擴增。步驟2.雜交及雜交后處理步驟l擴增產物與實施例l獲得的基因芯片雜交PCR產物在98。C變性10min后冰浴10min,將變性的PCR產物與雜交液按1:4混勻，取IOpl轉移至芯片反應區，芯片置于雜交盒內，連同雜交盒浸入42。C水浴中反應60分鐘；雜交后的芯片依次在洗液A、洗液B和洗液C中于室溫各洗滌lmin。置室溫晾千。步驟3.雜交結果掃描芯片用芯片掃描儀GenePix4000B進行掃描，用GenePixPro4.0軟件分析結果。共聚焦掃描儀GenePix4000B(AxonInstrument)的參數設置激發波長540nm,發射波長570歸掃描，PMT為580,Power(%)為33,產生分析精度為10pm的16位TIFF圖像。雜交結果見圖7-l、7-2。芯片檢測豬肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌的靈敏度分別為IOpg/pl和兩fg/nlDNA。實施例5芯片的特異性和臨床分離^r驗以來自澳大利亞昆士蘭州動物研究所和中國獸醫微生物菌種保藏中心等單位的33林參考菌抹(表1中不帶星號的菌林)和來自患病仔豬的61個臨床分離林培養物為樣本，用煮沸法制備粗提DNA為PCR才莫板，實施例1設計的通用引物擴增，擴增產物用實施例1制得的基因芯片進行雜交鑒定，雜交步驟同實施例4。芯片雜交結果顯示33份參考菌抹的基因芯片檢測結果與其菌林分類高度符合。圖8-1列舉了部分相關參考菌抹的檢測結果，其中鼠傷寒沙門氏菌為腸道沙門菌內的一個血清型，與腸道沙門菌探針呈陽性反應是正確的，它通常不是豬的感染菌或污染菌；金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌探針呈陽性反應，它通常也不是豬的感染菌或污染菌。獸疫鏈球菌與豬鏈球菌探針呈陽性反應，因為獸疫鏈球菌是豬的另一種致病菌，所以有意忽略區分這2個種。圖8-2列舉了臨床分離抹與芯片的雜交結果，61個臨床分離抹芯片檢測結果與API生化或測序結果基本一致，有1份測序為腐生葡萄球菌的樣品與表皮葡萄球菌探針雜交，2份API生化確認的陰溝腸桿菌和2份API生化確認的產氣腸桿菌與大腸桿菌探針雜交。分析原因，腐生葡萄球菌23SrRNA序列上有與表皮葡萄球菌探針完全一致的序列，所以二者分不開；GenBank里沒有陰溝腸桿菌和產氣腸桿菌的23SrRNA,不知是否與大腸桿菌探針序列相近，生化試驗表明它們是大腸桿菌的近親，是人醫院常見的污染菌和條件致病菌。因此，遇到大腸桿菌探針檢測陽性時，需要具體分析，或進一步鑒定其是否具有致病性大腸桿菌的毒力基因。從上述的臨床樣本驗證實驗中，說明本實驗所建立的方法比較準確、可靠，對于一些檢測呈陽性的菌種，由于該菌種下菌林中存在非致病菌，因此需要進一步具體分析是否是致病菌抹。總體而言，本發明提供的基因芯片攜帶12種致病菌菌種的特異性片段，覆蓋了目前大多數仔豬致病菌，可以應用于臨床仔豬感染致病菌的鑒定或篩查，指導臨床用藥，達到快速控制疫病的目的。實施例6芯片的重復性和保存期評價用4'C保存了3天、3個月和6個月的3批芯片各取一張檢測豬大腸桿菌和巴氏桿菌探針與相應PCR樣品的雜交效果，步驟同實施例5，從信號強度看，不同批次和保存時間的芯片重復性好，檢測效果穩定，見圖9。附錄SEQUENCELISTING<110>北京市農林科學院<120>—種檢測仔豬常見致病菌的基因芯片、試劑盒及方法<130>P09356/NLK<160>17<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>豬放線桿菌探針<400>1atagcagtagacacagaagaacgagc26<210>2<211>26<212>DNA<213>胸膜肺炎放線桿菌探針<400>2agtgataatggttttgttaggagaat26<210>3<211>30<212>DNA<213>多殺性巴氏桿菌探針<400>3ccgtactcgaaagtatgttagtggaactaa30<210>4<211>25<212>DNA<213>副豬嗜血桿菌探針<400>4gtaggttgtaagagtatacctccga25<210>5<211>25<212>DNA<213>豬鏈球菌探針<400>5taagcagtgaggtgtgatatgagtc25<210>6<211>2518<212>DNA<213>支氣管敗血波氏桿菌探針<400>6atgaaggggtcgcagagaatcggtg<210>7<211>26<2I2>DNA<213>表皮葡萄球菌探針<400>7gtttcctcgagtcgttgatttcacac<210>8<211>25<212>DNA<213>空腸彎曲菌探針<400>8ggatagaagaacccctgatgccgtc<210>9<211>28<212>DNA<213>產氣莢膜梭菌探針<400>9a3ccg3agtacatgattccacgctgcca<210>10<211>26<212>DNA<213>豬肺炎支原體菌株探針<400>10agtaccgaattaaatgactctctgtt<210>11<211>26<212>DNA<213>腸道沙門菌探針<400>11cacgtaggtgaagtgatttactcatg<210>12<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌探針l<400>12說明書第16/17頁2526252826gtaggtgaagcgacttgctcgtgga<210>3<211>28<212>DNA<213>大腸桿菌探針2<400>13gctgatatgtaggagaagtccctcgcgg<210>14<211>16<212>DNA<213>通用引物23S-F1<400>14aacdggttratattcc<210>5<211>19<212>DNA<213>通用引物23S-R1<400>15gctaccttaggaccgttat<210>16<211>22<212>DNA<213>通用引物23S-F2<400>16gaggaaaagaaatcaaccgaga<210>17<211>22<212>DNA<213>通用引物23S-R2<400>17tggttcactatcggtcaatcag說明書第17/17頁252816192權利要求1.一種檢測仔豬致病菌的基因芯片，其特征在于芯片基質上設置有仔豬致病菌的23SrRNA特異性探針序列，所述仔豬致病菌及其23SrRNA特異性探針序列如下豬放線桿菌(A.suis)，ATAGCAGTAGACACAGAAGAACGAGC；胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)，AGTGATAATGGTTTTGTTAGGAGAAT；多殺性巴氏桿菌(P.multocida)，CCGTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAA；副豬嗜血桿菌(H.parasuis)，GTAGGTTGTAAGAGTATACCTCCGA；豬鏈球菌(Strep.suis)，TAAGCAGTGAGGTGTGATATGAGTC；支氣管敗血波氏桿(Bordetellabronchiseptica)，ATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGGTG；表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，GTTTCCTCGAGTCGTTGATTTCACAC；空腸彎曲菌(Campylobacter.jejuni)，GGATAGAAGAACCCCTGATGCCGTC；產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)，AACCGAAGTACATGATTCCACGCTGCCA；豬肺炎支原體菌株(Mycoplasmahyopneumoniae)，AGTACCGAATTAAATGACTCTCTGTT；腸道沙門菌(Salmonellaenterica)，CACGTAGGTGAAGTGATTTACTCATG；大腸桿菌(Escherichiacoli)，GTAGGTGAAGCGACTTGCTCGTGGA；和/或大腸桿菌(Escherichiacoli)，GCTGATATGTAGGAGAAGTCCCTCGCGG。2.根據權利要求l所述的基因芯片，所述芯片基質采用固相載體醛基化玻片。3.—種檢測仔豬致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于包括如下兩組寡核脊酸(1)權利要求l所述的基因芯片；(2)如下兩對通用引物23S-Fl:5'AACDGGTTRATATTCC3',23S-R1:5'GCTACCTTAGGACCGTTAT3';23S-F2:5'GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA3',23S-R2:5'TGGTTCACTATCGGTCAATCAG3',所述23S-Rl與23S-R2的5'端用Cy3熒光標記。4.根據權利要求3所述的試劑盒，還包括除通用引物和DNA芯片之外的PCR試劑和雜交液，雜交液的成分為5xSSC、2.5%曱酰胺和0.2%SDS。5.根據權利要求3所述的試劑盒，還包括PCR陰性對照模板和陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水，所述陽性對照模板為權利要求l所述的基因芯片上設置的任一種23SrRNA特異性探針序列所屬的致病菌的基因組DNA。6.—種檢測仔豬致病菌的基因芯片方法，包括如下步驟(1)提取待測菌的基因組MA,(2)用權利要求3-5所述的任一試劑盒中所包括的通用引物擴增待測菌的基因組DNA。(3)擴增產物與權利要求l所述的基因芯片雜交，(4)雜交后處理及掃描結果。7.根據權利要求6所迷的方法，所述通用引物擴增待測菌的基因組DM的PCR體系中，所述通用引物的終濃度比為23S-M:23S-Fl等于10，23S-R2:23S-F2等于30;8.根據權利要求6所述的方法，所述步驟(2)前先對所述基因芯片進行如下預處理用0.2%SDS清洗2次，接著以雙蒸水清洗2次，晾干后用于雜交。9.根據權利要求6所述的方法，所述雜交步驟如下擴增產物變性98'C10min后，冰浴10min,將變性的擴增產物與雜交液體積比l:4混勻，取IOW轉移至芯片反應區，將芯片置于雜交盒內，連同雜交盒浸入42'C水浴中反應60min。10.根據權利要求6所述的方法，所迷雜交后處理步驟為雜交后的基因芯片依次在洗液A:1xSSC,0.2%SDS、洗液B:0.2xSSC和洗液C:0.1xSSC中于室溫各洗滌lmin。全文摘要本發明提供一種“檢測仔豬常見致病菌的基因芯片、試劑盒及方法”，屬于動物醫學診斷領域。所述基因芯片上設置有仔豬致病菌的23SrDNA特異性探針序列，能夠檢出多種仔豬致病菌菌種下屬的多種致病菌株；本發明還提供兩對通用引物，與基因芯片共同組合成檢測試劑盒，通過通用引物擴增待測菌，一方面能數倍擴大其模板濃度，提高芯片檢測靈敏性，另一方面，通過通用引物擴增過程獲得的熒光標記片段與芯片探針結合的特異性明顯高于芯片直接雜交待測菌DNA；本發明還提供上述通用引物和芯片的使用方法。本發明的基因芯片、試劑盒及檢測方法為及時檢測出致病菌種類，預防仔豬疫情蔓延提供了一種實用方便的工具。文檔編號C12Q1/68GK101638687SQ200910091528公開日2010年2月3日申請日期2009年8月26日優先權日2009年8月26日發明者伍誠意,周宏專,季海峰,曹峰子,兵楊,梁之昶,章振華,陳小玲申請人:北京市農林科學院