專利名稱：：Dna分子片段與載體連接的方法及在大容量抗體庫構建中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種DNA分子片段與載體連接的方法及其在大容量抗體庫構建中的應用。
背景技術：
：DNA分子連接一直是重組質粒構建過程的關鍵環節，由于連接效率的限制，使得一些重組克隆的獲得較為困難，尤其在構建各類DNA分子庫的過程中，連接效率尤為重要。因此，提高連接效率對于提高轉座子數量具有重要意義，尤其是在通過基因工程手段構建包括抗體、多肽和各種其他蛋白質文庫的過程中具有重要意義。近年來，利用噬菌體抗體庫技術制備各種診斷和治療性抗體已經成為目前基因工程抗體領域一個重要的技術手段，而其基礎依賴于各種類型的大容量抗體庫資源的存在。抗體庫庫容量和質量是決定是否能夠獲得高親和力目標抗體的關鍵。近年來，國外已經利用各種優化的技術構建了一些大容量抗體庫，并從中獲得了許多有開發前景的抗體分子，目前已經有多株抗體進入臨床實驗。其中有代表性的大容量抗體庫主要是AG公司的HuCALGOLD⑧庫和CAT公司的CAT⑧抗體庫，這兩個抗體庫的庫容量均已經超過了101()，并且目前仍在繼續擴建，利用這兩個抗體庫目前已經制備出多種治療性抗體進入臨床前和臨床研究階段。從技術上講，制約大容量抗體庫構建的關鍵因素主要是連接和轉化的效率。高效的連接和轉化技術是構建大容量抗體庫的前提和保證。Sheet等人W從PCR條件、克隆用酶切位點的選擇、載體特點等方面進行條件的優化，以提高連接的效率，并通過多次電轉化使庫容量達到6.7xl09。也有人對抗體基因克隆的方法進行改進，采用兩步克隆甚至三步克隆法來實現大容量抗體庫的構建[2]。電擊轉化是目前最高效的轉化方式，經過多次電轉化積累庫容量是實現大容量的必要途徑。而對于單次電擊轉化而言，感受態細胞的質量、連接產物的大小與質量、連接產物的濃度及電擊緩沖液的組成等都是影響轉化效率的重要因素。連接效率不僅決定了正確連接產物的比例，同時連接產物的質量還直接影響電擊轉化的效率，提高連接效率和連接產物的質量將極大提高轉化的效率，減少轉化的次數。普通的連接不僅效率低，而且連接產物成分復雜，其中的非正確連接的載體和片段將對電擊轉化效果造成干擾。以一個普通的雙酶切連接為例，連接體系最終的連接產物包括以下幾種形式載體二聚體和多聚體、片段二聚體和多聚體、載體和片段線性連接體及正確的載體與片段環狀重組載體。因此，普通連接產物不論是正確連接產物的比例還是在成分的復雜程度上都很難達到高效電擊轉化的要求。也有研究通過首先構建初級庫進而對其通過重組技術進行擴建的例子，利用這種方法構建抗體庫可以繞過大量電擊轉化的瓶頸，通過不同抗體分子間輕重鏈重組的方法實現抗體多樣性的增加，例如，Sblatten)W等人利用Cre-loxp重組的方法構建了庫容量達1011以上的大容量抗體庫。然而，由于這種方法所構建的抗體庫僅僅是通過輕重鏈互換的方法擴大庫容量，而在CDR區的多樣性上存在不足，因此具有一定的缺陷。
發明內容本發明的目的是提供一種高效的DNA分子片段與載體連接的方法及其在大容量抗體庫構建中的應用。連接和轉化是構建包括抗體和多肽在內的各種大容量蛋白質文庫的過程中一個限制性的技術。最終所獲得的庫容量的大小直接取決于通過轉化所獲得的轉座子的數目。而其中連接產物的質量和正確連接產物的數量是影響轉化效率進而影響庫容量的關鍵。高效連接影響5因素涉及載體的性質、限制性內切酶的酶切與回復連接的效率、載體與目的基因的比例、連接體系的濃度等因素。從DNA分子角度上講，雙酶切連接過程實際上可以分解為兩個過程，首先是DNA分子兩片段之間的單酶切位點連接，形成線性連接產物，這一過程可認為是分子間連接，其次是線性連接產物的分子內連接，即線性連接產物的自身環化過程。而分子間和分子內連接的最佳的實驗條件不同，對于分子間連接而言，一方面需要增加分子間碰撞的機會，另一方面需要降低同片段間自連的比例；對于分子內連接而言，則需要降低分子間碰撞接觸的機會，同時增加分子內自連接的比例。普通雙酶切連接無論如何優化條件都無法將兩個過程分開實現每一步的連接條件的最優化處理，因此連接效率一般很低，最高只有百分之十幾。因此，設計將兩步連接過程分開進行，可實現每一步連接的最優化處理，從而可以提高總體連接效率。故而，本發明的技術方案提供一種DNA分子片段與載體連接的方法，載體上包括至少三個不同的酶切位點El、E2和E3，其中E2位于El和E3之間；待連接的DNA分子片段至少包括酶切位點El和E3,先對載體上酶切位點El和E2進行酶切和去磷酸化；再對DNA分子片段的酶切位點El進行第一步酶切和連接，得到DNA分子片段和載體的線性連接產物，然后回收正確大小的連接產物；最后對連接產物的酶切位點E3進行第二步酶切和連接，得到自連接的環狀連接產物。由于第一步連接產物經過了膠回收處理，去除了非正確連接體的干擾，因此在第二步回復連接的產物中沒有其他雜分子的干擾，更利于之后的電擊轉化。E2位點的作用在于減少由第一步酶切后載體分子間發生連接的比例，即通過首先對載體用El和E2進行酶切和去磷酸化處理，可以減少載體分子間的反向連接，從而降低載體的自連。本發明的方法，其中所述酶切位點E1、E2和E3可選自載體上已有的常用的限制性內切酶的酶切位點，如Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、BsaI、BseYI、DraIII或EarI等中的任意一種。其中優選酶切效率和恢復連接能力強的限制性內切酶。也可以通過引入的方式將需要的包含有酶切位點的序列插入至已知序列的載體中，對載體進行一定程度的改造，以獲得更易操作、效果更好的連接載體。本發明的方法，其中所述酶切位點E3更優選為Sfil、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI等酶切位點，因為其具有非反向回文結構，而大部分限制性內切酶為反向回文結構，如BamHI(AGGCCT)，這類酶切位點在連接時沒有方向性，因此更容易形成相同分子間的連接，從而導致正確連接比例降低，而SfiI等一類具有非反向回文結構的內切酶則對連接有方向性要求，更容易形成正確連接。本發明El最優選NotI酶切位點，E2最優選EcoRI酶切位點，和E3最優選SfiI酶切位點。本發明的方法，其中第一步連接體系中的DNA濃度控制在30-40ng/pL,第二步連接的DNA濃度控制在1.5-2.5ng/|aL。本發明的方法，為彌補第二步酶切和連接所導致的產物量的損失，在第一步連接之后還可以包括通過PCR的方法對連接產物進行一定量的擴增，以保證后期連接產物的產量。為了減少PCR擴增可能導致的克隆偏向性和基因突變，我們選擇了保真度高的DNA聚合酶，如UltrapfU，同時將PCR的循環數控制在15個循環以內，以確保抗體庫的基因多樣性和正確性。本發明的方法，為了去除連接緩沖液對電擊轉化的影響，還包括對最后得到的連接產物進行超濾處理實現產物的濃縮和緩沖體系交換，將連接產物濃度提高到100ng/nL以上并最終溶于電擊緩沖液中。本發明利用兩步連接的方法實現了單鏈抗體基因同載體之間的高效連接，與普通的雙酶切連接相比，連接效率從原來的白分之十幾提高到30%以上。同時，由于最終的連接體系中去除了大量非正確連接的小分子和其他組分，使電擊轉化的效率得到提高。本發明利用兩步連接的方法構建了大容量全合成人源性噬菌體抗體庫，該抗體庫由12個子庫組成，總庫容量達1.35xl01、上述技術方案具有如下優點該方法能夠實現DNA分子片段與載體之間有效的連接，降低了非正確連接的不同形式聚合體的產生，使正確連接產物的比例在連接體系中占到30°/。以上，并且連接產物中成分簡單，無小分子片段，對電擊轉化的干擾成分較少，有利于實現高效的電擊轉化。經一步純化后，連接產物電擊轉化的產出克隆達到同等量質粒的30%~50%,進一步說明連接產物的比例試驗數據可靠。該方法在抗體庫、肽庫和其他蛋白及cDNA文庫的構建中能夠實現目的基因和載體間的高效和高質量連接，連接產物適合構建各種大容量蛋白質文庫。圖l是本發明實施例噬菌體展示載體PHB-pIX-EcoRl質粒示意圖2是本發明實施例CDR3區Klenow酶反應產物2%瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M:DNA分子量Marker;15:Klenow酶反應產物；圖3是本發明實施例抗體輕鏈/重鏈基因拼接過程示意圖4是本發明實施例抗體基因輕重鏈拼接及擴增產物1%瓊脂糖電泳圖，其中1:輕鏈基因擴增產物；2:輕鏈基因拼接產物；3:重鏈基因拼接產物；4:重鏈基因擴增產物；M:D2000DNAMarker;圖5是本發明實施例單鏈抗體基因拼接及擴增產物1%瓊脂糖電泳圖，其中1、3:拼接產物；2、4:擴增產物；M:D2000DNAMarker;圖6是本發明實施例單鏈抗體與載體第一步連接產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1:連接前片段；2:連接前載體；3、4:連接后產物；M:XDNA/EcoRI+HindIIIMarkers;圖7是本發明實施例單鏈抗體與載體連接產物的PCR擴增產物1%瓊脂糖電泳圖，其中1:UltrapfU擴增單鏈抗體與載體的連接產物；2:LA-taq擴增單鏈抗體與載體的連接產物；3:pfb擴增單鏈抗體與載體的連接產物；4:入DNA/EcoRI+Hind111Markers;圖8是本發明實施例不同連接條件下連接產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖，其中l:連接產物(lng4iL);2:連接產物(2ng4iL);3:連接產物(3ng4iL);4:連接產物(4ng/jiL);5:連接產物(5ng/jaL);6:普通連接產物；7:連接前片段；M:XDNA/EcoRI+HindlllMarkers;圖9是本發明實施例菌落PCR鑒定PHB-pIX-scFv抗體庫基因插入率PCR產物1%瓊脂糖電泳圖，其中lane1~lane10,lane11lane20:PCRproductsofscFvgene;M:XDNA/EcoRI+HindlllMarkers。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。本發明以大容量全合成噬菌體單鏈抗體庫的構建為具體實例，目的在于提供一種高效的兩步酶切和連接的方法，該方法可用于構建多種大容量抗體庫和其他蛋白質文庫。1、本發明所用的連接載體PHB-pIX-EcoR的構建PHB-pIX展示載體(如圖l)是在實驗室保存的基于噬菌體外殼蛋白pIX蛋白展示載體PHB1HCSFV的基礎上改造而成，該載體來源于噬菌體展示載體pAK600。首先從輔助噬菌體M13K07中調取pIX蛋白編碼基因(99bp)，利用酶切位點NotI和HindIII克隆入PHB1HCSFV中，替換pIII蛋白基因；其次，在展示蛋白pIX編碼基因下游約80bp處利用酶切位點HindIII和BamHI插入39bp的Cre-Loxp重組位點Loxp-wt，以便用于抗體庫的Cre-loxP重組；另外，為減小質粒的大小，以更便于進行電擊轉化，將原質粒Lac啟動子上游的約lOOObp的Lacl基因敲除，該基因具有抑制下游scFv抗9體基因滲漏表達的作用，我們利用菌株TG1本身的Lacl基因及培養基中添加Lac啟動子抑制劑葡萄糖的方法代替載體上Lacl基因的作用。最后，在scFv基因克隆位點SfiI和NotI之間插入一段41bp的序列，代替原載體中的一段無關的scFv序列，序列中在SfiI下游26bp中含有一個EcoRI酶切位點。改造后的載體為2800bp,可以實現不同單鏈抗體間的輕重鏈重組，同時由于酶切位點EcoRI的引入，更方便于利用兩步連接的方法實現單鏈抗體的克隆及之后的高效的電擊轉化。2、抗體基因庫的制備2.1框架基因的選擇與合成本研究根據KnappikW等人的報道，逸捧Vk1、Vk3、V人l和VX3胚系基因家族為輕鏈框架序列，VH3、Vh4和VH5胚系基因家族基因為重鏈框架序列。設計了7條通用序列作為抗體框架，按照大腸桿菌密碼子使用規律將框架的氨基酸序列轉換為DNA序列，并人工合成該7條框架基因的DNA序列，將其克隆入pGEM-T載體中。合成重鏈框架基因時，分別在其上游引入輕重鏈間的Linker(63bp)，同時在輕鏈的上游引入酶切位點Sfil以便將抗體基因克隆入展示載體PHB-pIX。Vk1、Vk3、V人l和V人3基因序列見序列表SEQIDNo.14所示；VH3、Vh4和VH5基因序列見序列表SEQIDNo.57所示。2丄1CDR3的設計與合成本研究參考文獻和已知抗體序列，通過對輕重鏈CDR3氨基酸序列，尤其是關鍵位置的序列進行分析，使關鍵部位的氨基酸按設計比例引入，共設計合成33條半隨機引物，每條引物長約6070bp。將合成的引物利用下游小引物通過Klenow反應將其延伸為雙鏈，將33條引物按多樣性比例分組混合，每組總量為100pmo1。在50jliL體系中加入lOOpmol的CDR3引物，120pmo1下游反向小引物，體系于94°C熱變性5min后緩慢降至37°C,立即加入5|iL10xKlenowreactionBuffer,20UKlenowFragments,2|aLdNTP(10mM),并用無菌蒸餾水將體積補足至50pL。37。C反應30min，QiagenMini-EluteKit回收反應產物(見圖2)，稀釋100倍，紫外分光光度計進行定量。2.2輕重鏈基因庫的構建分別將雙鏈CDR3與相應的框架基因進行拼接，以獲得完整輕重鏈基因，具體方法如圖3所示。將克隆有輕重鏈框架基因的pGEM-T載體分別對其基因上游的SphI位點進行酶切，回收線性化載體，紫外分光光度計定量。將不同CDR3雙鏈按理論多樣性比例混合，然后同相應線性化質粒以一定比例混合，進行拼接延伸PCR反應。具體是在30|iL體系中加入3pL10xPfuBuffer,2pLdNTP(10mM),2.5UPfiiDNA聚合酶和相應的反應底物，先進行15cycles的拼接反應，之后將30pL體系分為3份作為模板，分別加入下游小引物KFR4、LFR4和HFR4，進行10個循環的PCR反應，膠回收PCR產物，分別獲得完整輕鏈和完整重鏈基因見圖4,其中重鏈的5'端含有25bp的輕鏈FR4區3，端序列和完整的輕重鏈Linker(63bp)編碼序列，可以實現輕重鏈間的拼接。2.3單鏈抗體基因庫的制備將輕重鏈基因以摩爾比為1:1的比例進行重疊延伸PCR反應。首先經過15個循環的拼接反應使輕鏈基因與重鏈基因拼接為完整的單鏈抗體基因，再以此產物為模板，用5'端引物PSL(為位于SfiI上游無關序列)和3'端引物3H3R進行擴增反應，得到完整的單鏈抗體基因，見圖5。同時通過引物3H3R添加酶切位點Notl，預期片段長度約為780bp。PSL5,-CAAACGATCACCACGACTGACTCGAC-3,,，如SEQIDNo.8所示；3H3R:5，-AGAGACATGCGGCCGCGCTCGACACGGTCACCAG-3,,如SEQIDNo.9所示。3、兩步連接中的第一步連接一基因片段與載體通過NotI連接將載體PHB-EcoR用EcoRI和NotI酶切，回收線性化質粒，并進行常規去磷酸化反應。將scFv基因庫用Notl酶切處理，兩者以摩爾比1:11丄5比例進行連接。體系濃度為30-40ng/pL,16。C連接3~4h。瓊脂糖電泳回收3700bp大小的連接產物PHB-pIX-scFv，如圖6所示。4、單鏈抗體與載體連接產物的PCR擴增由于下一步的酶切和連接會損失部分的樣品，為彌補樣品的損失，在獲得連接產物PHB-pIX-scFv后，利用PCR的方法對其進行補償，以獲得更多的連接產物。該環節在各種基因集和蛋白質庫的構建中對保障庫的多樣性非常重要。同時，為了避免不必要的重復擴增及克隆，PCR過程中盡量減少PCR的循環數，并優化引物序列，釆用高保真且適合長片段PCR的DNA聚合酶，如Ultrapfli,LATaq等。設計并合成PCR引物ccPCR:5，-GTAAGTCGCTGGTTGCAGTGTTGTGC-3',如SEQIDNo.lO所示；和PSL:5，-CAAACGATCACCACGACTGACTCGAC-3，，同SEQIDNo.8所示；其中ccPCR與載體PHB-EcoR上Sfil位點與EcoRI位點間序列互補，PSL為抗體基因5，端Sfil位點前序列。利用引物PSL與ccPCR，以連接產物PHB-scFv為模板按如下體系進行PCR反應。PCR條件為94。C30s，70°C30s，72°C5min,15cycles之后膠回收PCR產物。對幾種高保真DNA聚合酶的比較結果如圖7所示。利用PCR回收試劑盒對PCR產物進行純化并定量。成分加入量pIX-scFv50ng10xPCRBuffer續P4|nLPSLandccPCR0單x2UltrapfoDNA聚合酶H20補足至40nL125、環狀連接產物的制備在積累了充足的PCR產物后，要對其進行自身環化連接，獲得環狀連接產物。而在該環節，要盡量減少載體聚合體的形成，主要是通過降低體系中連接產物的濃度以降低其載體碰撞的機會從而降低分子間連接的幾率，提高分子內連接的幾率。我們對SfiI酶切后的產物進行回復連接，對連接體系中產物濃度與連接效率的關系進行了比較，結果如圖8所示。可以看到，與普通的兩步連接相比，連接產物的成分簡單、正確連接產物的比例可以達到30%以上，體系中沒有小分子片段的干擾，這一點對后期的高效轉化非常重要。并進行回復連接反應，體系中DNA濃度為1.5-3ngL。16°C連接過夜。于65°C作用30min將連接體系中的T4DNA連接酶滅活。分別用去酶柱處理以除去連接酶，用超濾柱處理以進行純化及濃縮(具體見Millpore使用說明書)。6、電轉化感受態的制備及電擊轉化制備大容量抗體庫挑取生長良好的TG1單菌落于SOB培養基中(無Mg2+),37°C培養過夜。次曰1%轉接于200rnL新鮮制備SOB培養基中(無Mg2+)。培養至OD6(K)nm=0.450.5時，4000rpm,4。C,10min離心收菌。冰冷無菌蒸餾水洗滌2次，冰冷10%超純甘油洗滌2次。重懸于2mL預冷電擊緩沖液中。將純化后的連接產物與200luL感受態混合，冰上作用2-5min，轉到預冷的電擊杯中。進行電擊轉化，參數為25|^F，2.5KF,200Q，電擊后迅速用23mLSOC培養液將菌懸起，37。C，150rpm培養lh。取部分進行適當稀釋涂板，計數克隆數，計算庫容量。剩余部分擴大體積至400mL,繼續37°C,200rpm培養至OD6Q0nm=0.8,離心收菌，重懸于15mL凍存液中，分裝于-70。C保存備用。通過多次電擊轉化，對不同框架抗體庫進行積累，總庫容量達到1.35xl(T(下表l),對抗體庫中克隆進行菌落PCR擴增，抗體基因插入率達到100%(見圖9)。隨機挑選100個克隆進行測序，抗體基因插入正確，且未發現重復克隆，表明抗體庫多樣性良好。表l:抗體庫各框架子庫及庫容量統計表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由以上實施例可以看出，本發明具體涉及通過對DNA分子連接過程的詳細分析，將普通雙酶切和連接過程拆分為兩個單酶切連接過程分別進行，并對每個過程的條件進行最優化處理，包括酶切位點的選擇、酶切位點保護堿基的數目、連接體系中各成分的濃度和比例等。同時釆用引入第三無關中間酶切位點的方法以減少載體聚合體的形成，采用優化的PCR方法彌補連接回收過程中產物的損失。兩步連接中第一步連接效率可到達50°/。以上，第二步連接效率達到30%以上，第二步連接過程中產物損失由一二步之間的PCR過程彌補。為保證連接產物多樣性和減少PCR導致的偏向性，對PCR過程進行優化和控制，以確保產物的產量和不必要的重復擴增。包括引物優化、高效高保真DNA聚合酶的選擇、循環數的控制等幾個方面。最終連接產物成分簡單、無小分子干擾，正確連接產物比例占30%以上。該兩步連接法可用于各種高效克隆的需要，用于通過基因工程手段構建包括抗體、多肽和各種其他蛋白質集合及其他生物分子集合，具有廣泛的通用性。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。參考文獻1.SheetMD，AmersdorferP，FinnemR,da/.Efficientconstructionoflargemon-immunephageantibodylibrary:theproductionofhighaffinityhumansingle-chainantibodiestoproteinantigens.ProcNatlAcadSciUSA.1998,95:6157-622.dehaardHJ,vanneerN，ReursA，fl/.Alargemom-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies.JBioChi.1999，274:18218-2304.KnappikA,GeLM，HoneggerA,etal.Fullysynthetichumancombinatorialantibodylibraries(HuCAL)basedonmodularconsensusframeworksandCDRsrandomizedwithtrinucleotides.JMolBiol.2000,296:57-86序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所〈120〉DNA分子片段與載體連接的方法及在大容量抗體庫構建中的應用<130〉KHP09112892.2<160>10〈170>Patentlnversion3.5<210>1<211〉320<212〉DNA<213>人工序列<400>1ca^ELCgettc3ccacgactgactcgacctagaactcatggcccagccggccatggccgata60tccagatgaccc3gagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggtgatcgcgtg3ccatta120cctgccgcgcgagcc鄉gcattagcagctatctggcgtggteitcagcag犯accgggta180犯gcgccg犯actgttaatttatgcggccagcagcttgcagagcggcgtgccgtcgcgtt240ttagcggctcgggttcgggcaccgattttaccctgaccatctcgagcttgcagccggagg300acttcgccacctactattgc320<210〉2<211〉342<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉2c肌acga/tcaccacgactgactcgacctag肌ctcatggcccagccggcc3tggCCggCC60cagccggccatggccgatatcgttctgactcaatctccggc犯ctctgtctctgtctccg120ggtg認gtgcaactctgtcttgtcgtgca"tctcagtctgtgagctctagttatctggca180tggtatcagcEi犯a6iccgggtcaggcaccgcgtctgctgatttatggtgcaagctctcgt240gc咖tggtgttccggcacgttttagtggtagtggtagcggcaccgattttactctgact300atctcgagtctgg肌ccggaggacttcgccgtgtactattgc342<210〉316<211〉323<212>諷<213>人工序列<400〉3caaacgatcaccacgactgactcgacctag犯ctcatggcccagccggccatggccgsta60tcgttctgactcaacctccgtctgtttctggtgcaccgggtcaacgtgttactattagct120gctctggcagctct3gcaatattggtagtaactatgttagctggtatcagcaactgccgg180gtactgcaccgaaactgctgatttatgataataaccagcgcccctcaggtgttccggatc240gttttagtggcagcaaaagcggt3CC3gCgctagtctggcaattactggtctgc犯agcg300gg3Ct3tt3Ctgc323〈210〉4<211〉317<212〉諷<213〉人工序列〈400〉4caaacgatcaccacgactgactcgacctagaactcatggcccagccggccatggccagct60acgaactgacccagccgccg鄉gtgtcggtggcgccgggtcagaccgcgcgtatcacct120gctcgggcgatgcgctgggcgata肌tacgcgagctggtatcagcagaaaccgggtc娜180caccggtgctggtgatttacg犯gattctaaacgcccgtctggcatcccgggiacgcttta240gcggctcgaattcgggcaacaccgcgaccctgaccattagCggC3CCC3g300鄉cggactattactgc317<210>5〈211〉357<212〉DNA<213〉人工序列<400〉5柳ggcggctcgaccataacgtatactatacgaagttatcgagctcgggc603gCg鄉tgC組tggtgga,cggtggcggtctggtgc鄉cgggtggcagcctgcgt120ctgagctgcgC3gCg3gCggcttcacctttagcagctacgcgatgagctgggtgcgcc服180gcaccgggtaaaggtctggaatgggtgagcgCg3tt6lgCggtagcggcggcagcacctac240ta_tgcggata_gcgtgaaaggccgttttaccatctcgcgtgataactcgaaaaacaccctg300tacctgcag3tgaacagcctgcgtgcggaagataccgcggtgtattattgcgcacgt357<210>6〈211〉354〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉6鄉ggcggctcgaccataacttcgtat犯tcgaagttatcg站ctcgggc603gCC郷tgC33Ctgcagg3朋gCggtCC3ggcctggtgaaaccctgagc120ctgacctgtaccgtgtctggcggtagcattetgctcttatt180ccacctg'gcaa鄉tctggaatggatcggttacatctattacagcggcag240aatccaagcctgaagagccgcgtgaccatc3gcgtcg3taccagc肌gaaCC3gttCSLgC300ctgaagctgagctctgtgaccgcagccgataccgcggtgtattattgcgc3Cgt354<210〉7<211〉357<212>函A〈213〉人工序列<400〉7卿ggcggctcgacca/taacttcgtataatgtatactatacgaagttatcgagctcgggc60agcgaagttcaactggttcaaagcggtgccaaxxaggcgaaagcctgaaa120attagctgcaaaggctctggttattcttttacctcttattggatcggctgggttcgccag180atgccaggt3aaggtctggaatggatgggtattatttatccgatacccgc240tattctccaagctttc郷gtcaggttactattagcgcagataaaagcatcagcaccgcc300tatctgcagtggagctctctgaaagccagcgateiccgccatgtattattgcgcacgc357<210>8〈211〉26<212>腿〈213>人工序列<400>8caaacgatcaccacgactgactcgac26<210>9<211>34〈212〉麗<213>人工序列<400>9agagacatgcggccgcgctcgacacggtcaccag34<210〉10<211>26<212>DNA<213>人工序列〈400>10gtaagtcgctggttgcagtgttgtgc2權利要求1、一種DNA分子片段與載體連接的方法，其特征在于，載體上包括至少三個不同的酶切位點E1、E2和E3，其中E2位于E1和E3之間；待連接的DNA分子片段至少包括酶切位點E1和E3，先對載體上酶切位點E1和E2進行酶切和去磷酸化；再對DNA分子片段的酶切位點E1進行第一步酶切和連接，得到DNA分子片段和載體的線性連接產物，然后回收正確大小的連接產物；最后對連接產物的酶切位點E3進行第二步酶切和連接，得到自連接的環狀連接產物。2、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位點El選自Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI酶切位點中的一種。3、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位點E2選自Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI酶切位點中的一種。4、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切位點E3選自Sfil、Notl、EcoRI、HindIII、BamHI、AlwNI、Bsal、BseYI、DraIII或EarI酶切位點中的一種。5、如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切位點E3為具有非反向回文結構的限制性內切酶位點，選自SfiI、AlwNI、BsaI、BseYI、DraIII或EarI中的一種。6、如權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，第一步連接體系中DNA的濃度控制在30-40ng/|iL，第二步連接的DNA濃度控制在1.5-2.5ng/pL。7、如權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，在所述第一步連接之后還包括通過PCR的方法對連接產物進行一定量的擴增。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR釆用保真度高的DNA聚合酶，同時將PCR的循環數控制在15個循環以內。9、如權利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對最后得到的連接產物進行濃縮和緩沖體系交換，將連接產物濃度提高到100ng/]iL以上并最終溶于電擊緩沖液中。10、權利要求l-9任一項所述的方法在構建抗體庫、肽庫和其他蛋白及cDNA文庫中的應用。全文摘要本發明公開了一種DNA分子片段與載體連接的方法，載體上包括至少三個不同的酶切位點E1、E2和E3，其中E2位于E1和E3之間；待連接的DNA分子片段至少包括酶切位點E1和E3，先對載體上酶切位點E1和E2進行酶切和去磷酸化；再對DNA分子片段的酶切位點E1進行第一步酶切和連接，得到DNA分子片段和載體的線性連接產物，然后回收正確大小的連接產物；最后對連接產物的酶切位點E3進行第二步酶切和連接，得到自連接的環狀連接產物。本發明能夠實現DNA分子片段與載體之間有效的連接，降低了非正確連接的不同形式聚合體的產生，使正確連接產物的比例在連接體系中占到30％以上，有利于實現高效的電擊轉化。文檔編號C12N15/66GK101619323SQ20091009126公開日2010年1月6日申請日期2009年8月14日優先權日2009年8月14日發明者余云舟,俞煒源,孫志偉,杜威世,雙王申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所