一種培育花器官敗育的水稻的方法及其專用dna片段的制作方法

專利名稱：：一種培育花器官敗育的水稻的方法及其專用dna片段的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，特別涉及一種培育花器官敗育的水稻的方法及其專用DNA片段。
背景技術：
：MIKC型MADS-box基因編碼一類很大的轉錄因子家族，由于這類基因有著類1以的M(MADS)，I(Intervening),K(Keratin-like)和C(C-terminal)四個結構域，故《尋名，這些基因在花的發育過程中起著重要的調控作用。通過對雙子葉模式植物擬南芥(/1ra力iofcipsi5、金魚草(/4/t_z'rr/_z'/wffl/saj'W5)禾口矮牽牛(尸et"77ia//6_r/cfe)花發育分子遺傳學的研究表明，各類同源異型MADS-box基因廣泛參與了花器官發育各個時期的調控過程，并建立了花發育的ABCDE模型。該模型認為A、B、C、D、E代表5類不同的花器官特征基因，其基因產物以四聚體的方式調控花器官的發育。其中，A類和E類基因控制萼片的發育；A、B和E類基因控制花瓣的發育；B、C和E類基因控制雄蕊的發育；C和E類基因控制心皮的發育；D類和E類基因控制胚珠的發育；A和C類基因相互抑帝iJ。在這5類基因中，E類基因的功能最為復雜，它不僅是花器官特征基因，而且對花分生組織決定性起作用。有關E類基因的功能作用，在單子葉植物中遠沒有在雙子葉植物如擬南芥、矮牽牛中清楚；而根據基因的表達模式及系統進化分析，E類基因在單子葉植:吻中功能發生了很大的變異，但對它的研究目前還很薄弱。雙子葉植物中E類基因(5^7^1ike基因)的功能主要體現在對萼片、花瓣、雄慈和心皮的特征性以及花分生組織的決定性起著重要作用。水稻作為單子葉植物的模式植^1，它的典型的E類基因包括0柳/57、(9s廁"5^、(fe鵬"57禾[]6fe紛AW。其中，除了對flsy{//mS7基因有較深入的研究外，對其它幾個基因的功能了解較少，尤其是fe，船"S7和fts，朋"5^。
發明內容本發明的目的在于提供一個DNA片段一個DNA片段，由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列l，所述基因片段A與基因片段C反向互補；所述基因片段B是內含子。上述內含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。含有上述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍之內。上述重組載體具體可為pUJ0sM71，其構建方法如下將上述的DNA片段插入質茅立pU1301的多克隆位點，得到重組載體；所述質粒pU1301是將Ubi啟動子插入pCAMBIA1301質粒上的//"din和fe^m酶切位點之間得到的重組質粒。本發明的另一目的在于提供一種培育花器官敗育的水稻的方法，是將上述的重組載體導入水稻中，得到重組水稻。本發明的又一目的在于提供一個DNA片段，由基因片段D、E和F依次連接組成；所述基因片段D的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述基因片段D與基因片段F反向互補；所述基因片段E是內含子。上述內含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。含有上述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍之內。上述重組載體可以是pUJ0sM8M，構建方法如下將上述的DNA片段插入質粒pU1301的多克隆位點，得到重組載體；所述質粒pU1301是將Ubi啟動子插入pCAMBIA1301質粒上的歷/xil11和fe/iH酶切位點之間得到的重組質粒。任一上述的Ubi啟動子是以玉米基因組DNA為模板，用ubi啟動子的引物U-1:5-AAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCC-3和U-2:5-GGATCCCTGCAGAAGTAACACCAA-3進行PCR擴增得到的片段。本發明的又一目的在于提供一種培育花器官敗育的水稻的方法，是將上述的重組載體導入水稻中，得到重組水稻。得到花器官敗育的水稻可以作為一種篩選材料，在以后的育種工作可以利用這種花器官敗育的材料，篩選一些可以令其重新開花的激素、化合物或者基因。通過轉基因技術獲得不育水稻的方法同樣可以應用于其它植物，特別是禾本禾斗的農作物和牧草。經過培育的不育植物可以避免因為結實產生的能量消耗，增加總的生物量和提高莖葉營養價值，為畜牧業提高優質的青儲飼料。此外，可以讓花器管敗育的研究在楊樹，柳樹等不期望起開花的物種中得到應用，避免花絮滿天飛的現象，以增強園林綠化的效果。本發明通過實驗證實過量表達fts紛Z^9轉基因植株產生了早花和矮化的表型。同時，利用RNAi技術單獨的特異性抑制Os厠仍7或^鵬"M基因的表達后，轉基因株系沒有任何表型，這說明E類基因存在著功能冗余；當同時抑制0AMZ^7和fla^Z^S基因時，轉基因水稻株系產生明顯的表型改變。主要表現為植株矮化，晚花，內三輪花器官都帶有了部分稃片化的特征，并喪失了花分生組織的決定性。當同時抑制4個5S^like基因fls朋"5V,ft湖Z57和fo船/tt^時，導致所有花器官都變成葉狀結構，同時失去了花分生組織決定性，在花的中心頂端形成新一輪花器官或花分生組織轉逆轉為花序分生組織。圖1為I和Z力oI雙酶切鑒定cDNA文庫中插入片段的大小。圖2為RNAi載體構建模式圖。圖3為fez*I和/V"I雙酶切pBluescriptII(SK)和pJawohl3載體，其中M為marker，1是fez*I和AbtI雙酶切pBluescriptll(SK)圖；2是丄和/VMI雙酶切pJawohl3圖。圖4為擴增片段，其中，M為marker;1為8C引物擴增片段；2為8M引物擴增片段。圖5為pUJOsM8C和pUJOsM8M的酶切鑒定圖，其中，M為marker;1為pBJOsM8M載體經5"raHI+歷"dIII酶切圖；2為pBJOsM8M載體經￡coRI酶切圖；3為pBJOsMSC載體經5amHI+戰"dIII酶切圖；4為pBJOsM8C載體經￡coRI酶切圖。圖6為pBJOsM71載體的酶切檢測圖，其中，M為marker;1為pBJOsM71載體經五coRI酶切圖。圖7為擴增片段，其中；M為marker;1為71引物擴增片段；2為7C引物擴增片段。圖8為pUJOsM7C載體的酶切檢測圖，其中，M為marker;1為pUJOsM7C載體經五coRI酶切圖。圖9為轉基因水稻幼苗的GUS染色鑒定，A:轉基因水稻(左側)和空載體對照(右側)對照再生幼苗葉片橫截面的GUS染色結果；B:轉基因水稻(左側)和空載體對照(右側)幼苗根段GUS染色結果。圖10為PCR鑒定RNAi-T-DNA的插入，A:特異抑制OsM4DS7基因的植株(Os7C)中T-DNA插入的PCR鑒定；B:同時抑制&柳"57//7柳/8基因(Os71)中T-DNA插入的PCR鑒定。WT:空載體對照；0s7I-l、0s7I-2、0s71-16:Os7I中的不同株系；0s7C-l、0s7C-12:Os7C中的不同株系。圖ll為轉基因株系的開花時間，其中，開花時間單位是天。圖12為空載體對照小穗和OsM4DS7,OsM4DSS基因沉默后的株系表型。圖13為空載體對照小穗和E類基因沉默后的株系表型。圖14為0SM8M株系的心皮石蠟切片。圖15為0SM7I株系的心皮石蠟切。圖16為Northern雜交檢測插入0SM8M載體中的基因片段在轉基因株系葉片中的轉錄，WT為空載體對照；M卜M8是同時抑制Qs細ASl、fls朋"55、Gs柳Z67^7Os細仍8基因產生的不同株系圖17為RT-PCR分析水稻E類基因在轉基因小穗中的表達，WT為空載體對照；M1-M8是同時抑制fls鵬"51、flsi/ymS5、Cls鵬Z^7^7fls湖/68基因產生的不同株系圖18為轉基因株系的real-timePCR結果，A:同時抑制Os朋"51、&廁"65、0i^"57和fe鵬"58基因所產生的不同株系的real-time;B:特異抑制fe.紛Z^7基因所產生的不同株系的real-time;C:同時抑制te湖Z58基因所產生的不同株系的real-time。圖19為RT-PCR檢測轉基因水稻的基因表達，WT:空載體對照；0s7I:同時抑制Os，i^"6Y浙&細"58基因所產生的不同株系；0s7C:特異抑制6te鵬AS7基因所產生的不同株系。圖20為和(^7K4AS7基因表達模式的檢測，其中A-H:6teyl^"5^基因的表達模式；I-Q:^細Z57基因的表達模式。圖21為E類蛋白酵母雙雜交分析。圖22為Co-IP分析E類蛋白之間的相互作用模式。圖23為0sMADS8過量表達載體示意圖，A.將tag融合在feyK^6^編碼區下游；B.將tag融合在Cte細"5^編碼區上游。圖24為轉基因植株的PCR(A)和RT-PCR(B)鑒定結果。圖25為MF0s8、Os8MPF蛋白的免疫雜交結果。圖26為水稻空載體對照和各種矮化突變體莖節伸長模式示意圖。圖27為0鵬"5^過量表達植株株型。A.空載體對照和MF0s8株系植株株型比較；B.空載體對照和0s8MPF-1株系植株禾朱型比較；C.空載體對照和0s8MPF-2株系植株株型比較。MF0s8轉基因水稻葉片深綠色；葉夾角增大。圖28為&#^0《過表達植株的株高(A)和節間相對長度統計(B)。圖29為0s8MPF植株的開花期大大提前，A.空載體對照植株(左)和0s8MPF植株(右)形態比較；B.A圖白色方框的局部放大，示0s8MPF植株的小穗結構；在空載體對照水稻還在營養生長階段時，0s8MPF植株已經開始了開花過程。圖30為Os8MPF植株花器官沒有發生明顯改變，A-C空載體對照水稻花器官解剖結構；D-FOsMPF植株花器官解剖結構。圖31為轉基因水稻中BRs合成相關基因的RT-PCR，左邊MFOs8植株；中間Os8MPF植株；右邊空載體對照(WT植株)。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例l、水稻E類基因在花器官發育中的調控功能一、基因的沉默1、基因的克隆基因是用RACE方法克隆得到的，&湖"57基因是用0,紛Z5^基因為探針篩選水稻cDNA文庫得到的。1)稻幼穗cDNA文庫的構建取野生型水稻中花11號(購自中國農科院作物科學研究所)1-5cm的幼穗提取總RNA，分離mRNA后，采用Stratagene公司的ZAP-cDNASynthesisKit構建cDNA文庫-。經滴度檢測原始庫的滴度為3.7X10"繁菌斑數/m1,擴增庫的滴度為9.3Xl(f噬菌斑數/ml。蘭白斑鑒定得出空斑率只有0.8%。隨機挑取17個噬菌斑，經環化后提取質粒，用構建文庫時所用的內切酶進行酶切鑒定，結果在17個克隆中，lkb以上的片斷有13個，占總數的76%(圖l)，說明文庫的質量符合要求。2)篩選cDNA文庫的探針模板a.從水稻基因組擴增MADS-box保守區序列為了從文庫中篩選得到MADS-box基因，首先根據MADS-box基因保守區的序列特點設計簡并性引物TP1和TP2，從水稻基因組擴增MADS-box保守序列，以作為篩選cDNA文庫的探針模板。引物序列為TP1:5'-ATGGGG(/A)AGAGGAAAGATA(/T)GAG-3'(21bp)TP2:5'-ATTCATAGAGG(/C)CGGCCACG-3'(19bp)擴增條件為96。C，2min;94°C，30sec，52°C,30sec，72°C，30sec，30個f盾環；72°C延伸10rain。擴增結束后，PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收250bp左右的條帶，連接到pGEM-T載體，轉化大腸桿菌DH5a。挑取單克隆，經PCR、酶切鑒定后測序。結果獲得了170bp的MADS保守區CGTGGCCGCCTCTATGAAT經序列比對分析，該序列與水稻C/D類MADS-box基因的相應區段相同性高達86%，與E類基因相應區段的相同性達79W,與A、B類基因稍低一些，分別為74%和75%。故篩庫時得到C/D類和E類基因的可能性更大一些。b.RACE克隆&7^"5^基因^細"幼基因是從水稻發育中的胚胎中得到的。根據擬南芥的研究結果，MADS-box基因^;Z75參與了胚胎的發育，我們推測在水稻的胚胎發育中也應該有MADS-box基因的參與，所以設計了擴增MADS-box基因的簡并引物，用PCR的方法，從水稻胚胎中克隆MADS-box基因。從水稻中花11號授粉一周后的胚胎中提取總RNA，分離mRNA后，用GIBICO-BRL公司的Superscript111RNaseH-反轉錄酶進行反轉錄，3'-端引物PTA序列為5'-CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGC(T),「3，，反轉錄結束后，以第一鏈cDNA為模板，用5，一端特異引物UBP和3'—端引物擴增MADS-box基因。引物序列為UBP:5'-ATGGC(G)A(G)AGAGGG(A)AA(G)ITIC(G)A_3'，3'-端引物就是PTA引物去掉polyT的序列。擴增條件為94°C，2min;94°C，30sec，50°C,30sec，72°C,lmin，35循環；72°C延伸10min。擴增結束后，lX的瓊脂糖凝膠電泳，回收lkb左右的條帶，并連接到pGEM-TEasy載體，轉化大腸桿菌DH5a。挑取單克隆先進行PCR、酶切鑒定，然后測序驗證。其中的一個克隆經序列比對分析發現，與^鵬"5S基因僅有一個核甘酸的區別，氨基酸序列完全相同。我們認為這個克隆就是&i^Z^S基因，一個核甘酸的區別很可能是不同基因型間核甘酸序列多態性的表現。從胚胎表達基因中分離到了fl5.紛"5S基因，說明Cte紛"5^基因可能參與了水稻胚胎的發育。c.從水稻cDNA文庫篩選6l柳Z67等其它MADS-box基因在得到了水稻MADS盒序列和^朋i^《基因后，我們以此為混合探針，從水稻幼穗cDNA文庫中篩選其它MADS-box基因。結果又得到了Cte細"5^和Os^^057基因。系統進化分析表明，fls朋"5^、fe朋Zi5^、&#AO^、Osi/v4ft57和fe擬"5^4與擬南芥中的S5P基因聚為一類，為6"57Hike類基因。根據氨基酸序列比對分析，0sMADS8和0sMADS7的序列相似性最高，與擬南芥中SEP3序列相似。2、RNAi載體的構建為了研究水稻5E^like基因的功能作用，我們構建了四個RNAi載體，分別命名為pUJ0sM8C、pUJ0s廳、pUJ0sM7C和pUJ0sM7T，用于轉化水稻。pUJ0sM8C:利用8C1和8C2引物擴增該基因3'端的特異序列，用來特異沉默Os崩AS^基因；pUJ0sM8M:利用8M1和8M2擴增fe湖"5S基因5'端的保守序列，用來沉默水稻中5^嚴like類基因；pUJOsM7C:利用7C1和7C2擴增該基因3'端的特異序列，用來沉默&#/1/^7基因；pUJ0sM71用來沉默fls掘"57和0廁/^基因，利用了靠近I區的序列，由引物711、712擴增；6te紛/W7和Os細"5^兩個基因的這一段序列相同性非常高，因此RNA干擾將同時降低這兩個基因的轉錄本。載體構建時，RNAi特異片段的選擇是通過&鵬"57，61si^"S5;0&紛"57，fls^4"5^和6te紛"5"W五個E類基因序列比對分析而決定的。構建所選取基因片段圖示如圖2:詳細的載體構建過程如下-(1)pU1301的構建以玉米基因組DNA為模板，以ubi啟動子的引物U-1:5-AAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCC-3和U-2:5-GGATCCCTGCAGAAGTAACACCAA-3為引物，其中劃線部分為酶切位點分別是歷"dIII和5aMlI;94。C預變性4min，94。C變性lmin,57。C退火lmin，72。C延伸2min40s，30個循環，最后72。C延伸10min,進行PCR擴增，產物為2Kb左右的片段即為Ubi啟動子。該啟動子經測序驗證正確后通過〃i/7dIII和fe州I兩個酶切，將Ubi啟動子連接到pCAMBIA1301(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture，www.cambia.org)上，構成pU1301載體。(2)pBJW13構建將pJawohl3(GenebankAccessionNumberAF404854)的內含子及終止子經Ss/*I和M^I雙酶切連接到pBluescriptII(SK)載體(圖3)，構成pBJW13中間載體。(3)中間載體pBJ0sM8C的構建以pTEQs7^Z5^(RACE方法得到的flsi^Z55基因全長片段插入PGEM-TEasy(promega，美國)載體得到pTE&湖仍W為模板，用8C引物(8C1:5'-GCCGGATCCTCTAGAGCACGGCGCCACCC-3'，8C2:5'-GGACCATGGCCCGGGCGTGCATCACATCAG-3')擴增片段(圖4)。構建pBJ0sM8C時，因8C引物擴增的片斷有JteI位點，與pBJW13的&eI位點為同尾酶，故先把8C引物擴增的產物經屈3I和5feaI雙酶切后插入經5>I和I雙酶切的pBJW13載體，構成pBJ0sM8C—，8C引物擴增的產物再經Ss/HI和I位點正向插入pBJ0sM8C—載體，最終構成pBJ0sM8C。(4)轉化載體pUJ0sM8C的構建將中間載體pBJ0sM8C上的正反向插入片段和終止子經SaMiI和5scI酶切位點轉移到植物表達載體pU1301，構建成轉化載體pUJOsM8C(圖5)。(5)中間載體pBJ0sM8M的構建以pTEQs掘Z^《為模板，用8M引物(腦l:5'-GCCGGATCCTCTAGATGGGGAGAGGGAGGG-3',8M2:5'-GGACCATGGTCCACCCGGGCCTTCAG-3')擴增片段(圖4)。8M引物的PCR產物先經fey*I和AfcoI位點正向插入pBJW13，構成pBJ0sM8M+，再經8M引物擴增的片斷有sI位點，與pBJW13的5》e1位點為同尾酶將PCR產物經J6sI和5/zaI雙酶切后插入經&eI和S脇I雙酶切的pBJ0sM8M+載體，構成pBJ0sM8M。(6)轉化載體pUJ0sM8M的構建因pBJ0sM8M載體上沒有6"scI位點，故先用yVotI單酶切pBJ0sM8M,補平，再用I單酶切；同樣，先用5"acI單酶切pU1301，補平，再用^mHI單酶切，然后將這兩個片斷連起來，構成pUJ0sM8M轉化載體(圖5)，其中轉化載體pUJ0sM8M有一DNA片段，該DNA片段由基因片段D、E和F依次連接組成；所述基因片段F是片段D(序列3)的反向序列；所述基因片段E的核苷酸序列是序列表中的序列2。(7)中間載體pBJ0sM71的構建以OsMADS7基因為模板，分別用7I引物(7I1:5'-GCCGGATCCTCTAGACCGCGGCAAGCTCTACG-3'，712:5'-GGACCATGGCCCGGGTCAACCAGATGTTTTGTC-3')擴增，因71引物擴增的片斷有JfeI位點，與pBJW13的&eI位點為同尾酶，故先把8C引物擴增的產物經J6aI和6"/肥I雙酶切后插入經&eI和5bsI雙酶切的pBJW13載體，構成pBJ0sM7I—，71引物擴增的產物再經As/zHI和I位點正向插入pBJ0sM7I—載體，最終構成pBJ0sM71，經五coRI酶切驗證，結果如圖6所示。(8)轉化載體pUJOsM7I(pUJWA+)的構建因pBJ0sM71載體上沒有&cI位點，故先用Abtl單酶切pBJ0sM71，補平，再用5a;zHI單酶切；同樣，先用&cI單酶切pU1301,補平，再用ife/^I單酶切，然后將這兩個片斷連起來，構成pUJ0sM7I轉化載體，其中，pUJ0sM7I轉化載體中有一DNA片段，由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列1，所述基因片段C是基因片段A的反向序列；所述基因片段B的核苷酸序列是序列表中的序列2。(9)中間載體pBJ0sM7C的構建以0sMADS7基因為模板，用7C引物(7C1:5'-GCCGGATCCTCTAGAGCAAGTGTGGGAGCAG-3'，7C2:5'-GGACCCGGGAAGGTAGTATCTCACACAAG-3，)擴增，因7C引物擴增的片斷有laI位點，與pBJW13的I位點為同尾酶，故先把7C引物擴增的產物經J6aI和51/^I雙酶切后插入經&eI和5iaI雙酶切的pBJW13載體，構成pBJ0sM7C—，7C引物擴增的產物再經fe/zHI和I位點正向插入pBJ0sM7I—載體，最終構成pBJ0sM7C。(10)轉化載體pUJ0sM7C(pUJWB+)的構建將中間載體pBJ0sM7C上的正反向插入片段和終止子經^/diI和fecI酶切位點轉移到表達載體pU1301，構建成轉化載體pUJ0sM7C,經五coRI酶切驗證，結果如圖8所示。3、載體的轉化將上述構建好的RNAi轉化載體用電擊法分別導入農稈菌EHA105,用農桿菌介導的方法轉化水稻中花11號成熟胚誘導的愈傷組織。浸染后的愈傷組織經共培養，在潮霉素篩選培養基上經過多次篩選培養得到獨立轉化的抗性愈傷組織塊。成功轉化的愈傷組織轉移到分化培養基上分化出苗；分化的水稻苗經鑒定為陽性的轉基因水稻苗移栽到溫室的土壤中生長，分別獲得了10個以上獨立的RNAi的水稻T。代轉基因株系。按照獲得RNAi的轉基因株系的方法，制備轉pU1301的水稻，作為空載體對照。4、轉基因植物的鑒定(1)組織GUS染色鑒定對分化培養基上分化出的再生水稻苗經一周左右的煉苗處理后，在向室外移栽前全部按不同株系分成單株，編號并進行GUS染色鑒定。初步篩選出的相應葉片和根段呈現藍色的陽性轉化苗(圖9)，以及同批次對照苗同時移栽到室外種植，并重新按株系進行單株編號標記。(2)PCR鑒定RNAi-T-DNA的插入對移栽到室外種植成活的轉基因水稻苗生長一段時間后，按編號的不同株系，,葉片的基因組DNA進行RCR鑒定RNAi-T-DNA的插入。使用載體潮霉素基因片段上的特異引物HygF:5，-CTgCTCCATACAAgCCAACCAC-3，和HygR:5'-AgCCTgACCTATTgCATCTCCC-3'，對再生的T。代水稻株系進行PCR鑒定。結果表明，所有經GUS染色鑒定初步篩選出的再生植株全都是陽性苗(圖IO)，也證明GUS染色篩選的結果是可靠的。5、RNAi轉基因株系的表型觀察pUJ0sM7C載體(特異抑制tei^Z^Z)轉化水稻愈傷后，得到17個株系，稱之為0sM7C株系；pUJ0sM8C載體(特異抑制^崩"5S)轉化水稻愈傷后，46個轉化的株系，稱之為0sM8C株系；pUJ0sM7I載體(同時抑制0al^/57和6te^"&)轉化水稻愈傷后，共得到18個具有明顯表型的株系，稱之為0sM71株系；pUJ0sM8M載體(同時抑制6la^"W,foi^"5"5",fls細"57禾Plfe朋"5W轉化水稻愈傷后，得到26個具有明顯表型的株系，稱之為0sM8M株系。(1)轉基因水稻生長特性觀察0sM7C株系的株高和株型與空載體對照以及野生型對照相比，沒有明顯差別，0sM7C植株結實率明顯降低，所有植株結實率普遍低于50%;而0sM7I株系植株明顯矮化，平均株高只有80厘米左右，遠低于空載體對照水稻的120厘米。0sM71植株抽穗期有一定程度的延長(圖ll，0sM7I-2、0sM7I-5、0sM7I-8、0sM7I-14是不同0sM71株系;WT:空載體對照)，而且始終觀察不到開花和散粉，隨后花序逐漸變成褐色干枯，完全不結實。(2)花結構的表型觀察我們對所有轉基因株系的小穗結構進行了解剖觀察，單獨沉默^紛"W或化劇"5"《基因的小穗與空載體對照以及野生型對照相比，沒有任何可見區別。同時抑制^i^/^7和&/^/^《基因表達的0sM71株系的穎片和內外稃片基本正常(圖12A-D)，但是內三輪花器官的發育受到嚴重影響漿片數目部分增多，所有的漿片都伸長變薄呈薄膜狀(圖12E，F);雄蕊數目異常，花藥扁平伸長，部分花絲扁平或基部扁平膨大，呈現片狀化的趨勢(圖12E,H-J);心皮結構異常，其中弱表型的心皮綠色膨大(圖12G)，伸長成稃片狀結構，柱頭2—4個(圖12H,E)，強表型的心皮開裂不閉合，并且又從中長出心皮狀和雄蕊狀結構(圖12G)。心皮結構的改變也通過掃描電鏡進行了觀察，強表型的心皮開裂不閉合(圖13H，1)，心皮內部又長出了小花狀或花序狀的結構，而且在這些結構的基部還長了絲狀的毛狀物(圖12P，Q),類似于一級分枝苞片上的絨毛(圖12T);另外，通過掃描電鏡還發現，與空載體對照細胞相比(圖12R)，轉基因株系心皮的遠軸表皮細胞重排沒有發生明顯變化，但是細胞表面明顯凹凸不平，并且長出了毛狀附屬物，類似空載體對照內外稃片上的結構(圖12J-P)。以上表型的分析表明，0sM7I株系的內三輪花器官都不同程度的片狀化，并且開始具有稃片的特征。同時沉默了其它E類基因的小穗，四輪花器官的發育均受到了不同程度的影響。所有小穗的穎片都沒有表型變化(圖13)，說明E類基因沉默對穎片沒有影響。強表型株系小穗的內外稃片瘦長，呈葉片狀(圖13C)，類似于&,紛"57突變體；內三輪所有花器官均發生同源異型轉換，變成葉狀結構，在原有花器官處長出小花狀結構，而在該結構內部又長出幾個狹長的小穗狀幼嫩肉質結構(圖13c-F)，從而使整個花序結構發生了改爽(圖13a)。這個表型特征與擬南芥中s卬7s印2^as印4四突變體的表型非常相似。由于0SM8M株系的心皮產生了強烈的突變，為了更加細致地觀察其表型變化，我們進行了掃描電鏡分析。一個空載體對照小穗的心皮由子房、花柱和兩個羽狀柱頭組成，心皮內發育一個胚珠，花分生組織由于形成胚珠而被耗盡。在E類基因沉默的轉基因小穗中，小花分生組織沒有因形成心皮而失去分生能力，而是繼續進行花器官類結構的分化或轉變為花序分生組織。在進行花器官類結構分化時，所形成的花器官大多數類似雄蕊，突破心皮向外生長，與此同時，已經分化的心皮原基繼續生長，并逐漸顯現出羽狀柱頭。在小花分生組織轉變為花序分生組織時，這些花序分生組織又產生新的分生組織，新的分生組織可能進行枝梗原基及小穗原基的分化，分化的這些器官原基同樣突破心皮向外生長。在心皮之外生長的器官原基之間形成的苞毛有力地表明小花分生組織已經轉變為花序分生組織(圖13E-H)。隨著花序分生組織分化的各類器官的生長發育，己經分化的心皮原基生長緩慢，并逐漸停止生長，最終出現了在小穗心皮的位置長出了幾個新的小穗的突變表型(圖131)，新小穗與空載體對照小穗非常相似。停止生長的心皮處于新花序枝梗的基部，表面仍有茸毛突起，就像苞片一樣包著花序基部，在解剖鏡下不易觀察。有的小穗的心皮隨著生長發育，從外觀看類似外稃，新的花序從類似外稃的心皮內長出。以上這些突變表型說明E類基因具有小花分生組織決定(detemirmcy)作用。當E類基因突變時，小花分生組織失去了其決定性，繼續進行花器官的分化或轉變為花序分生組織。由于在解剖鏡下觀察到0SM8M株系的心皮表面長有茸毛而類似稃片結構，為了證實心皮與桴片間發生了同源異型轉換，我們在掃描電鏡下對空載體對照心皮、突變型心皮和空載體對照外稃遠軸面的表面結構進行了觀察。結果表明，空載體對照心皮的表面細胞光滑平整，排列整齊，而突變型心皮的表面細胞略微突起，更加細長，細胞間長有細長的鶯毛，并有氣孔分布(圖13J箭頭所指)。這些特點與空載體對照外稃的表面結構類似，說明突變心皮具有了稃片的特征，至少與稃片間發生了部分同源轉換。所有轉基因株系中小花結構的統計表如表l。(3)石蠟切片觀察突變心皮的內部結構隨著生長發育，空載體對照心皮內部形成一團具有分裂活性的細胞，稱為珠心組織。在珠心組織產生孢原母細胞的同時，內外珠被原基開始在胚珠原基四周形成突起(圖14A、B)。在E類基因沉默的突變小穗中，花分生組織在分化出心皮原基后繼續進行花器官類結構的分化或轉變為花序分生組織，心皮內部是否形成了有分裂性的珠心組織，我們進行了正中石蠟切片觀察。在0SM8M株系的心皮內部是一些難以鑒別的組織結構，有的似乎是珠被，但珠心沒有進一步分化(圖14C，D);有的是一些片狀類結構，可能是以后長出的類似稃片的器官(圖14E-G)，有的在心皮頂部產生了明顯的花分生組織(圖14H)。總之，沒有看到正常的胚珠結構。說明E類基因對于胚珠的正常發育至關重要。0SM71株系的心皮盡管發生了各種變異，但內部組織結構與空載體對照(圖15A)相比還是基本正常的，能夠觀察到珠被、珠心等結構(圖15B-C)。有些柱系的心皮完全不閉合的，從中又長出新的心皮狀結構，其內部也能觀察到珠被、珠心等結構(圖15D)。但內部的大孢子細胞的分化是否正常還需要進一步的觀察。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a:-,正常；+十，內稃葉片狀；b:-，正常；+，外稃與空載體對照相比細長；C:-，正常；+，漿片薄膜狀++，一枚^片呈內稃狀；+++，漿片葉片狀；d:-，正常；+，雄蕊與空載體對照相比細長+++，雄蕊消失或轉變成葉片狀；e:-，正常；+，心皮呈綠色稃片狀，部分融合并有2-4個畸形的花柱。++,心皮不融合，花柱和柱頭消失，多心皮狀結構；+++,心皮變成葉片狀結構；f:-/種子正常；+，心皮內器官結構異常；++，心皮內長出雄蕊或心皮狀器官；+++,不正常的花穗。g:育性受到影響。注每個株系分析200個以上的小穗。(4)基因的功能單獨的特異性抑制^湖"67或ft鵬"5^基因的表達后，轉基因株系沒有任何表型，這說明E類基因存在著功能冗余；當同時抑制&#4"57和fla紛/5W基因時，轉基因水稻株系產生明顯的表型改變。主要表現為植株矮化，晚花，內三輪花器官都帶有了部分稃片化的特征，并喪失了花分生組織的決定性。當同時抑制5個5^,like基因flsi^Z67,fe鵬"57，fe湖/5^和化淑"5^時，導致所有花器官都變成葉狀結構，同時失去了花分生組織決定性，在花的中心頂端形成新一輪花器官或花分生組織轉逆轉為花序分生組織。這與擬南芥中s印7s印3s印4四突變體的表型是類似的，水稻中不同5B產like基因的mRNA吋空表達和蛋白互作模式都是高度相似的，只是基因功能的特異性有區別，這表明了5^/Mike基因在花分生組織特異性和花器官決定性中具有功能的保守性，而且說明fl朋A57和fls朋"5^基因很可能是擬南芥的527^1ike基因在水稻中的直系同源基因，它們在水稻花發育過程中起了重要作用。同時，也揭示了單子葉植物E類基因特異的新功能或亞功能化，揭示了5S^like進化的動態性和多樣性。二、基因功能的驗證為了證明轉基因株系的表型是由目的基因受到抑制而引起的，我們設計了一系列的驗證實驗1.檢測外源基因是否己經轉入水稻體內并成功表達我們對抑制了E類基因的轉基因株系葉片中外源基因的轉錄進行了Northern雜交分析，結果在4個轉基因株系中出現了長度不等的RNA片段，而在空載體對照植株中沒有信號，說明由RNAi載體導入并已整合在基因組中的外源基因的反向重復序列發生了轉錄，并且在體內形成了雙鏈RNA結構，被剪切后產生了大小不等的RNA片段(圖16)2.驗證目的基因的表達是否被成功抑制為了驗證已成功轉入體內并被降解的小RNA是否尋找了到目的基因并對它們進行了有效的抑制，我們用不同方法對目的基因的表達進行了檢測。同時抑制E類基因(&J//^57,fe，鵬"5^fe鵬"57和fls紛"5^基因)的0sM8M株系共有26株，我們對其中的5株進行了RT-PCR檢領U。結果5個E類基因fla紛/^9、&#力仍7、fls鵬"5厶fls必JZ6^和(^i/^ftS"^的轉錄比對照顯著減少(圖17)，說明這些基因的表達受到了抑制。其中6^鵬flSW減少的程度略低一些。根據序列比較分析，6te柳/^^基因序列與雙鏈RNA干涉序列相比，大于21bp完全相同的區域僅有一24bp區域，明顯比其他幾個基因匹配的區域短，有可能在體內小RNA與目標基因0#^^<^結合的機會更少一些，所以受到降解的程度低一些。以上結果表明，轉基因株系產生的強烈突變表型就是E類基因被抑制的結果，說明了這類基因在花發育中起著重要的作用。對轉基因株系進行了real-timePCR的檢測，圖18中CK為空載體對照。結果顯示0sM8M株系中fc細Z57,fla)/AaS7和基因表達水平顯著下降(圖18A)，同時抑制flsv^"57和O湖"幼基因的0sM71株系也檢測到了fts鵬/57禾Q&#^05^基因表達水平的明顯下降(圖18C)，這兩個株系都觀察到明顯的表型異常，以上結果說明了轉基因株系表型的出現和基因的改變是密切相關的，E類基因功能的缺失是導致表型改變的主要原因。對特異抑制(&^"57基因的0sM7C株系和特異抑制《5#^5^基因的0sM8C株系的基因表達情況的檢測結果顯示6te#7r(09#D株系轉基因植株在&朋/67(fls細ZD基因的表達被抑制后，(fls鵬Z幼)基因的表達有著顯著下降，但是fls紛"55(&掘ZWT)基因依然正常轉錄，并且同其他幾個E類基因一樣，表達水平還有一定程度的升高(圖18B,C)，彌補了ftsi^/57(&鵬"550基因的功能缺失，直接的結果可能導致了單基因突變沒有任何表型變化，證明tfe細"67和foi^5"S基因在功能上存在一定的冗余。3.檢測目的基因的表達受抑制的同時，其他相關基因(B類和C類基因)的表達是否受到影響花發育的"ABCDE"模型中，內三輪花器官的正常發育過程中除了E類基因的之外，還需要B類和C類基因的參與。為了檢測轉基因水稻中B類和C類基因表達水平是否受到了影響，對兩類不同的轉基因株系中的B類基因(6te紛"5"力禾tlC類基因(&蒯"5^和fls細Z^5S)表達水平各選取了兩株系進行了RT-PCR檢測。結果表明與空載體對照水稻相比，在轉基因水稻株系中，B類和C類基因表達水平基本保持不變，并沒有受到明顯影響(圖19)。4.原位雜交方法檢測6te紛AS7和&測"5基因表達模式的差異為了確定水稻5S^like基因在花和胚胎發育過程中的時空表達方式，我們對和^y^"57基因進行了詳細的組織原位雜交檢測。新鮮材料在FAA固定液(50%乙醇，5%醋酸，3.7%甲醛)中，4'C固定14-28小時，經過乙醇脫水和二甲苯透明后，包埋到石蠟中，將蠟塊修整后切成lO-Wn厚的蠟片并粘貼到載玻片上，42'C烤片后進行脫蠟復水前處理，然后用基因的特異序列作為探針，地高辛標記后進行雜交，雜交完成后進行顯色并用SSC洗液進行系列洗脫，封片照相。結果表明&#^^的1^離最初在枝梗原基表達，隨著小穗原基的形成，又集中在小穗原基。在小穗原基分化穎片、內外稃片后，fe，鵬/y《RNA的轉錄定位在小花分生組織原基。己分化的穎片和稃片沒有表達。在雌雄蕊開始分化，內、外稃片合攏之前，集中在漿片、雄蕊和心皮表達，這種表達方式一直持續到花發育結束(圖20A-B)。說明tts湖Z5^基因確實參與了花器官的發育。0蒯"57基因的表達方式與fei^Z^9相同，只是表達的開始時期要比0鵬"5^晚，結果顯示0#力/^基因首先在一級分支原基處檢測到信號(圖20A-B);而此時^fe紛"57并沒有檢測到表達信號(圖201-J)。在二級分支原基分化后，fe^"5"《基因強烈表達(圖20C),此時tts廁"67只有較弱的表達(圖20K)。在小花原基時期fe細"5"《的表達信號也比^船/^7強(圖20E，N)，隨著小花的逐漸發疼，兩個基因都特異的局限于內三輪花器官表達(圖20E-H,N-Q)，在成熟的小花中，二者都只在生殖器官雌蕊和雄蕊中表達(圖20H,Q)。5.水稻E類蛋白之間的互作模式研究——酵母雙雜交和Co-IP分析為了更進一步的理解E類基因的功能，尤其是它們在蛋白質水平上是如何發揮調控功能。試驗中對五個E類蛋白0sMADSl、0sMADS5、0sMADS7、0sMADS8、0sMADS34和D類蛋白0sMADS13間的相互作用差異，用酵母雙雜交系統和Co-IP的方法對這些重要MADS-box蛋白間的相互作用能力進行一系列檢測。'Cte細/^/,tfe崩"57和Os柳flSy基因的全長cDNA序列分別用特異引物擴增后用Afco1/I或1/AWeI酶切后連接到pGADT7和pGBKT7載體上，構建成酵母雙雜載體pAD-0sMADS1,pAD-0sMADS7，pAD-0sMADS8，pBD-0sMADSl，pBD-0sMADS7禾卩pBD-0sMADS8。然后將這些載體的不同組合后用LiAc介導的方法轉化到酵母菌株AH109中，制備成不同的雙質粒組合，在確認單質粒菌沒有自激活活性和自身毒性的檢測后，即可在四缺篩選培養基(SD-His-Leu-Trp-Ade+5mM3-AT)上對已轉化了雙質粒的酵母細胞進行相互作用能力檢測。如果在四缺培養基中能生長，說明有相互作用，否則沒有互作。多肽標簽可以在活細胞體內定位基因產物，鑒定與其相互作用的蛋白，追逐目標蛋白的遷移。這些很小的肽標簽不會與融合蛋白發生干擾。使用最為廣泛的有多聚精氨酸，FLAG-，多聚精氨酸-，c-myc-，S-和Str印II-tag等。我們選用pCMl307-6Xmyc和pRT105-3Xflag為母載體。構建了八個原生質體轉化融合載體載體pCM1307-6Xmyc-Osl/5/7/8和pRT105-3Xflag-Os1/5/7/8。使用不同組合的融合質粒共轉化擬南芥葉肉細胞原生質體，分別用anti-MYC和anti-FLAG檢測轉化結果，當共轉成功時，即可進行免疫共沉淀的分析。結果表明0sMADS7和0sMADS8蛋白有相似的互作模式。OsMADS7和OsMADS8蛋白都能自身作用形成同源二聚體(圖211,M)，二者也都可以和OsMADSl互作形成異源二聚體(圖21C，D,J,N)。OsMADSl蛋白自身也存在較弱的作用(圖21A)。當OsMADS7和BD融合，OsMADS5和AD融合時，0sMADS7和0sMADS5能相互作用形成異源二聚體(圖21K)，在其他條件下，0sMADS5不與其他E類蛋白包括自身相互作用形成二聚體。0sMADS8蛋白和0sMADS13蛋白可以形成異源二聚體作為陽性對照(Favaroets7.，2003);質粒空載體組合為陰性對照。Co-IP分析得到了相一致的結果(圖22)。6、基因沉默的結果分析在控制花發育的MADS-box基因中，E類基因的功能最為復雜，根據對雙子葉植物的研究結果，它參與了所有花器官的發育并對花分生組織的決定性起作用。在單子葉植物中，根據已克隆基因的表達模式和系統發育分析認為，E類基因比其它MADS-box基因的功能發生了更大的變異。水稻是單子葉植物的模式植物，我們對水稻中E類基因尤其是和^細"5^兩個基因的表達模式進行了更進一分析，同時利用RNAi技術對其功能作用迸行了研究。得到以下結論1)0sMADS7和0sMADS8基因共同參與水稻內三輪花器官的發育，二者既有很大程度的功能變異又存在明顯的功能冗余我們的研究證實無論是單獨抑制OsMAZ^《還是Qs^^S7的表達水平，都不能引起轉基因水稻株系花器官結構明顯的表型改變。當同時抑制&#/1"57和fei^AW基因時，轉基因水稻株系產生明顯的表型改變。同時，原位雜交的結果也表明6fe紛"57和6fe^AW表達模式非常類似，這就證明兩個基因功能很可能存在很大的重疊(功能冗余)，其中某個單基因的表達缺失會被另一個基因的表達所彌補，因而不能表現出明顯的表型改變，但是從原位雜交的結果來看，二者的表達模式又有所差異，說明二者存在一定的功能變異。當同時抑制ft崩"57和^i^Z5^基因時，轉基因水稻株系主要表現為植株矮化，抽穗期延遲，內三輪花器官的發育受到嚴重影響漿片轉變為稃片類的結構，雄蕊沒有花粉，心皮具有了稃片的特點，同時失去了花分生組織決定性，在花的中心頂端形成新一輪花器官。然而，通過對轉基因水稻內源E類基因和B、C類基因表達量的real-timePCR和RT-PCR分析，證實轉基因水稻株系中RNAi介導的fe朋"57禾卩&朋"5"《表達水平顯著下降，但是內源B、C類基因表達并沒有受到影響，這說明花器官異常表型的出現是由E類基因表達水平變化而引起的。而表型又僅限于內三輪花器官的變異，因此，我們認為，fe^4"57和&#力"5基因參與了水稻內三輪花器官發育的調控，并且這兩個基因存在明顯的功能冗余。2)ft鵬"57和0朋/^9的表達水平影響水稻花分生組織的決定性E類基因的功能一方面是參與花器官的發育，另一方面是具有花分生組織決定性。擬南芥中s印V^/三突變體失去了花分生組織決定性，出現了花中生花的突變表型，這種表型與ag和SA強突變體類似(Coen"s丄，1990;Pelazeta義，2000)。在水稻中，E類基因&掘"57缺失突變體表現出內三輪花器官(包括漿片、雄蕊和，心皮)同源轉化為內稃和外稃類結構，并且這樣基本的變形結構重復出現在同一朵小花中心位置的花梗上，說明花分生組織決定性的喪失。我們的研究也發現，在沉默E類基因的水稻轉基因水稻小穗中花分生組織決定性喪失，導致小花中心位置不以最終形成胚珠而結束分化，而是繼續進行花器官類結構的分化或轉變為花序分生組織，花序分生組織產生新的小穗。在同時抑制&朋"57和fla紛"5^的轉基因水稻中，它的內三輪花器官發生了明顯的表型改變，同時也在不閉合的心皮內又長出新的雄蕊狀和心皮狀結構。這表明，在轉基因水稻小花的花分生組織決定性一定程度上喪失了，而導致小花最中央位置繼續保持分生能力，分化出新的花器官類結構。3)水稻中^崩i57和ft崩Z5S基因是擬南芥中E類基因的直系同源基因在"ABCDE模型"中，E類基因參與了萼片、花瓣、雄蕊和心皮包括胚珠的發育的過程。雙子葉植物擬南芥中的5E^/2/J/么矮牽牛中的faW和番茄中的7￥5是最早研究并獲知其功能的典型E類基因。在擬南芥巾，5^P單基因突變體都不能引起明顯的表型改變，而s印7//三突變體的花內三輪花器官轉變為萼片，第四輪花器官由只有萼片組成的新花取代，顯示花分生組織決定性的喪失(Pelaz"a丄，2000)。這與我們所觀察到的轉基因株系的表型是相似的，說明水稻中的E類基因與擬南芥中^S^尸基因相比存在功能的保守性，從進化分析上來看，二者的親緣關系也比較近。縱上所述，我們的研究結果表明Cte鵬/^7和fls廁"5^基因是擬南芥的5^,like基因在水稻中的直系同源基因，它們在水稻花發育過程中起了重要作用。實施例2、基因的過表達一、基因的過表達1、過量表達載體的構建為了便于在轉基因植株蛋白水平的檢測，我們在6teWAW編碼區前面或后面融合了MYC-FLAGtag;Ubiqutin啟動子是一個在單子葉植物中有較強表達的啟動子，實施例2用的Ubiqutin啟動子是實施例1制備的啟動子。我們選用該啟動子從而構建了兩個0i/AftW過量表達載體pU1301MF0s8和pU13010s8MPF(圖24)。根據fe湖"5^序列設計引物H8F和H8R，正向引物H8F在起始密碼子前面弓|物引入feaHI位點，序列為5'-ACTAggAI^ATggggAgAgggAgggT-3';H8R反向引物，將^湖/^《序列中的終止密碼子TGA突變成了ATC(lie)并引入C7aI位點，序列為5'-CAgg^g^gggTAgCCATgTCggCA-3'。載體構建過程如下方所示。最終載體測序驗證讀碼框的正確性。pU1301MFOs8的構建過程將35S::MCS::polyA表達框(GenBank:X05868.1，MCS:多克隆位點來自載體pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司，美國))插入到pUC19載體(TaKaRa寶生物公司，中國大連)構成表達載體pUC35s。將MYC-FLAGtag(GAGCTCATGGAACAGAAACTGATCAGCGAAGAGGATCTGGACTACAAGGACGACGACGACAAATCTAGA)利用5"acl和插入到表達載體pUC35s得到載體pUC35sMF。&力1單酶切載體pUC35sMF，得到35s::MF::polyA表達框，將其l禹入pGEM-TEasy載體(promega公司，美國)得到中間載體pTe-MF35s中間載體。用5孕HI和酶切pTe-MF35s中間載體，補平并自連得到pTe-MF(b+x)35s載體。利用5"scl和fcoRI酶切pTe-MF(b+x)35s載體，將得到的片段插入到pCAMBIA1301載體(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)，得到pl301MF(b+x)載體。利用和feaHI將UBi啟動子插入pl301MF(b+x)載體，得到pU1301MF載體。以pTEfc湖Z5^(RACE方法得到的Os細Z6^基因全長片段插入pGEM-TEasy(promega公司，美國))載體為模板，以H8F和H8R為引物，擴增得到ftsi^Z^《的編碼區序列利用5a/rfH和67sl雙酶切，插入pTe-MF35s載體，得到pTe-MF0S835s載體。用/Vafel單酶切pTEfeifW"6^和pTe-MF0S835s載體，分別回收小片段和大片段，將其連接而成pTeMF0s8中間載體。將利用單酶切質粒pTeMF0s8獲得的&#^"<編碼區，連入pU1301MF載體，挑選正確方向連入的質粒，得到最終表達載體pU1301MF0s8。pU13010s8MPF的構建過程將MYC-FLAGtag(GTCGACATGGAACAGAAACTGATCAGCGAAGAGGATCTGGACTACAAGGACGACGACGACAAAGGTAAC)利用5"aZt和,/ml插入到表達載體pUC35s,得到載體pUC35sMPF。Sp/I單酶切載體pUC35sMPF，得到35s::MPF::polyA表達框，將其插入pGEM-TEasy載體(promega公司，美國)，得到中間載體pTe-MPF35s中間載體。以pTEfts鵬"5S(RACE方法得到的Os鵬Z^《基因全長片段插入pGEM-TEasy(promega，美國)載體)為模板，以H8F和H8R為引物，擴增得到0#力/^《的編碼區序列利用5s』1和Gsl雙酶切，插入pTe-MPF35s載體，得到pTe-OS8MPF35s載體。利用5a/dH和fcoRI酶切pTe-0S8MPF35s載體，將得到的片段插入到pCAMBIA1301載體，得到pl3010s8MPF載體。利用范"dIII和fe州T將UBi啟動子插入pl3010s8MPF載體，得到最終表達載體pU13010s8MPF。對照載體的構建將35S::MCS::polyA表達框(GenBank:X05868.1，MCS:多克隆位點來自載體pBluescript丄lKS(+)(Stratagene公司，美國))插入到pUC19載體(TaKaRa寶生物公司，中國大連)構成表達載體pUC35s。將MYC-FLAGtag5"acl和J力al插入到表達載體pUC35s得到載體pUC35sMF。單酶切載體pUC35sMF，得到35s::MF::polyA表達框，將其插入pGEM-TEasy載體(promega公司，美國)得到中間載體pTe-MF35s中間載體。用fez*I和屈ol酶切pTe-MF35s中間載體，補平并自連得到pTe-MF(b+x)35s載體。利用fecl和fcoRI酶切pTe-MF(b+x)35s載體，將得到的片段插入到pCAMBIA1301載體(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)，得至Upl301MF(b+x)載體。禾U用析/dl11禾口5arfil將UBi啟動子插入pl301MF(b+x)載體，得到對照載體pU1301MF載體。2、轉基因植物的獲得將構建好的兩個表達載體pU1301MFOs8、pU13010s8MPF和對照載體pU1301MF用電擊法轉入農桿菌EHA105中，用Agrobacteri咖-mediated轉化方法導入水稻中花11號幼胚愈傷組織，經兩次潮霉素篩選后，獲得的抗性愈傷組織塊，轉到分化培養基，最后得到轉基因小苗，壯苗期，做GUS組織染色，呈陽性結果的小苗移栽室外桶內。轉pU1301MF0s8、pU13010s8MPF和pU1301MF株系分別稱為MF0s8、0s8MPF和pU1301MF株系(表2)。pU1301MF株系是空載體對照，命名為WT。表2轉基因株系統計株系名稱再生苗株系數GUS陽性苗株系數百分比MFOs8823340Os8MPF543666pU1301MF82253、過表達轉基因水稻的分子鑒定1)基因組DNA的GUS基因片段的檢測采用CTAB法提取WT、MF0s8、0s8MPF株系植株水稻幼嫩的葉(葉片、葉鞘)中的基因組DNA。以T-DNA上35S啟動子和GUS基因片段的上游引物p5y35s:5'-CgTTCCAACCACgTCTTCAAAgC-3'和下游引物p3gus:5'-TggCCTgCCCAACCTTTCg-3'為引物，以基因組DNA為模板，作PCR反應檢測(圖24)。由圖可見，WT植株GUSPCR結果為陰性，MF0S8、0S8MPF植株GUSPCR結果為陽性。說明T-DNA已經整合進轉基因植株的基因組中。2)轉基因植株Os鵬AS"《轉錄本的RT-PCR檢測己報道了Cfe紛Z5^基因在空載體對照水稻的枝梗原基、小穗原基、漿片、雄蕊、心皮和發育的種子表達。我們以WT、MF0s8、0s8MPF株系植株水稻幼嫩的葉(葉片、葉鞘)為材料，Trizol法提取總RNA，用6te紛"5^基因特異引物pC8:5'-CTGGAATTCAGCAACCAGTTG-3';pR8:5'-GGAGTCTCGAGTAGCCATGTC-3'為引物作RT-PCR檢測(圖25)。結果表明MFOs8、0s8MPF株系都獲得了預期大小的條帶。基因組PCR和RT-PCR的結果證明了過表達fe,紛"5^載體已整合到水稻基因組并表達。3)收集保存轉基因水稻的幼嫩的小穗，液氮速凍，保存在-70。C，用作提取蛋白質的材料。按前所述的方法提取轉基因水稻小穗蛋白，進行12%SDS-PAGE。水稻小穗總蛋白經12。/。PAGE膠電泳分離后，電轉移到PVDF膜上，用抗FLAG抗體進行免疫雜交，以觀察轉基因蛋白的表達情況，采用檢測辣根過氧化物酶-ECL法顯色。結果顯示(圖25):MF0s8和0s8MPF轉基因植株都有預期大小的雜交條帶，表明6>&^"5-tag融合基因在轉基因水稻中已經正確表達。二、過表達轉基因水稻的表型分析1)過量表達《^"5"<9弓I起植株矮化PU1301株系在營養和生殖生長階段在表型特征上與野生型對照沒有肉眼可觀察到的差別，MF0s8株系植株相比空載體對照株型矮化。Os腦PF株系植株的表型發生了很明顯的改變。0s8MPF株系植株的表型可以分為兩大類，命名為0s8MPF-l和Os8MPF-2株系。這兩類的共同表型主要表現在葉片深綠色、葉夾角增大植株矮小；分蘗數減少(圖27)。Os8MPF-l和Os8MPF-2株系的差別主要在株型方面，雖然二者都表現植株矮化，但二者的矮化類型不同。水稻植株的矮化是節間長度縮短或節間數減少的結果，也可能時兩者共同作用的結果。以水稻植株上4節(或5節)間的節間伸長樣式不同，可將水稻株型分為N，dn,dm，d6，nl,和sh6種類型。圖26為不同類型節間長度占株高的比例示意圖(Yama咖ro"s丄，2000)。在水稻中，將緊接圓錐花序的節間定為第一節間，余者類推。將節間比例正常的品種標定為N型。dn類型矮化的特征是節間比例與N型相同，即每節間都按相對比例縮短；dm型的特征是第二節間縮短；d6型的特征是第一節間以下各節間都不同程度的縮短；nl型的特征是有頸葉，第二節間長而第四節間短，偶爾有第6節伸長節間。sh型的特征是第l節間幾乎不伸長，穗子包藏在劍葉葉鞘中。由此，我們測量了轉基因矮化植株的株高(圖28A)和個節間的相對長度(圖28B)。MF0s8和0s8MPF-1株系矮化表型，屬于dn類型，即每個莖節都相對的縮短；而0s8MPF-2株系屬于d6類型。圖28中WT是實驗室內的空載體對照，WTfield是在野外田間空載體對照。2)過量表達^M^5^引起植株提前開花MF0s8株系植株開花期、花器官結構和空載體對照、野生型對照相一致，沒有明顯的表型。0s8MP植株開花期大大提前，一般大約提前3-4周(圖29)，但是花器官結構沒有異常(圖30)。由圖可見，當空載體對照植株還在營養生長時期時，0s8MP植株已經進入了繁殖生長時期。已有文獻報道改變水稻體內BRs的含量或對BRs敏感性可改變水稻的株型。植物激素13Rs在植物的生長發育中發揮多方面的作用。在單子葉模式植物水稻中，分離到許多BRs突變體。通過對這些突變體的研究，揭示了BRs在水稻生長發育中的作用，主要體現在三個方面即莖節的伸長(internodeelongation)、葉夾角的改變(bendingofthelaminajiont)、光形態建成(skotorphogenesis)。由轉基因水稻在葉夾角上的表型，我們用半定量RT-PCR方法檢測了水稻中和BRs合成或信號轉導有關的基因的表達水平的變化，結果如圖31。從RT結果看，MF0s8植株BRs合成或信號轉導有關的基因的表達水平和空載體對照相比沒有變化，而在0s8MPF植株中fls57"/的表達量上調，^服/入&貝7的表達量下調，的表達量基本沒變化。0^ffl/、fls"2和fls/^/編碼細胞色素P450酶類，參與體內BRs合成途徑的晚期步驟；&^//是擬南芥中BRs受體朋Y/的同源基因，編碼BRs受體類蛋白激酶。&5///和fl"/7受BRs的負反饋調節。基于0s8MPF植株的株型，特別是轉基因植株的葉夾角的增大，我們推測在轉基因水稻中BRs的作用被加強了。fei^Z5^的過量表達，引起BRs合成基因6te^W的表達量的升高，轉基因水稻體內的BRs含量增加，增大了植株的葉夾角，BRs含量增加又負調節了其他BRs相關基因0&^//和a"w的表達量的下降。本研究過量表達&#^/^轉基因植株產生了早花和矮化的表型。同時，利用RNAi技術同時沉默fl5細Z57和^鵬"6^兩個基因或者同時沉默fts鵬"57、ft柳Z615、fts紛Z57和四個基因的轉基因植株開花期明顯延長。表明水稻中like基因參與了開花時間調節的基因調控網絡。過量表達like基因引起的植株矮化，認為是因為提前開花，而影響了體內的激素水平的結果。早花和矮化是重要的農藝性狀。營養生長和生殖生長的平衡狀態在很大程度上影響著作物的產量。利用矮化基因提高農作物的性狀已經有實際應用。過量表達5^P-like基因可能會誘導開花相關基因的表達，從而縮短開花時間并產生矮化表型。目前，雖然具體機制還不清楚，但這個機制在不同的植物體中是保守的。利用組織特異啟動子或誘導型啟動子驅動5X7Hike基因在轉基因植物中的表達，會增加在實踐中應用的前景。序列表〈110>中國科學院植物研究所〈120>—種培育花器官敗育的水稻的方法及其專用DNA片段<130>CGGNARL92485<160>3〈210>1<211>286<212>腿〈213>水稻(0;^^加Va)〈400〉1ccgcggcaagctctacgagttctgc已gcggccaaagcatgaCC3g33Ctt603gtt3tggtgggccagatactgcaMacagatgagttagt120gC3犯gC3gCCgC犯tg3gtg3鄉C3Cgggtggaaaattt3C3gagg3C180cc33aggaatcttcttggtg犯gatcttgggacacttggcataaaagBgctagagc已gct240tgagaaacaBcttgattcatccttgaggcacatt8g已tcc286〈210〉2〈211〉199〈212〉腿<213〉未知〈220〉〈223〉<400〉2gtacggaccgtatagaggc已ttccacttaatactactctatctttattatattat3ta^gttcgtttxaatatatttatttttaaattttgtgtcactcaacat已ttctcgattatatattgtttcsgctgsctgcaag已60120180199〈210〉3〈211〉266〈212〉DNA<213〉7jC稻(O拜似細)<400〉3caggcaggtgacgttcgcgaagcggaggaatgggctgctcaagaaggcgtacgagctctc60cgtgctctgcgacgccgaggtcgccctcatcatcttctccaaccgcggcaagctctacga120gttctgcagcggccaaagcatgaccagaactttggaaagataccaaaaattcagttatgg180tgggccagatactgcaatacagaacaaggaaaatgagttagtgcaaagcagccgcaatga240gtacctcaaactgaaggcacgggtgg26權利要求1、一個DNA片段，由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列1，所述基因片段A與基因片段C反向互補；所述基因片段B是內含子。2、根據權利要求1所述的片段，所述內含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。3、含有權利要求1或2所述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌。4、根據權利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體的構建方法如下將權利要求1或2所述的DNA片段插入質粒pU1301的多克隆位點，得到重組載體；所述質粒pU1301是將Ubi啟動子插入pCAMBIA1301質粒上的歷/7dIII和S』I酶切位點之間得到的重組質粒。5、一種培育花器官敗育的水稻的方法，是將權利要求3或4所述的重組載體導入水稻中，得到重組水稻。6、一個DNA片段，由基因片段D、E和F依次連接組成；所述基因片段D的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述基因片段D與基因片段F反向互補；所述基因片段E是內含子。7、根據權利要求6所述的片段，其特征在于所述內含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。8、含有權利要求6或7所述DNA片段的重組載體、轉基因細胞系或重組菌。9、根據權利要求8所述的重組載體，其特征在于所述重組載體的構建方法如下將權利要求6或7所述的DNA片段插入質粒pU1301的多克隆位點，得到重組載體；所述質粒pU1301是將Ubi啟動子插入pCAMBIA1301質粒上的〃//dIII和I酶切位點之間得到的重組質粒。10、一種培育花器官敗育的水稻的方法，是將權利要求8或9所述的重組載體導入水稻中，得到重組水稻。全文摘要本發明公開了一個DNA片段，由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列1，所述基因片段A與基因片段C反向互補；所述基因片段B是內含子，所述內含子的核苷酸序列是序列表中的序列2。本發明還公開了含有該片段的重組載體，將該載體導入水稻后得到花器官敗育的水稻。具體地講，當同時抑制OsMADS7和OsMADS8基因時，轉基因水稻株系產生明顯的表型改變。主要表現為植株矮化，晚花，內三輪花器官都帶有了部分稃片化的特征，并喪失了花分生組織的決定性。文檔編號C12N15/11GK101629176SQ20091009054公開日2010年1月20日申請日期2009年8月19日優先權日2009年8月19日發明者鳳吳,征孟,崔榮峰,趙素珍,韓加坤申請人:中國科學院植物研究所