專利名稱：提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的方法及生產菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的方法，具體地說, 涉及提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的基因工程方法。
背景技術：
阿維菌素(avermectins )是由阿維鏈霉菌(5^印to附;^es "ver/mW^ ) 發酵時產生的一組高效殺蟲的十六元環大環內酯類抗生素，它的天然 產物共有八個組分(Ala， Alb, A2a, A2b，Bla，Blb,B2a, B2b),其中 Bl組分的殺蟲活性最強，幾乎抗所有與農業有關的線蟲和節肢動物， 被廣泛應用于農業生產上。伊維菌素(ivermectin)是以阿維菌素B1 為原料在C22-C23位加氫還原而成，與阿維菌素B1具有相同的殺蟲活 性，但毒性比阿維菌素低2-3倍，更適用于動物體內外寄生蟲的防治， 是一類廣譜有效的新型抗寄生蟲抗生素。阿維菌素和伊維菌素具有獨 特的作用機制，不易使害蟲產生抗性，且易降解、無殘留，對作物、 牲畜、人類和環境高度安全，被我國農業部推薦為無公害農藥，具有 非常廣闊的巿場前景和應用價值。阿維菌素和伊維菌素已在國內實現 了產業化，取得了巨大的經濟和社會效益。但我國阿維菌素的生產菌 株還存在著發酵單位低，生產成本高等問題。伊維菌素的生產還是以 化學還原法為主，先從阿維鏈霉菌發酵液中分離提取阿維菌素B1組 分，再利用價格昂貴的氯化銠作為催化劑將其還原為伊維菌素，存在 生產成本高，重金屬污染嚴重等問題，限制了伊維菌素的進一步推廣 和應用。通過利用組合生物合成手段對阿維菌素聚酮合酶基因簇進行 改造，獲得了直接發酵產生伊維菌素的工程菌株，但所得伊維菌素產 量很低，離工業化生產還有很大距離。如何提高阿維菌素和伊維菌素 的產量，降低生產成本，是一個很重要的課題。因此，通過基因工程手段改造阿維鏈霉菌以提高阿維菌素和伊維菌素的產量，具有重要的 意義和應用價值。
根據文獻報道的麥芽糖轉運系統基因的功能推測，在阿維鏈霉菌 中，麥芽糖、麥芽糊精等物質的吸收與利用都是通過麥芽糖轉運系統
(maltose transporter)完成的。負責跨膜運輸麥芽糖的麥芽糖轉運系 統屬于ABC家族的轉運器，是 一種依賴于ATP的跨膜轉運系統，由ATP 或核苷酸結合結構域和跨膜結構域構成，跨膜結構域為物質的運輸提 供通道，ATP結合結構域與細胞質相互作用為物質運輸提供能量。麥 芽糖系統負責有效地分解和利用a-(l-4)糖苷鍵的葡萄糖聚合物(如 麥芽三糖)，可多至7-8個葡萄糖單元。阿維菌素發酵條件優化的研究 表明，淀粉是阿維菌素發酵培養基的最佳碳源，而且工業生產中阿維 菌素的發酵培養基也主要以淀粉類物質為碳源。淀粉在發酵過程中， 先是在淀粉酶的作用下水解，然后主要將麥芽糖運輸到細胞內進行代 謝。菌體對這些物質的利用和吸收直接影響了抗生素的發酵產量和發 酵周期。
由于菌體對淀粉和麥芽糖的利用都是通過麥芽糖轉運系統完成 的，本發明嘗試在阿維鏈霉菌野生型菌株及其工程菌中過量表達麥芽 糖轉運系統基因來提高麥芽糖的利用效率，以提高阿維菌素和伊維菌 素的產量。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種提高阿維菌素和/或伊維菌素產量 的方法。
本發明的另 一 目的是提供高產阿維菌素和/或伊維菌素的基因工 程菌。
本發明的目的及解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。 本發明通過在阿維鏈霉菌野生型菌株及其工程菌中過量表達麥芽糖 轉運蛋白MalEFG來提高麥芽糖的利用效率，結果表明，過表達MalEFG能夠提高阿維菌素和/或伊維菌素的表達量。
從而，本發明首先提供m"壓F( 基因在提高菌種的阿維菌素和/或 伊維菌素表達量中的應用。
前述的應用，即通過在菌種中過表達麥芽糖轉運蛋白MalEFG, 以提高阿維菌素和/或伊維菌素表達量。這種菌種可以是任何能夠產 生阿維菌素和/或伊維菌素的鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌野生菌，或者 經基因工程改造后能夠產生阿維菌素和/或伊維菌素的菌種。
基于此，本發明提供一種過表達麥芽糖轉運蛋白MalEFG的產阿 維菌素和/或伊維菌素的基因工程菌。如前所述，其出發菌可以是任 何能夠產生阿維菌素和/或伊維菌素的鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌野生 菌，或者經基因工程改造后能夠產生阿維菌素和/或伊維菌素的菌種。
本發明還提供一種制備上述基因工程菌的方法，包括如下步驟 構建附fl/五FG基因的表達載體，并將該表達載體引入產阿維菌素和/或 伊維菌素的菌種中獲得MalEFG過表達的重組菌。
具體可通過如下方法構建基因工程菌用PCR擴增阿維鏈霉菌中 麥芽糖轉運蛋白MalEFG的基因m"店FG及其自身啟動子，構建 w"店FG基因的多拷貝或整合型表達載體，并將構建好的重組載體轉 化產阿維菌素和/或伊維菌素菌株，篩選獲得陽性重組菌。在本發明 實施例中，分別獲得了過表達MalEFG的阿維鏈霉菌野生菌、僅產阿 維菌素B組分的阿維鏈霉菌以及對阿維菌素聚酮合酶進行改造的產伊 維菌素的基因工程菌。
前述的方法，其中構建觸/五FG基因表達載體的出發載體可以是 任意一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體。優選多拷貝質粒載體如 pKC1139、 pKC505、 pIJ653、 pIJ8154，或整合型質粒載體如pSET152、 pIJ8600、 pIJ8660。
在本發明實施例中，以pKC1139為出發載體構建了wa/五FG基因 表達載體pME16;以及以pET152為出發載體構建了w"ffiF(7基因表達載體pME17。
前述的方法，其中所述將m"/五FG基因表達載體引入產阿維菌素 和/或伊維菌素的菌種中，可以釆用生物工程領域中常用的方法，例 如PEG介導的原生質體轉化法、電轉化法、接合轉移法等，優選PEG 介導的原生質體轉化法。
前述的方法，為提高轉化效率，可先將m"伍FG基因表達載體轉 化到限制修飾作用缺陷的大腸桿菌ET12567中，從中提取質粒再轉化 到產阿維菌素和/或伊維菌素的菌種中。
本發明提供一種提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的方法，其利 用過表達麥芽糖轉運蛋白MalEFG的產阿維菌素和/或伊維菌素的基 因工程菌來生產高阿維菌素和/或伊維菌素。
借由上述技術方案，本發明是將阿維鏈霉菌中編碼麥芽糖轉運蛋 白的/^壓FG基因通過表達載體引入阿維鏈霉菌中獲得麥芽糖轉運蛋 白過表達的重組菌，通過該重組菌過量表達麥芽糖轉運系統基因來提 高麥芽糖的利用效率，以提高阿維菌素和/或伊維菌素的產量，同時 可縮短發酵周期，從而降低生產成本。
圖lA為wa/五FG基因多拷貝表達載體pME16的質粒圖譜； 圖lB為ma壓FG基因整合型表達載體pME17的質粒圖譜； 圖2A顯示的是阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同轉
化子的阿維菌素(avermectin)發酵單位；
圖2B顯示的是阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同轉
化子的菌體干重；
圖2C顯示的是阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同轉
化子的發酵液還原糖濃度；
圖3顯示的是不同淀粉濃度發酵培養基中，阿維鏈霉菌野生型菌
株ATCC31267及其轉化子pME16/31267的阿維菌素發酵單位；圖4A顯示的是阿維鏈霉菌僅產阿維菌素B組分高產菌株GB165 及其不同轉化子的阿維菌素發酵單位；
圖4B顯示的是阿維鏈霉菌僅產阿維菌素B組分高產菌株GB165 及其不同轉化子的菌體干重；
圖5顯示的是產伊維菌素基因工程菌OI-31及其不同轉化子的伊 維菌素產量。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1 wm/E/^基因表達載體的構建
一、 阿維鏈霉菌w"/五FG基因的克隆
根據Genebank公布的阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267中 ma/五FG基因[NC—003155.4 (7195314..7198638)]的序列設計合成PCR
所需引物
Primer mal5: 5 '-AGATCTCGGATGATTCCCGCAACGAAA-3' Primer mal6: 5'-AATTCGAAGAACACGGAGACGGGTA -3'
引物兩端分別引入^g/n、 &oRi酶切位點(劃線部分)，以
ATCC31267基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件95 。C, 5min; (95°C, lmin; 58°C, lmin; 72°C, 4min) x25個循環； 72°C， 10min。將PCR產物電泳檢測，在3.6 kb處有特異性的擴增條 帶。
二、 ma/五FG表達載體的構建
電泳回收上述3.6 kb片段，經PCR產物純化試劑盒純化后，連 接于pMD18-T載體(TaKaRa公司)得質粒pME14。測序表明所擴 增的片段確實為m"化FG基因，且與所公布的序列一致。將質粒 pME14用Bg/II和&oRI進行酶切，得到3.6kb目的片段，電泳回收 該片段，經PCR產物純化試劑盒純化后，與經BamHI和￡coRI雙酶 切的載體pSET152 ( Bierman M, Logan R, O'Brien K，等.用于從大腸桿菌到鏈霉菌DNA接合轉移的質粒克隆載體.基因，1992， 116:43~49)相連接，得到整合型表達載體pME17。同時將上述所得 質粒pME14經Sgffl和五coRI酶切，電泳回收3.6kb目的片段，與經 5amHI和五coRI雙酶切的載體pKC1139 (參考文獻同pSET152)相 連接，得到多拷貝表達載體pME16。 pME16和pME17的質粒圖譜請 參閱圖1A和圖1B所示。 實施例2重組質粒的轉化
通過實施例1 一共構建了兩種ma/五FG基因的表達質粒載體，分 別為pME16和pME17,作為對照的原始質粒分別為pKC1139和 pSET152。
由于阿維鏈霉菌中存在很強的限制修飾作用，用提自co// DH5a的質粒直接轉化阿維鏈霉菌，轉化效率極低，有時甚至得不到 轉化子。而用來自沒有限制修飾作用的受體菌E // ET12567的質 粒，其轉化效率明顯提高。因此，將構建好的重組質粒以及對照質粒 先分別轉化到co// ET12567( Kieser T, Bibb M J, Buttner M J，等.實 用鏈霉菌遺傳手冊，2000, Norwich:約翰英納斯基金會)中以獲得非 甲基化的DNA，然后再用非甲基化的質粒DNA轉化阿維鏈霉菌的原 生質體。
本實施例選用了三種不同的阿維鏈霉菌菌株做出發菌株 ATCC31267、 GB-165和01-31。 ATCC31267是阿維鏈霉菌野生型菌 株，產灰色孢子；GB-165(蔡玉娟.產綠孢子阿維鏈霉菌遺傳改造和 發酵條件的研究.碩士學位論文，2006，北京中國農業大學)是經 誘變和基因工程手段得到的僅產阿維菌素B組分的阿維鏈霉菌菌株， 產綠色孢子；OI-31 (LiM,ChenZ，LinXP,等，提高阿維鏈霉菌中伊 維菌素產量的阿維菌素生物合成基因技術.生物有機與藥物化學快 報，2008， 18:5359-63)是利用組合生物合成技術對阿維菌素聚酮合酶 進行改造，所構建的產伊維菌素基因工程菌。制備這三種阿維鏈霉菌菌株的原生質體，用從E②/ZET12567中提取的質粒轉化原生質體， 涂于已吹干的不加抗生素的RM14平板上，28。C培養12-28 h后，在 平板上涂1 mL含1000-1500 安普霉素的水溶液，在28。C繼續培養 7-12天，長出的菌落即為轉化子。由于阿維鏈霉菌的轉化子在RM14 再生培養基上不產孢，故各挑取三個轉化子，接種于含10-15嗎/mL 安普霉素的YMS平板上，28。C培養7-10天恢復產孢。轉化子經質粒 提取及PCR驗證正確后，進行下一步的發酵研究。
本實施例中大腸桿菌的轉化、阿維鏈霉菌原生質體的制備及轉化 方法、RM14及YMS培養基的配制參見蔡玉娟的碩士論文(蔡玉娟. 產綠孢子阿維鏈霉菌遺傳改造和發酵條件的研究.碩士學位論文， 2006，北京中國農業大學)。
實施例3阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其轉化子的發酵研究
一、 阿維鏈霉菌的搖瓶發酵
種子培養基可溶性淀粉30 g,麥芽膏2g，大豆蛋白胨2g, CoCl2'6H20 5 mg，加蒸餾水至1 L，調pH至7.0-7.2。
發酵培養基可溶性淀粉50 g，酵母粉12 g, MgS04.7H20 0.5 g， K2HP04'3H20 0.5 g, KC14g; CaC03 2 g， CoCl2'6H20 5 mg,加蒸餾 水至1 L，調pH至7.0-7.2。
二、 發酵產物的HPLC分析
1. 樣品處理取1.0mL發酵液，加入4.0mL甲醇，浸泡30分 鐘以上，每隔IO分鐘振蕩一次，4000rpm離心IO分鐘，取上清液進
樣分析；
2. HPLC分析條件Cw反相柱，柱長150mm，柱內徑4.6mm， 柱溫4(TC,流動相為甲醇水(85:15)，流速1.0 mL/min,進樣體積10 )iL，波長為246 nm。
三、 菌體干重的測定
將50mi發酵液過濾，菌體以蒸餾水洗凈，烘干至恒重，稱菌體干重。
四、 ATCC31267及其不同轉化子的發酵結果 阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC31267及其轉化子在YMS培養基
上長出豐富的孢子后接種于種子培養基(裝量為100 mL/500 mL三角 瓶)中，28。C搖床培養24小時(轉速180rpm,偏心距2.5cm)。按 5%接種量接種于發酵培養基(裝量為50mL/300mL三角瓶)中，28 。C培養10天(轉速250rpm,偏心距2.5 cm),放瓶，用甲醇提取-HPLC 法測定阿維菌素的發酵單位，結果請參閱圖2A所示，將菌體烘干稱 取菌體干重，結果請參閱圖2B所示，用3，5-二硝基水楊酸法測定發 酵液中還原糖的含量，結果請參閱圖2C所示。
圖2A、圖2B和圖2C的發酵結果顯示，附"/五尸G過量表達的轉 化子與出發菌株相比，菌體干重都沒有明顯變化。對照質粒pKC1139 和pSET152的轉化對阿維菌素的產量影響不大，而含有ma/五FG表 達載體的ATCC31267轉化子的阿維菌素發酵單位與出發菌株相比均 明顯增加，含多拷貝表達載體的轉化子pME16/31267阿維菌素的產 量提高了 3.2倍，含整合型表達載體的轉化子pME17/31267阿維菌素 的產量提高了3倍。可見，多拷貝的m"伍FG基因對阿維菌素合成的 促進作用更加顯著。同時m^五FG過量表達的轉化子發酵液中還原糖 含量較出發菌株有明顯下降，其中轉化子pME16/31267發酵液中還 原糖的濃度降低了 28%,轉化子pME17/31267發酵液中還原糖的濃 度降低了 26%。
以上結果表明，m"ffiFG過表達菌株中阿維菌素產量的提高并不 是由于菌體生物量的提高導致的，而是由于m"/五尸G基因的過表達提 高了菌體對培養基中糖的利用能力，從而為阿維菌素的合成提供更多 的前體。
五、 ATCC31267及其轉化子pME16/31267在不同淀粉濃度的發 酵培養基中的發酵結果分別在淀粉濃度為70g/L、 90g/L、 110g/L、 130g/L的發酵培養 基中，對pME16/31267和出發菌株ATCC31267進行培養，每天取樣 測定發酵液中阿維菌素的產量，結果如圖3所示。轉化子與出發菌株 相比，在不同淀粉濃度下阿維菌素的產量均有所提高，發酵9天后， 在淀粉濃度為70 g/L和90 g/L的條件下阿維菌素產量提高了 70%， 110g/L條件下產量提高了 l倍，130g/L條件下產量提高了 90%。同 時發現，在110 g/L和130 g/L的高濃度淀粉條件下，轉化子中阿維 菌素的產生時間提前，于發酵第2天便產生阿維菌素，可縮短發酵周 期。
實施例4阿維鏈霉菌GB165及其轉化子的發酵研究
搖瓶發酵及HPLC分析方法同實施例1,不同之處在于所用的發 酵培養基為發酵培養基G:可溶性淀粉95g,花生蛋白粉25g，棉 籽蛋白7g,麥芽糖3g， MgS04-7H20 0.3 g， CoClr6H20 7.5 mg, (NH4)2SO40.1 g， CaC03lg， K2HP04'3H20 0.3 g， ZnS04.7H20 2 mg, 加蒸餾水至1 L,調pH至7.0-7.2。
從圖4A和圖4B的發酵結果可以看出，ma/五FG的過量表達對阿 維菌素高產菌株GB165的菌體干重也沒有影響。w"/五FG基因在 GB-165中的過量表達同樣可以促進阿維菌素的合成，轉化子 pME16/GB165中阿維菌素的產量提高了 60%， pME17/GB165中阿維 菌素的產量提高了 40%，但提高的幅度都沒有野生型菌株高。推測可 能由于GB165是經長期誘變得到的高產菌株，其基因組內發生了許 多突變，對麥芽糖的利用效率已經有所提高，因此額外的附"/五FG并 不能引起阿維菌素合成的大幅度提高。
實施例5產伊維菌素基因工程菌OI-31及其轉化子的發酵研究
搖瓶發酵及HPLC分析方法同實施例1，圖5的發酵結果表明， m"ffiFG過表達也可顯著促進工程菌中伊維菌素的合成，與出發菌株 相比，轉化子pME16/OI-31伊維菌素的產量提高了 3.3倍，轉化子pME17/OI-31伊維菌素的產量提高了 2.5倍。同樣是多拷貝的 基因對伊維菌素合成的促進作用優于低拷貝的m"/五FG基因。
實施例6工程菌株的穩定性考察
將所構建的m"伍F(7基因過表達的工程菌株分別在YMS斜面上 連續轉接五次，發現所得菌株與出發菌株在形態特征和培養特征上相 同，生長狀態良好，性狀穩定。經轉接五次后的各個工程菌株再進行 搖瓶發酵，HPLC檢驗阿維菌素或伊維菌素產量均未發生明顯變化，
說明所構建的工程菌是穩定的。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳 盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本 領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎 上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。頁
序列表
<110> 中國農業大學
<120〉提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的方法及生產菌株 <130> KHP09112773.0 <歸 2
<170> Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211> 27
<212〉 腿 <213〉人工序列
〈400〉 1
agatctcgga tgattcccgc aacgaaa 27
〈210〉 2
〈211> 25
〈212> 醒 〈213〉人工序列
<400> 2
aattcgaaga acacggagac gggta 2權利要求
1、malEFG基因在提高菌種的阿維菌素和/或伊維菌素表達量中的應用。
2、 如權利要求l所述的應用，其特征在于通過在菌種中過表達麥 芽糖轉運蛋白MalEFG，以提高阿維菌素和/或伊維菌素表達量。
3、 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述菌種為阿維 鏈霉菌。
4、 一種過表達麥芽糖轉運蛋白MalEFG的產阿維菌素和/或伊維 菌素的基因工程菌。
5、 如權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，其出發菌為阿 維鏈霉菌。
6、 一種制備權利要求4或5所述基因工程菌的方法，其包括如下 步驟構建ma/五FG基因的表達載體，并將該表達載體引入產阿維菌 素和/或伊維菌素的菌種中獲得MalEFG過表達的重組菌。
7、 如權利要求6所述的方法，其特征在于構建ma/EFG基因表達 載體的出發載體為任意一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體。
8、 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述穿梭載體為多 拷貝質粒載體pKC1139、 pKC505、 pIJ653、 pIJ8154，或整合型質粒載 體pSET152、 pIJ8600、 pIJ8660。
9、 一種提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的方法，其利用權利要 求4或5所述的基因工程菌來生產阿維菌素和/或伊維菌素。
全文摘要
本發明提供了一種提高阿維菌素和/或伊維菌素產量的方法及生產菌株，其是將阿維鏈霉菌中編碼麥芽糖轉運蛋白的malEFG基因通過表達載體引入阿維鏈霉菌中獲得麥芽糖轉運蛋白過表達的重組菌，通過該重組菌過量表達麥芽糖轉運系統基因來提高麥芽糖的利用效率，以提高阿維菌素和/或伊維菌素的產量。本發明的基因工程菌可直接用于阿維菌素和/或伊維菌素的發酵生產，提高阿維菌素和/或伊維菌素的發酵單位，降低生產成本。
文檔編號C12N15/74GK101613712SQ200910089970
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月30日 優先權日2009年7月30日
發明者淵 宋, 瑩 文, 萌 李, 李季倫, 芝 陳 申請人:中國農業大學